劉柏林

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藤黃酸抑制人食管癌ECA-109細(xì)胞增殖及MMP2分泌

劉柏林

目的 探討藤黃酸（gambogic acid）對人食道癌ECA-109細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。方法 用MTT法檢測不同濃度的藤黃酸對ECA-109細(xì)胞增殖的抑制的作用；用ELISA實(shí)驗(yàn)檢測金屬蛋白酶MMP2蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果 藤黃酸能明顯抑制ECA-109細(xì)胞的增殖，IC50值為140.18 mg/L。藤黃酸能抑制ECA-109 細(xì)胞分泌MMP2蛋白。結(jié)論 藤黃酸對于ECA-109細(xì)胞可以抑制其增殖，并能抑制其分泌MMP-2蛋白的功能。

食道癌；ECA-109；藤黃酸

食道癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，病理上以食管鱗狀細(xì)胞癌為主。食道癌患者早期癥狀不明顯，很多患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)是中晚期，手術(shù)效果差，5年生存率10%左右［1］。為了提高生存率，需要發(fā)現(xiàn)新的化療藥物，近年來研究發(fā)現(xiàn)，藤黃酸抑制淋巴瘤、結(jié)腸癌、胃癌等細(xì)胞生長，具有良好的抗癌活性［2-4］。因而，我們采用體外實(shí)驗(yàn)，研究藤黃酸對人食道癌細(xì)胞ECA-109生長的抑制作用，為藤黃酸用于食道癌的治療提供一定的研究數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器

藤黃酸購自Sigma-Aldrich公司，從美國ATCC公司購得人食道癌細(xì)胞系ECA-109，MTT購于Serva公司，胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)液購自美國Gibico公司，MODE1680酶聯(lián)免疫分析儀為Bio-RAD公司產(chǎn)品，MMP2 ELISA試劑盒購自德國IBL公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1MTT法 細(xì)胞重懸，并接種于96孔板，每孔細(xì)胞總量為100 μl，將其密度調(diào)整為2×104至4×104個(gè)細(xì)胞/孔，常規(guī)設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，37℃，培養(yǎng)24 h后，不同濃度的藤黃酸被添加入相應(yīng)的孔中，將等量培養(yǎng)基加入空白對照組中。常規(guī)培養(yǎng)48 h后，每孔加入MTT （10 mg/Ml） 20 μl，溫箱中常規(guī)培養(yǎng)，4 h后吸棄上清液，然后每孔添加DMSO 150 μl/孔，震蕩、混勻，在酶標(biāo)儀上檢測490 nm波長處的光密度（OD）值，計(jì)算抑制率和IC50。

2　結(jié)果

2.1藤黃酸抑制ECA-109 細(xì)胞的增殖

48 h后，藤黃酸12.5、25、50、100、200、400 mg/L 作用于ECA-109細(xì)胞，48 h抑制率分別為（4.21±0.24）%、（6.32±0.47）%、（10.03±0.42）%、（36.54±0.47）%、（71.42±1.22）%、（82.75±2.01）%，分別與空白對照組［抑制率為（0.00±0.00）］相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05，IC50值為140.18 mg/L。

2.2藤黃酸抑制MMP2的分泌

根據(jù)IC50值選用不同濃度藤黃酸（70 mg/L，140 mg/L和280 mg/L）進(jìn)行ELISA檢測，測得MMP2值分別為（7.13±0.87）μg/L、（4.27±0.74）μg/L、（2.89±0.53）μg/L，明顯低于空白組細(xì)胞組（9.76±1.12）μg/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3　討論

藤黃酸是中藥藤黃的活性成分，具有抗癌活性，它通過多種機(jī)制抑制腫瘤細(xì)胞增殖。梁小慶等研究發(fā)現(xiàn)藤黃酸可以通過調(diào)節(jié)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶mRNA表達(dá)，進(jìn)而抑制MCF-7 細(xì)胞端粒酶活性（端粒酶的激活有利于細(xì)胞的永生化），抑制細(xì)胞增殖［5］。王勇［6］等研究發(fā)現(xiàn)，藤黃酸可以通過NF-κB信號通路，調(diào)節(jié)Cyclin D3和Cyclin E的表達(dá)，擾亂細(xì)胞周期，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。藤黃酸可通過下調(diào)核孔蛋白Nup88表達(dá)量，誘導(dǎo)U937白血病細(xì)胞的凋亡［7］。我們研究表明，實(shí)驗(yàn)組（70 mg/L，140 mg/L和280 mg/L藤黃酸）細(xì)胞抑制率，明顯高于空白對照組細(xì)胞，提示藤黃酸能夠抑制ECA-109細(xì)胞增殖，這和其他學(xué)者相類似［2-3，5-7］。研究表明金屬蛋白酶MMP2能降解細(xì)胞外基質(zhì)，在腫瘤中高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移［8］。我們研究表明實(shí)驗(yàn)組（70 mg/L，140 mg/L和280 mg/ L藤黃酸）細(xì)胞MMP2分泌量，明顯低于空白組細(xì)胞的分泌量，提示藤黃酸能夠抑制ECA-109細(xì)胞分泌MMP2。MMP2能降解細(xì)胞外基質(zhì)，對腫瘤細(xì)胞侵襲力有促進(jìn)作用，當(dāng)MMP2分泌下降時(shí)，ECA-109細(xì)胞遷移，侵襲力必然降低。根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推斷出，藤黃酸可能抑 制食管癌細(xì)胞的侵襲和遷移。

總之，藤黃酸能夠抑制ECA-109細(xì)胞的增殖，并減少M(fèi)MP2的分泌，提示其具有抗食道癌的潛能，其具體作用機(jī)制，還需進(jìn)一步研究。

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［2］師憲平，藍(lán)曉瑩，陳鑫，等.藤黃酸對彌漫性大B淋巴瘤細(xì)胞株OCI-LY-1增殖和凋亡的影響及其分子學(xué)機(jī)制［J］.中國病理生理雜志，2013，29（5）:815-820.

［3］黃愷飛，陸云華，何睿，等.藤黃酸對胃癌BGC-803細(xì)胞凋亡的作用及對survivin基因表達(dá)的影響［J］.中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，39（5）:474-478.

［4］徐勇，歐陽建，張啟國，等.藤黃酸通過MAPK通路誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的機(jī)理［J］.中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2012，20（3）:587-591.

［5］梁小慶，俞軍.藤黃酸對乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞端粒酶活性及其逆轉(zhuǎn)錄酶 hTERT mRNA 表達(dá)的抑制作用研究［J］.實(shí)用老年醫(yī)學(xué)，2012，26（6）:483-486.

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［7］舒文秀，陳燕，何靜，等.藤黃酸對急性白血病細(xì)胞U937增殖和凋亡的影響及對核孔蛋白Nup88的調(diào)控作用［J］.中草藥，2008，39（1）:74-78.

［8］屈洪濤，楊伊林，王穗暖，等.MMP-2-PEX與MMP-2在侵襲性垂體腺瘤中的表達(dá)及意義［J］.中華神經(jīng)外科疾病研究雜志，2013，12（1）:29-32.

Gambogic Acid Inhibits Proliferation and MMP2 Secretion of Human Esophageal Cancer Cell Line ECA-109

LIU Bolin Department of Laboratory and Pharmacy，Jiangsu Vocational College of Nursing，Huaian Jiangsu 223300，China

Objective It is to research the effect of gambogic acid （GA）on the biological behavior of human esophageal squamous cell carcinoma in ECA-109 cells.Methods The effects of gambogic acid on proliferation of ECA-109 cell was detected by MTT assay.ELISA assay was used to detected the level of MMP2.Results Gambogic acid can significantly inhibit the proliferation of ECA-109，IC50 is 140.18 mg/L.Gambogic acid aslo can inhibit the ECA-109 from secreting MMP2 protein.Conclusion As for ECA-109，gambogic acid can inhibit its proliferation as well as inhibit it from secreting MMP2 protein

Esophageal squamous cell carcinoma，ECA-109，Gambogic acid

R735

A

1674-9308（2016）21-0130-02

10.3969/j.issn.1674-9308.2016.21.077

江蘇護(hù)理職業(yè)學(xué)院檢驗(yàn)藥學(xué)系，江蘇 淮安 223300

1.2.2ELISA法 將對數(shù)生長期細(xì)胞，消化，重懸，并將其接種在6孔板內(nèi)，每組常規(guī)設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，24 h常規(guī)培養(yǎng)，將不同濃度藤黃酸（70 mg/L，140 mg/L和280 mg/L）添加入實(shí)驗(yàn)組，同體積培養(yǎng)基加入空白對照組孔中，37℃，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞上清液，保存在-80°C冰箱內(nèi)，上酶標(biāo)儀檢測時(shí)取出。在MODE1680酶聯(lián)免疫分析儀上，于450 nm波長處檢測各孔A（吸光度）。

1.3觀察指標(biāo)

主要觀察以下指標(biāo)：（1）藤黃酸作用ECA-109細(xì)胞抑制率，腫瘤細(xì)胞生長抑制率=［1-（實(shí)驗(yàn)組OD值組/空白對照組OD值］×100%。（2）藤黃酸作用于食道癌細(xì)胞IC50值（ECA-109細(xì)胞增殖受抑制一半時(shí)藤黃酸的濃度）。（3）各濃度組藤黃酸作用于食道癌細(xì)胞MMP2值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件對本研究的所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。