程曉亮 朱寅榮 于南南 戴麗芬 曹立君

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2型糖尿病伴或不伴胃腸神經(jīng)功能紊亂患者腸道雙歧桿菌的差異

程曉亮 朱寅榮 于南南 戴麗芬 曹立君

【摘要】目的 研究2型糖尿病伴或不伴胃腸神經(jīng)功能紊亂患者腸道雙歧桿菌是否存在差異。方法 選取30例2型糖尿病不伴胃腸神經(jīng)功能紊亂（對(duì)照組）患者及30例2型糖尿病伴胃腸神經(jīng)功能紊亂（實(shí)驗(yàn)組）患者，收集糞便樣品，提取樣品中細(xì)菌DNA，根據(jù)雙歧桿菌總菌的16SrRNA序列設(shè)計(jì)特異性引物，并應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)60例糞便樣品中的雙歧桿菌總菌進(jìn)行定量檢測(cè)。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組腸道雙歧桿菌總菌較對(duì)照組減少（P＜0.05）。結(jié)論 2型糖尿病伴胃腸神經(jīng)功能紊亂患者腸道雙歧桿菌總菌數(shù)量減少，可能與2型糖尿病患者胃腸神經(jīng)功能紊亂的發(fā)生發(fā)展存在相關(guān)性。

【關(guān)鍵詞】2型糖尿病；胃腸功能紊亂；雙歧桿菌

2型糖尿病是由環(huán)境及遺傳等多種復(fù)合病因引起的綜合征，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明［1-3］。目前對(duì)于2型糖尿病伴或不伴胃腸神經(jīng)功能紊亂患者腸道雙歧桿菌差異尚無研究，本研究以實(shí)時(shí)熒光PCR定量技術(shù)測(cè)定2型糖尿病伴或不伴胃腸神經(jīng)功能紊亂患者腸道雙歧桿菌總菌數(shù)量的變化，為研究糖尿病胃腸神經(jīng)功能紊亂與腸道菌群的關(guān)系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象及標(biāo)本采集

選取2014年3～9月在昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科住院，年齡50～70歲的患者作為研究對(duì)象，納入2型糖尿病不伴胃腸神經(jīng)功能紊亂的患者30例為對(duì)照組，男20例，女10例，平均年齡（61.23±9.04）歲；30例2型糖尿病伴胃腸神經(jīng)功能紊亂患者為實(shí)驗(yàn)組，男20例，女10例，平均年齡（62.50±8.15）歲。兩組研究對(duì)象一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采集60名患者的糞便樣品。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（TIANampBacterria DNA Kit）、PBS液（0.01 mol/L，pH 7.4）、質(zhì)粒提取試劑盒（TIANGEN 100次質(zhì)粒小提）、瓊脂糖、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，SYBR Green熒光染料、dNTP、TaqDNA聚合酶、DNA分子標(biāo)準(zhǔn)Marker、T載體試劑盒（TAKARA pMD19T simple），均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，實(shí)驗(yàn)所用引物、GlodViewⅠ染料購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司，PCR儀（ABI，USA）、凝膠成像系統(tǒng)、熒光定量PCR儀BIORAD CFX96。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

取濕重糞便樣品1 g加10 ml滅菌PBS（0.01 mol/L，pH 7.4），充分振蕩混勻10 min，隨之低速離心（3 000 r/min）5 min，留取上清，上述過程重復(fù)3次。將所收集到的上清液高速離心（12 000 r/min）10 min，然后棄上清，收集沉淀，并用10 ml PBS懸浮，12 000 r/min離心5 min，沉淀重復(fù)洗滌3次，所得菌體用1 ml無菌水懸浮混勻，裝至1.5 ml EP管中，并以12 000 r/min 離心5 min。得到的菌體沉淀保存于-20℃。使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，并嚴(yán)格按照說明書步驟進(jìn)行提取。選用的引所物序列如下：雙歧桿菌總菌：上游：AGAACCTTACCTGGGCTTGA；下游：CCTTCCTCCGAGTTGACCC，片段大小208 bp。以2型糖尿病不伴胃腸神經(jīng)功能紊亂患者糞便樣本提取的細(xì)菌基因組DNA為模板進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)，制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，通過實(shí)時(shí)熒光定量得出雙歧桿菌總菌的拷貝數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS17.0軟件處理，雙歧桿菌總菌計(jì)量資料結(jié)果均經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組組間差異用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

對(duì)照組雙歧桿菌總菌數(shù)量為（9.11±0.62）log10 copies/g，實(shí)驗(yàn)組雙歧桿菌總菌數(shù)量為（8.35±0.69）log10 copies/g。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組腸道雙歧桿菌數(shù)量減少，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

人體腸道中生存著大約1 800個(gè)屬，至少40 000種細(xì)菌，其數(shù)量多達(dá)1 014個(gè)。隨著科技的發(fā)展，被人類所識(shí)別的菌種已超過1 250個(gè)［4］。近年來，越來越多的學(xué)者認(rèn)為腸道菌群是控制體質(zhì)和能量代謝的一個(gè)重要因素，并且與肥胖、2型糖尿病等代謝性疾病密切相關(guān)［5］。雙歧桿菌作為人體腸道菌群中的優(yōu)勢(shì)菌屬，對(duì)維持腸道菌群與宿主之間相互作用的穩(wěn)定發(fā)揮著重要的作用，其數(shù)量的改變，可影響整個(gè)腸道菌群及腸道微生態(tài)平衡，從而影響宿主的健康狀態(tài)。有研究表明，2型糖尿病患者存在腸道菌群的失調(diào)，表現(xiàn)為腸桿菌科細(xì)菌含量增加，類桿菌含量減少等［6］。

在本實(shí)驗(yàn)中，通過PCR進(jìn)行雙歧桿菌總菌絕對(duì)定量，結(jié)果顯示，2型糖尿病伴胃腸神經(jīng)功能紊亂患者腸道雙歧桿菌總數(shù)較2型糖尿病不伴胃腸神經(jīng)功能紊亂患者明顯減少。由此可以推測(cè)糖尿病胃腸神經(jīng)與雙歧桿菌數(shù)量改變之間可能存在相關(guān)性，這也許為腸道菌群改變與糖尿病性胃腸神經(jīng)功能紊亂間相互作用提供了一些依據(jù)?？赡艿臋C(jī)制：（1）腸道菌群發(fā)生紊亂后引起腸道屏障功能破壞、滲透壓改變、腸菌代謝物改變、信號(hào)傳導(dǎo)遞質(zhì)改變，導(dǎo)致腸道神經(jīng)元及微血管對(duì)高糖刺激敏感性改變，影響了正常的消化道功能。（2）腦-腸-微生物作用［7］。腸道菌群不僅能夠直接影響植物傳入神經(jīng)影響消化道功能，也能通過其產(chǎn)物作用于腸上皮細(xì)胞相應(yīng)受體，產(chǎn)生信號(hào)分子，或是通過對(duì)一些機(jī)體所不能利用的酶，對(duì)免疫因子的賦活作用，來改變腸道運(yùn)動(dòng)及滲透壓，調(diào)節(jié)免疫功能，影響腸激素如GLP1、GLP2、PYY的分泌［8］，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)與腸道的交互作用中扮演著信號(hào)傳遞者的角色。

本研究對(duì)2型糖尿病伴胃腸神經(jīng)病變患者與2型糖尿病不伴胃腸神經(jīng)病變患者之間腸道雙歧桿菌的差異進(jìn)行了初步的探討，為進(jìn)一步研究腸道菌群與2型糖尿病胃腸神經(jīng)病變之間的關(guān)系提供重要線索，并為其治療靶點(diǎn)提供一些有價(jià)值的資料。

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【中圖分類號(hào)】R587

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1674-9308（2016）15-0068-02

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2016.15.043

基金項(xiàng)目：云南省教育廳項(xiàng)目（2013Y294）

作者單位：昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，云南 昆明 650101

Differences Between the Intestinal Bifidobacteria for the Type 2 Diabetes Patients With or Without Gastrointestinal Dysfunction

CHENG Xiaoliang ZHU Yinrong YU Nannan DAI Lifen CAO Lijun
Department of Endocrinology， The Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University， Kunming Yunnan 650101， China

［Abstract］Objective To distinguish the differences between the intestinal bifidobacteria for the type 2 diabetes patients with or without gastrointestinal dysfunction. Methods Select 30 cases of type 2 diabetes patients without gastrointestinal dysfunction （control group） and 30 cases with gastrointestinal dysfunction （experimental group）. Extract the bacterial DNA of the fecal samples， and design the specific primer of bifidobacteria according to the bacterial 16SrRNA sequence. Apply the real-time PCR technology to detect quantitatively the total bacteria of bifidobacteria， which is taken from two different group of samples. Results The total number of bifidobacteria for the experimental group is less than the control group significantly （P＜0.05）. Conclusion The total number of bifidobacteria for the type 2 diabetes patients with gastrointestinal dysfunction decreased，and reducing the number of intestinal bifidobacterium may interact with thedevelopment of gastrointestinal disorders in patients with type 2 diabetes.

［Key words］Type 2 diabetes， Gastrointestinal disorders， Bifidobacteria