唐 敏，嚴(yán)建業(yè)，2，趙小芳，徐 博，王學(xué)生，李順祥，2＊＊

（1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 長(zhǎng)沙 410208；2. 湖南省中藥活性物質(zhì)篩選工程技術(shù)研究中心長(zhǎng)沙 410208；3.山東一笑堂阿膠集團(tuán)百年制藥有限公司 新蔡 463500）

UPLC-ESI-QTOF-MS檢測(cè)巴西龜龜甲膠中牛皮特征肽的研究＊

唐 敏1，嚴(yán)建業(yè)1，2，趙小芳1，徐 博1，王學(xué)生3，李順祥1，2＊＊

（1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 長(zhǎng)沙 410208；2. 湖南省中藥活性物質(zhì)篩選工程技術(shù)研究中心長(zhǎng)沙 410208；3.山東一笑堂阿膠集團(tuán)百年制藥有限公司 新蔡 463500）

目的：以巴西龜為來源的龜甲膠中牛皮特征肽成分的檢測(cè)。方法：采用胰蛋白酶進(jìn)行酶解，利用超高效液相色譜-電噴霧四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法分別對(duì)以巴西龜為來源的龜甲膠和以中華草龜為來源的龜甲膠進(jìn)行測(cè)定，選定牛皮特征肽離子m/z 604.8、m/z 641.3、m/z 790.8作為檢測(cè)對(duì)象。結(jié)果：巴西龜來源的龜甲膠中只檢測(cè)出牛皮特征肽離子m/z 641.3信號(hào)，其MS/MS裂解規(guī)律與黃明膠標(biāo)準(zhǔn)品酶解產(chǎn)物所含牛皮特征肽GEAGPSGPAGPTGAR一致，而中華草龜來源的龜甲膠中均未檢測(cè)出牛皮特征肽信號(hào)。結(jié)論：該方法專屬性強(qiáng)，靈敏度高，可區(qū)別巴西龜龜甲膠和摻雜牛皮成分的龜甲膠，可用于龜甲膠的質(zhì)量控制。

超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜 牛皮特征肽 巴西龜龜甲 龜甲膠

龜甲膠是龜科動(dòng)物烏龜?shù)谋臣准案辜捉?jīng)水煎煮、濃縮制成的固體膠，歷版《中國藥典》均有收載，是中國名貴中藥[1]，其味甘、咸，性平，歸肝、腎經(jīng)，可滋陰，補(bǔ)血，主治陰虛潮熱、骨蒸盜汗、腰膝酸軟、血虛萎黃等癥。中華草龜龜甲入藥在中國已有數(shù)千年歷史，近年來由于其價(jià)格昂貴，草龜被過度捕殺，造成其資源面臨嚴(yán)重匱乏。一些廠家為了節(jié)省成本，利用其它動(dòng)物甲殼和皮革為原料來生產(chǎn)龜甲膠，其中包括以巴西龜龜殼和摻雜牛皮為原料的情況。巴西龜（Trachemys scripta elegans）又名紅耳龜[2]，原產(chǎn)于美洲，因其適應(yīng)性強(qiáng)、食性廣且生長(zhǎng)繁殖迅速、大量掠奪同類物種的生存資源，而被列為世界上最危險(xiǎn)的入侵物種之一[3]。巴西龜對(duì)生態(tài)具有一定的破壞性，但資源極其豐富，價(jià)格也相對(duì)低廉。在中國，巴西龜于20世紀(jì)80年代經(jīng)香港被引入內(nèi)陸[4]，其養(yǎng)殖遍及中國中南部的所有省區(qū)，相關(guān)貿(mào)易則遍布全國所有省份[5]。根據(jù)市場(chǎng)調(diào)查統(tǒng)計(jì)結(jié)果[6]，巴西龜龜甲的市場(chǎng)占有率高達(dá)38%，僅次于中華草龜。實(shí)際檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，巴西龜龜甲膠與中華草龜龜甲膠酶解產(chǎn)物中龜甲特征肽的含量相差不大。同時(shí)，也有報(bào)道顯示巴西龜龜甲膠同樣具有較好的滋陰作用[7，8]，有學(xué)者推測(cè)巴西龜有可能部分替代藥典草龜成為制備龜甲膠的原料。

膠類藥材是指由動(dòng)物的皮革、骨骼等加工而成的膠原蛋白水解肽[9]。根據(jù)不同動(dòng)物的同類型膠原蛋白的氨基酸序列存在差異[10]，其胰蛋白酶水解產(chǎn)物所含肽段之間即存在差異性。近年來，利用LC-MS技術(shù)對(duì)不同膠類酶解產(chǎn)物的特征肽段進(jìn)行分析的方法日趨成熟[11，12]，而被廣泛用于膠類制劑的檢測(cè)。以牛皮為原料熬制的膠類稱之為黃明膠，據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[13-15]，黃明膠經(jīng)過胰蛋白酶水解后產(chǎn)生的多肽離子中，m/z 604.8、m/z 641.3、m/z 790.8具有特征性。2015版《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了采用HPLC-MS對(duì)龜甲特征肽進(jìn)行定性檢測(cè)，但未對(duì)其他摻雜膠類予以說明。國家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）已出臺(tái)的補(bǔ)充檢測(cè)方法批件（批件號(hào)：2014013）對(duì)龜甲膠中是否摻雜牛皮成分有所要求，該方法采用HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)龜甲膠樣品酶解產(chǎn)物中的牛皮特征肽離子m/z 641.3進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。但是，在實(shí)際檢測(cè)工作中發(fā)現(xiàn)，以巴西龜為原料的龜甲膠樣品中可檢測(cè)出牛皮特征肽離子m/z 641.3的信號(hào)[16]。鑒于巴西龜龜甲膠酶解產(chǎn)物和摻雜黃明膠的龜甲膠酶解產(chǎn)物中均可檢測(cè)出牛皮特征肽離子m/z 641.3的信號(hào)，現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)不能很好區(qū)別以上兩者。因此，為了區(qū)別巴西龜龜甲膠和摻雜牛皮成分的龜甲膠，對(duì)除m/z 641.3以外的其他牛皮特征肽離子進(jìn)行檢測(cè)顯得尤為必要。

1 儀器與試藥

Waters Acquity超高效液相系統(tǒng)（美國Waters公司）；Waters-Xevo-G2-QTOF質(zhì)譜系統(tǒng)（美國Waters公司）；ACQUITY UPLC-BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm，美國Waters公司）。Mettler MS205DU型電子分析天平（瑞士Mettler公司）；KQ 5200型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；ELGA PURELAB OPTION-R 7超純水儀（英國ELGA公司）。

亮氨酸腦啡肽（美國Waters公司，批號(hào)：700008842-1）；甲 酸（德 國CNW公 司，批 號(hào)：N030K060）、乙腈（色譜純，德國Merck公司，批號(hào)：1746030430）；序列分析級(jí)胰蛋白酶（美國Promega公司，批號(hào)：00001714876）；NH4HCO3（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20150119）；龜甲膠對(duì)照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：121693-201301）；黃明膠對(duì)照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：121695-201301）。

本實(shí)驗(yàn)所用龜甲膠樣品均為實(shí)驗(yàn)室按照相關(guān)膠類藥材的生產(chǎn)工藝自行制得，樣品共計(jì)4份，其原料分別是干巴西龜龜殼、活巴西龜龜殼、干草龜龜殼、活草龜龜殼。

表1 不同原料龜甲膠供試品牛皮特征肽成分的檢測(cè)結(jié)果

2 方法與結(jié)果

2.1 液相條件

流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液，B：乙腈，梯度洗脫（0-25 min，5% B→20% B；25-40 min，20%B→50%B；40-41 min，50%B→ 99% B；41-42 min，99% B；42-43 min，99%B→5%B；43-45 min，5%B）；流速為0.3 mL·min-1；柱溫為40℃；進(jìn)樣量為1 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

離子化模式為ESI+，毛細(xì)管電壓為3 kV，錐孔電壓為40 V，除溶劑溫度為450℃，除溶劑氣體為600 L·h-1。離子源溫度為120℃。采用MSE和MS/ MS方式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，采集時(shí)間為45 min，掃描范圍為100-1 500 amu，掃描時(shí)間為0.2 s。錐孔電壓40 V。碰撞能量：MSE方式低能量為4 V，梯度高能量為20-30 V；MS/MS方式碰撞能量為25 V。碰撞氣體為高純氬氣。

2.3 供試品溶液制備

在選擇酶解時(shí)間方面，本研究考察的酶解時(shí)間為12、16、18 h，因各組試驗(yàn)結(jié)果差異不大，故最終選定酶解時(shí)間為12 h。

分別稱取原料為干巴西龜龜甲、活巴西龜龜甲、干草龜龜甲、活草龜龜甲的龜甲膠樣品各0.1 g，分別置于50 mL量瓶中，加1% NH4HCO3溶液超聲溶解并稀釋至刻度，過0.22 μm的微孔濾膜，取連續(xù)濾液100 μL，加胰蛋白酶溶液（取序列分析純胰蛋白酶適量，加1%NH4HCO3溶液溶解，制成每1 μL中含1 μg胰蛋白酶的溶液）10 μL，搖勻，37℃恒溫酶解12 h，制得供試品溶液1、2、3、4。

2.4 對(duì)照品溶液制備

分別稱取龜甲膠標(biāo)準(zhǔn)品和黃明膠標(biāo)準(zhǔn)品各0.1 g，分別置于50 mL量瓶中加1% NH4HCO3溶液超聲溶解并稀釋至刻度，過0.22 μm的微孔濾膜，取連續(xù)濾液100 μL，加胰蛋白酶溶液（取序列分析純胰蛋白酶適量，加1% NH4HCO3溶液溶解，制成每1 μL中含1 μg胰蛋白酶的溶液）10 μL，搖勻，37℃恒溫酶解12 h，制得對(duì)照品溶液5、6。

2.5 牛皮元特征峰的確認(rèn)

黃明膠標(biāo)準(zhǔn)品酶解溶液中可檢測(cè)出牛皮特征肽離子m/z 604.8、m/z 641.3、m/z 790.8，巴西龜龜甲膠樣品酶解溶液中可檢測(cè)到牛皮特征肽離子m/z 641.3，檢測(cè)結(jié)果見表1，質(zhì)譜提取離子峰見圖1。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，中華草龜龜甲膠樣品酶解溶液中未檢測(cè)到牛皮特征肽離子。并對(duì)巴西龜龜甲膠酶解溶液中檢測(cè)到的牛皮特征肽離子m/z 641.3進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，得出其MS/MS裂解規(guī)律與黃明膠標(biāo)準(zhǔn)品酶解產(chǎn)物所含牛皮特征肽GEAGPSGPAGPTGAR完全一致[17]，相關(guān)質(zhì)譜裂解數(shù)據(jù)見圖2。

2.6 精密度考察

取干巴西龜龜甲膠制得的供試品溶液，以m/z 604.8和m/z 790. 8共2個(gè)牛皮特征肽提取離子峰作為檢測(cè)檢測(cè)對(duì)象，連續(xù)測(cè)定6次，結(jié)果的RSD分別為1.37%和1.95%（n=6），表明本方法精密度良好。

圖1 巴西龜龜甲膠、黃明膠牛皮特征肽提取離子峰

2.7 穩(wěn)定性考察

取干巴西龜龜甲膠制得的供試品溶液，以m/z 790.8和m/z 604.8共2個(gè)牛皮特征肽提取離子峰作為檢測(cè)對(duì)象，分別于0、2、4、6、8、10 h測(cè)定，結(jié)果2個(gè)特征峰均可被檢出，平均保留時(shí)間分別為5.17 min和13.10 min，RSD為1.35%和1.40%，說明供試品溶液在10 h內(nèi)均可滿足穩(wěn)定性需要。

圖2 巴西龜龜甲膠和黃明膠標(biāo)準(zhǔn)品酶解產(chǎn)物m/z 641.3 MS/MS裂解質(zhì)譜圖

3 討論

《中國藥典》收錄的龜甲膠來源為中華草龜，但因其資源面臨枯竭，勢(shì)必需要尋找其它代用品。巴西龜生命力頑強(qiáng)而又極易飼養(yǎng)，推測(cè)其有可能部分替代藥典草龜成為生產(chǎn)龜甲膠的原料。現(xiàn)行的龜甲膠檢測(cè)補(bǔ)充批件規(guī)定，原材料是否摻雜牛皮的檢測(cè)指標(biāo)為牛皮特征肽離子m/z 641.3。根據(jù)本研究對(duì)巴西龜龜甲膠酶解樣品中檢測(cè)到的m/z 641.3離子進(jìn)行了二級(jí)質(zhì)譜裂解分析，其裂解規(guī)律與黃明膠標(biāo)準(zhǔn)品酶解產(chǎn)物所含牛皮特征肽（GEAGPSGPAGPTGAR）一致[17]，故巴西龜龜甲膠酶解產(chǎn)物中也可檢測(cè)出該特征肽信號(hào)。如果巴西龜可作為中華草龜?shù)奶娲穪碇苽潺敿啄z，那么現(xiàn)行的檢測(cè)方法就不能很好區(qū)別巴西龜龜甲膠和摻雜黃明膠的龜甲膠。根據(jù)本課題組的檢測(cè)結(jié)果，黃明膠酶解產(chǎn)物中已發(fā)現(xiàn)的另外兩個(gè)牛皮特征肽離子m/z 604.8和m/z 790.8，在巴西龜龜甲膠酶解產(chǎn)物檢測(cè)不到。因此，本研究建議利用m/z 604.8和m/z 790.8兩個(gè)特征肽離子為檢測(cè)指標(biāo)，該方法可以很好地區(qū)別巴西龜龜甲膠和摻雜黃明膠的龜甲膠。

參考文獻(xiàn)

1 國家藥典委員會(huì). 中華人民共和國藥典(一部). 北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:181.

2 劉丹,史海濤,劉宇翔,等. 紅耳龜在我國分布現(xiàn)狀的調(diào)查. 生物學(xué)通報(bào), 2011, 46(6): 18-21.

3 Lowe S M, Browne M, Boudjelas S, et al. 100 of the World's Worst Invasive Alien Species: A Selection From the Global Invasive Species Database, 2000,12.

4 史海濤,龔世平,梁偉,等. 控制外來物種紅耳龜在中國野生環(huán)境蔓延的態(tài)勢(shì). 生物學(xué)通報(bào), 2009, 44(4):1-3.

5 Shi Haitao, James F. Parham, Fan Zhiyong, et al. Evidence for the massive scale of turtle farming in China. Oryx, 2008, 42(1):147-150.

6 蘭志瓊,盧先明,蔣桂華, 等. 我國四大藥材專業(yè)市場(chǎng)龜甲藥材的初步調(diào)查. 成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 35(1):34-36.

7 顧迎寒,盧先明,蔣桂華,等. 不同品種龜甲滋陰作用的對(duì)比研究.時(shí)珍國醫(yī)國藥, 2007, 18(6):1417-1418.

8 陳前進(jìn),余東方,馮淡開. 龜甲現(xiàn)代研究概況. 海峽藥學(xué), 2009, 21(6):105-106.

9 Karim A A, Bhat R. Fish gelatin: properties, challenges, and prospects as an alternative to mammalian gelatins. Food Hydrocolloids, 2009, 23(3):563-576.

10 Nemati M, Oveisi M R, Abdollahi H, et al. Differentiation of bovine and porcine gelatins using principal component analysis. J Pharma Biom Anal, 2004, 34(3):485-492.

11 劉榮霞,果德安,葉敏,等. 液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC/MS)在中藥現(xiàn)代研究中的應(yīng)用. 世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2005,7(5):33-40.

12 Yilmaz M T, Kesmen Z, Baykal B, et al. A novel method to differentiate bovine and porcine gelatins in food products: NanoUPLC-ESI-Q-TOFMS E, based data independent acquisition technique to detect marker peptides in gelatin. Food Chem, 2013, 141(3):2450-2458.

13 程顯隆,李文杰,張小龍,等. UPLC-QTOF-MS結(jié)合主成分分析法用于龜甲膠、鹿角膠中添加牛皮源成分的檢測(cè)研究. 藥物分析雜志, 2012(6):931-935.

14 Cheng X L, Wei F, Xiao X Y, et al. Identification of five gelatins by ultra performance liquid chromatography/time-of-flight mass spectrometry (UPLC/Q-TOF-MS) using principal component analysis. J Pharm Biomed Anal, 2012, 62:191-195.

15 Li W J, Shi Y, Wei F, et al. Identification of bovine-hide gelatin from glue of tortoise shell and deer-horn gelatin by UPLC-QTOF-MS and principal component analysis. Chin J Pharm Anal, 2012, 32(6):931-935.

16 彭婷婷,江勛. 超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)不同品種龜甲制龜甲膠的牛皮源成分. 中國藥業(yè), 2016, 25(10): 72-73.

17 程顯隆. 膠類藥材質(zhì)量控制關(guān)鍵技術(shù)研究. 北京:北京中醫(yī)藥大學(xué)博士學(xué)位論文, 2014.

Identification of Bovine Hide Gelatine from the Shell Glue of the Red-Eared Slider (Trachemys scripta elegans) Using UPLC-ESI-QTOF-MS

Tang Min1, Yan Jianye1,2, Zhao Xiaofang1, Xu Bo1, Wang Xuesheng3, Li Shunxiang1,2
(1. School of Pharmacy, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China; 2. Hunan Province Engineering Research Center of Bioactive Substance Discovery of Traditional Chinese Medicine, Changsha, 410208, China; 3. SHANDONG YIXIAOTANG EJIAO GROUP BAINIAN ZHIYAO CO,.LTD, Xincai 463500, China)

This study aimed at developing an ultra-performance liquid chromatography electrospray time of flight-mass spectrometry (UPLC-ESI-QTOF-MS) method for the identification of bovine hide gelatine from the shell glue of the red-eared slider. Tortoise shell glue was made from the shell of red-eared slider or Reeves' turtle (Chinemys reevesii). The samples were analyzed on UPLC-ESI-QTOF-MS after being digested by trypsin, and the ions at m/z 604.8, m/z 641.3, m/z 790.8 of the marker peptides of bovine hide gelatin were detected. As a result, it was found that the test results of the ions made from the shell of red-eared slider at m/z 641.3 were positive, taking the same fragmentation regularity of MS/MS as the standard of bovine-hide gelatine, while negative results were detected from the ions made from the shell of Reeves' turtle. In conclusion, the method was simple and accurate provided a basis for distinguishing the tortoise shell glue from bovine hide, which could be also used for the quality control of tortoise shell glue.

Ultra-performance liquid chromatography electrospray time of flight-mass spectrometry, the marker peptides of bovine hide gelatine, the shell of Trachemys scripta elegans, tortoise shell glue

10.11842/wst.2016.12.024

R284

A

（責(zé)任編輯：朱黎婷，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-11-13

修回日期：2016-12-10

＊ 國家中醫(yī)藥管理局“藥用植物學(xué)”重點(diǎn)學(xué)科課題（國中醫(yī)藥發(fā)[2009]30號(hào)），負(fù)責(zé)人：李順祥；湖南省教育廳“中藥學(xué)”重點(diǎn)學(xué)科（湘教通[2011]76號(hào)），負(fù)責(zé)人：李順祥；湖南省教育廳高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)（湘教通[2010]212號(hào)），負(fù)責(zé)人：李順祥。

＊＊ 通訊作者：李順祥，本刊編委，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥成分與資源研究。