舒靜超，李賽賽，申歡歡，郭豫杰(河南農業(yè)大學/農業(yè)部動物生化與營養(yǎng)重點開放實驗室，河南 鄭州 450002)

口蹄疫病毒VP1蛋白可溶性表達標簽篩選

舒靜超，李賽賽，申歡歡，郭豫杰*
(河南農業(yè)大學/農業(yè)部動物生化與營養(yǎng)重點開放實驗室，河南 鄭州 450002)

為了提高口蹄疫病毒VP1蛋白的可溶性表達，根據(jù)A型口蹄疫病毒核酸序列設計并合成了口蹄疫病毒VP1片段，將其克隆到pET21b(+)載體上，設計1對通用引物擴增10個融合標簽Grifin、GST、NusA、SUMO、Thioredoxin、ProteinG、γ-crystallin、ArsC、PpiB、MBP，并分別將擴增的融合標簽與VP1連接構建重組質粒，將重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)，0.5 mmol/L IPTG誘導其表達。SDS-PAGE結果表明，MBP、Grifin和GST能夠促進口蹄疫病毒VP1蛋白的可溶性表達，其中MBP與VP1融合表達蛋白可溶部分占60%；Western blot鑒定分析結果顯示，小鼠抗His標簽單克隆抗體能識別表達的重組蛋白。表明成功表達了具有免疫學活性的融合蛋白MBP-VP1。

口蹄疫病毒； VP1蛋白； 可溶性； 融合標簽

口蹄疫(foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒引起的偶蹄動物烈性接觸性傳染病，主要危害牛、羊、豬等，發(fā)病率極高，傳播速度極快，易造成嚴重的經(jīng)濟損失，世界動物衛(wèi)生組織將其列為A類傳染病之首，我國農業(yè)部也將其劃定為一類動物傳染病[1]?？谔阋卟《?foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)屬于小RNA病毒科(Picomaviridae)、口蹄疫病毒屬(Aphthovirus)，有7個血清型，包括A型、O型、C型、Asia l型、SAT 1型、SAT 2型和SAT 3型等血清型，其中O型、A型口蹄疫在世界范圍內分布廣泛，近年來A型口蹄疫的流行范圍和暴發(fā)頻率呈現(xiàn)擴大和增強的趨勢。目前已知的FMDV各型之間沒有交叉免疫保護性。根據(jù)國家口蹄疫參考實驗室疫情監(jiān)測結果，我國目前主要流行O型和A型2個血清型，2013—2014年我國共報道發(fā)生A型疫情22次，疫情主要分布于廣東、新疆、西藏、青海、云南和江蘇等6個省(自治區(qū))[2]。

FMDV存在很強的變異性，7個血清型又分為60多個血清亞型[3]。FMDV含有單股正鏈RNA基因組，長約8 300 nt，主要包括3部分：5′非翻譯區(qū)、開放閱讀框(ORF)和 3′非翻譯區(qū)。FMDV基因組無帽子結構，5′端共價連接有病毒自身編碼的VPg蛋白，3′端為poly(A)尾巴。ORF編碼的多聚蛋白依靠自身編碼的蛋白酶(L、2A、3C)及少數(shù)的宿主因子裂解為3～4種病毒結構蛋白(VP4、VP2、VP3和VP1)和8～9種非結構蛋白(Lab、Lb、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D)[4]。其中，結構蛋白VP1是誘導產(chǎn)生中和抗體的主要抗原表位，暴露在病毒顆粒的表面，VP1上的B細胞表位是主要的保護性抗原位點，在其頂部形成高度保守的Arg-Gly-Asp序列，該序列是FMDV的細胞受體位點[5]。VP1上另1個抗原位點是輔助性 T 細胞表位，與B細胞表位形成一個非連續(xù)的形態(tài)表位，在免疫中起關鍵作用[6]。研究表明，從病毒衣殼蛋白分離的VP1可誘導動物產(chǎn)生針對該表位的中和性抗體[7]。因此，研究者嘗試利用衣殼蛋白上的抗原表位設計重組基因工程抗原以檢測和預防FMD[8]。鑒于VP1結構蛋白對研究FMDV的重要意義，筆者所在課題組以人工合成的方法將FMDV VP1上的主要抗原表位串聯(lián)起來，構建VP1多抗原表位片段，大小為636 bp。為得到高效表達的FMDV可溶性VP1蛋白，將VP1基因與Grifin 、GST、NusA、SUMO、Thioredoxin、ProteinG、γ-crystallin、ArsC、PpiB、MBP 10種不同融合表達標簽相連，研究不同融合標簽對VP1蛋白在大腸桿菌中可溶性表達效率的影響，以篩選出提高VP1蛋白可溶性表達的融合標簽，為進一步研究FMDV及其基因工程疫苗提供試驗材料。

1 材料和方法

1.1 載體

含VP1多抗原表位基因載體pET21b-VP1由寶生物(大連)公司合成構建；含有10種融合標簽的pEX系列載體由本實驗室保存，載體質粒信息見表1。

表1 載體信息

1.2 試劑

DNA Marker DL2000、DL5000購自寶生物(大連)公司；限制性內切酶BamHⅠ、NheⅠ購自Thermo Scientific公司；IPTG、質粒切膠回收純化試劑盒、質粒小量提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Tryptone、Yeast Extract、Agar power購自OXIOD公司；Prestained Protein MarkerⅠ、Agarose購自GENVIEW公司；四甲基乙二胺(TEMED)、2×SDS-PAGE電泳上樣緩沖液購自鼎國昌盛生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 含融合標簽的T載體構建 設計1對通用引物，上游引物為 F：5′-CTAGCTAGCTCTCACCATCACCATCACCATG-3′(下劃線部分為NheⅠ酶切位點)，下游引物為R：5′-CGGGATCCGGATTGGAAGTACAGGTTTTC-3′(下劃線部分為BamHⅠ酶切位點)，以上述10個pEX載體為模板分別擴增融合標簽片段。 PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，切膠回收后連接至pMD19-T載體，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α，菌液涂布于LB(含Amp)固體平板，37 ℃培養(yǎng)12 h，使用上述通用引物進行PCR鑒定，將初步鑒定為陽性的菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司測序鑒定。

1.3.2 重組表達載體的構建 將測序正確的10個重組融合標簽pMD19-T載體及pET21b-VP1質粒用NheⅠ和BamHⅠ進行雙酶切，回收相應目的片段，使用T4 DNA連接酶把回收的10個融合標簽片段分別與雙酶切后的pET21b-VP1質粒連接,分別命名為pET-2—9、pET-16、pET-21。同樣方法連接產(chǎn)物分別經(jīng)轉化和單菌落擴大培養(yǎng)后，將經(jīng)PCR鑒定融合標簽與pET21b-VP1質粒成功連接的陽性菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司測序鑒定。

1.3.3 VP1蛋白的誘導表達 將測序正確的10個pET重組質粒和pET21b-VP1質粒分別轉化大腸桿菌感受態(tài)BL21(DE3)，經(jīng)轉化擴大培養(yǎng)后通過PCR-PEF-21篩選陽性克隆菌液。將10個pET重組質粒和pET21b-VP1質粒的陽性菌液按1︰100的比例接種到50 mL LB(含100 mg/L的Amp)液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600=0.6 ～0.8時，加入IPTG至0.5 mmol/L。18 ℃、160 r/min誘導12 h后離心收集菌體，5 mL PBS溶液重懸，超聲波破碎(功率160 W，工作4 s，間歇8 s，持續(xù)25 min)，用12%分離膠和5%濃縮膠SDS-PAGE電泳檢測未誘導全菌、誘導后全菌、破碎后上清和沉淀中蛋白質的表達。1.3.4 融合標簽的篩選及鑒定 10組重組質粒經(jīng)過SDS-PAGE電泳后，經(jīng)考馬斯亮藍染色并脫色,對比誘導后全菌中目的蛋白的表達量來篩選能夠提高目的蛋白表達量的融合標簽，并比較上清中目的蛋白量篩選出能夠促進FMDV VP1蛋白可溶性表達的融合標簽。

取可溶性表達較好的VP1蛋白進行Western blot鑒定，初步檢測蛋白質是否正確翻譯。取處理好的誘導后全菌和上清先進行SDS-PAGE電泳，隨后將蛋白質轉印至PVDF膜上，再將膜在室溫用含5%脫脂奶粉的TBST封閉40 min，隨后加入1∶3 000鼠抗6×His單克隆抗體，4 ℃孵育過夜后TBST洗膜3次，再加入1∶5 000 HRP標記的羊抗鼠IgG二抗，作用60 min后TBST洗膜3次，最后用ECL試劑曝光顯影。

2 結果與分析

2.1 含融合標簽的T載體構建結果

融合標簽PCR擴增結果顯示(圖1)，分別在502、739、1 194、1 570、385、412、256、619、508、583 bp出現(xiàn)目的條帶，與pMD19-T載體連接后測序與預期片段大小和序列一致，表明融合標簽與pMD19-T載體連接成功。

M：DL2000 Marker； 1—10：分別為Grifin、GST、MBP、NusA、SUMO、Thioredoxin、ProteinG、γ-crystallin、ArsC、PpiB標簽PCR產(chǎn)物圖1 融合標簽PCR擴增結果

2.2 重組表達載體的構建結果

含融合標簽pMD19-T載體的雙酶切結果(圖2)顯示，Grifin、GST、MBP、NusA、SUMO、Thioredoxin、ProteinG、γ-crystallin、ArsC、PpiB分別在502、739、1 194、1 570、385、412、256、619、508、583 bp處有相應的融合標簽片段，2 692 bp的片段為pMD19-T載體片段；載體pET21b-VP1雙酶切結果顯示(圖3)，在6 068 bp處有含VP1的載體片段。

M1：DL2000 Marker； M2：DL5000 Marker； 1—10：分別為MBP、NusA、SUMO、ProteinG、γ-crystallin的pMD19-T載體雙酶切(2個重復);11—15：分別為Grifin、GST、Thioredoxin、ArsC、PpiB的pMD19-T載體雙酶切圖2 融合標簽載體雙酶切結果

重組表達載體菌液PCR結果顯示(圖4)，10個重組質粒均出現(xiàn)陽性條帶，菌液PCR鑒定為陽性的重組質粒經(jīng)測序比對完全正確，說明融合標簽和VP1的重組表達載體構建成功。

M：DL5000 Marker； 1—2：pET21b-VP1雙酶切圖3 pET21b-VP1雙酶切結果

M：DL2000 Marker； 1—10：分別為10個pET重組質粒Grifin、GST、MBP、NusA、SUMO、Thioredoxin、ProteinG、γ-crystallin、ArsC、PpiB標簽的PCR結果圖4 重組質粒菌液PCR擴增結果

2.3 VP1重組蛋白表達鑒定

從圖5可以看出，對照組pET21b-VP1目的蛋白在28 ku的位置有目的條帶；Thioredoxin、ProteinG、ArsC 與VP1的重組載體未能表達目的蛋白；Grifin、GST、MBP、NusA、SUMO、γ-crystallin、PpiB與VP1融合表達之后分別在43、52、69、82.5、39、48、46 ku的位置有目的條帶，箭頭所指即為帶VP1的融合蛋白條帶。

pET21b-VP1 以及VP1與Grifin、GST、MBP、NusA、SUMO、γ-crystallin、PpiB等標簽的融合表達結果; UN為未誘導菌體； IN為誘導后菌體；S為菌體超聲破碎后上清； IB為包涵體； M為Prestained Protein MarkerⅠ圖5 VP1重組蛋白SDS-PAGE分析

2.4 融合標簽的篩選及鑒定結果

由圖5可知，pET21b-VP1目的蛋白主要表達在沉淀中，為包涵體表達，溶解度很低；Thioredoxin、ProteinG、ArsC 與VP1的重組載體雖然構建成功，但誘導后沒有表達出融合蛋白；SUMO融合蛋白少量表達且在上清中，即SUMO標簽可促進蛋白的可溶性表達，但表達量低；NusA、γ-crystallin、PpiB融合蛋白表達量很高，以不溶的包涵體為主，上清中目的蛋白很少，提示這些標簽能提高目的蛋白表達量，但未提高重組蛋白的可溶性；與原質粒pET21b-VP1蛋白表達相比，Grifin、GST、MBP標簽不僅提高融合蛋白表達量，且上清中重組蛋白比例明顯提高，表明Grifin、GST、MBP標簽能促進VP1蛋白的可溶性表達。經(jīng)灰度分析軟件分析，10種融合標簽中MBP標簽表達的VP1蛋白可溶部分占60%，明顯促進VP1可溶性表達。

取pET-4(MBP)誘導后全菌及上清進行Western blot鑒定，在69 ku位置有陽性條帶，即pET-4(MBP)重組表達蛋白與6×His的抗體特異性結合，證實該蛋白為MBP-VP1融合蛋白(圖6)。

M：Prestained Protein Marker Ⅰ； 1.pET-4(MBP)誘導后全菌； 2.pET-4(MBP)上清圖6 VP1重組蛋白 Western blot結果

3 結論與討論

口蹄疫重組蛋白亞單位疫苗作為新型基因工程疫苗正在受到越來越高的重視[9-10]，亞單位疫苗由于只含病毒衣殼蛋白不含核酸，不僅在體液免疫應答和細胞免疫方面具有其獨特的優(yōu)勢，而且具有很高的安全性。VP1片段是FMDV的主要抗原位點，能夠誘導機體產(chǎn)生保護性的中和抗體。大腸桿菌、酵母、桿狀病毒和痘病毒等都能被用作表達目的蛋白的載體，其中大腸桿菌以其自身優(yōu)點經(jīng)常被用作宿主菌。Kleid等[12]首次在大腸桿菌中成功表達FMDV A12株VP1重組蛋白抗原，該重組蛋白抗原能夠誘導機體產(chǎn)生中和抗體，免疫動物后能抵御同源病毒的攻擊，不僅證明了VP1蛋白是FMDV重要的保護性抗原之一，也為研制重組亞單位口蹄疫表位疫苗提供了理論依據(jù)。

普通外源基因轉入大腸桿菌之后一般為包涵體表達，包涵體對于蛋白質的進一步應用是不利的[13]。研究者采用了很多的方法來提高蛋白質的可溶性，比如降低誘導的溫度[14]、改變宿主菌[15]、改變啟動子、改變誘導的條件[16]、采用分子伴侶和折疊調節(jié)因子的共表達[17]。然而，在很多情況下，改變以上這些條件也無法解決在大腸桿菌中過表達蛋白形成包涵體[18]。蛋白質的誘導表達有3個重要因素：溫度、誘導時間及誘導劑濃度，溫度太高易形成包涵體，IPTG本身對細菌有毒性，所以濃度不宜太高。目前，蛋白質的表達和純化已不再是技術難題，但重組蛋白的可溶性表達依然是個瓶頸，導致蛋白質不可溶有2個主要因素，1個是蛋白質翻譯的速率，另1個是蛋白質折疊的速率[19]。Costa等[20]曾在研究中使用ubiquitin、SUMO、MBP、GST、Thioredoxin和NusA 6種融合標簽對增強型綠色熒光蛋白、基質金屬蛋白酶13和生長分化因子8等公認的難溶蛋白的可溶性表達進行對比，得出不同的融合標簽對不同蛋白質的促可溶效果不同，其中，SUMO 和NusA提高重組蛋白的表達水平和溶解度最為明顯。Miroux等[14]發(fā)現(xiàn)，Grifin、GST、NusA、MBP等常用融合標簽可以提高重組蛋白的溶解度。為了篩選提高FMDV蛋白可溶性表達的融合標簽，本研究將目的基因與Grifin、GST、NusA、SUMO、Thioredoxin、ProteinG、γ-crystallin、ArsC、PpiB、MBP等10種融合標簽連接，在18 ℃條件下，經(jīng)0.5 mmol/L IPTG誘導12 h，研究10種融合標簽對FMDV蛋白VP1在大腸桿菌中的表達量和可溶性表達的影響，發(fā)現(xiàn)SUMO標簽融合蛋白溶解度高，但表達量很低；NusA、γ-crystallin、PpiB標簽促進蛋白質高表達，但可溶性表達不高；Thioredoxin、ArsC 和ProteinG未能誘導出重組蛋白；MBP、Grifin和GST標簽不僅能提高FMDV蛋白的表達量，又能促進其可溶性表達。綜合表達量和可溶性兩方面的結果，MBP標簽提高重組蛋白表達量和溶解度效果最好，Western blot結果顯示，誘導的蛋白質為帶6×His的目的蛋白。本研究通過在融合部位的N端放置TEV標簽，作為蛋白質酶切割位點[22]，在獲得高純度蛋白質后，便于從N端進行切割來獲得不帶融合標簽的口蹄疫VP1蛋白，為后續(xù)口蹄疫VP1蛋白及口蹄疫亞單位疫苗的研究奠定基礎。

本研究中構建的10個原核表達載體以及FMDV VP1蛋白的可溶性表達，不僅有利于目的蛋白的純化，為其生物學功能和A型口蹄疫亞單位疫苗研究提供試驗材料，也為融合標簽的研究提供參考。

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Screening of Fusion Tags that Enhanced Expression and Solubility of Type A Foot-and-mouth Disease Virus VP1 Protein

SHU Jingchao,LI Saisai,SHEN Huanhuan,GUO Yujie*
(Key Laboratory of Animal Biochemistry and Nutrition of Ministry of Agriculture/Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China)

In order to improve the soluble expression of FMDV VP1 protein,FMDVVP1 gene fragment was designed and synthesized according to the nucleic acid sequence of type A FMDV,and was cloned into the vector pET21b (+).A pair of universal primers and ten fusion tags(Grifin,GST,NusA,SUMO,Thioredoxin,ProteinG,γ-crystallin,ArsC,PpiB,MBP)were recombinanted with VP1 respectively,and then they were transformed intoE.coliBL21(DE3) and induced by 0.5 mmol/L IPTG,respectively.The results of SDS-PAGE showed that MBP,Griffin and GST increased the solubility of the FMDV VP1 protein,which worked best with MBP,and the proportion of soluble cellular lysate was 60%.Western blot analysis showed that the recombinant protein could be recognized by mouse anti-his tag monoclonal antibody.It indicated that the fusion protein MBP-VP1 with immunological activity was successfully expressed.

FMDV; VP1 protein; solubility; fusion tags

2016-02-10

農業(yè)部轉基因重大專項(2014ZX0801015B)

舒靜超(1990-)，男，河南安陽人，在讀碩士研究生，研究方向：獸醫(yī)生物技術。E-mail:shujch1995@163.com

*通訊作者：郭豫杰(1978-)，女，河南商丘人，講師，博士，主要從事生物化學研究。E-mail:cngyuj@163.com

S855.3

A

1004-3268(2016)09-0114-06