趙 靜，王 利，鐘紅梅

(1.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川 成都 610041；2.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041)

溫和氣單胞菌對齊口裂腹魚血漿中抗氧化酶的影響

趙 靜1，王 利2，鐘紅梅2

(1.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川 成都 610041；2.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041)

為探討溫和氣單胞菌對齊口裂腹魚抗氧化能力的影響，采用人工回感實驗對齊口裂腹魚注射溫和氣單胞菌，在6個不同時間點測定4個血漿指標(biāo):總抗氧化能力(T-AOC)、過氧化氫酶(CAT)、總超氧化物歧化酶活性(T-SOD)和黃嘌呤氧化酶(XOD).結(jié)果表明:齊口裂腹魚在感染48h后出現(xiàn)明顯癥狀，與對照組相比，感染組血漿T-SOD活力在感染12 h后上升出現(xiàn)差異極顯著(P＜0.01)，但在24 h后顯著下降.T-AOC在感染初期出現(xiàn)上升，48 h呈極顯著性升高，隨后下降.CAT活性在感染初期明顯增強(qiáng)，48 h時出現(xiàn)極顯著性差異(P＜0.01)，但72 h后開始下降.XOD活性在感染24 h后呈上升趨勢.這有利于深入研究溫和氣單胞菌對魚類的致病機(jī)理.

抗氧化酶；溫和氣單胞菌；齊口裂腹魚

齊口裂腹魚(Schizothorax prenanti)屬鯉科，裂腹魚亞科，是四川和青藏高原地區(qū)特有的經(jīng)濟(jì)魚類之一.近年來，隨著齊口裂腹魚人工養(yǎng)殖規(guī)模的增加，細(xì)菌性疾病在養(yǎng)殖過程中日益嚴(yán)重[1-3].溫和氣單胞菌是引起魚類細(xì)菌性敗血癥重要致病菌之一，已在鯉魚(Cyprinoid)[4]、斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus)[5]和黃鱔(Ricefield eel)[6]等水產(chǎn)動物中分離鑒定，產(chǎn)生了極大的危害.目前，對溫和氣單胞菌的研究主要集中在鑒定和治療方面，但尚缺乏齊口裂腹魚感染溫和氣單胞菌后血漿酶指標(biāo)的相關(guān)報道[7-9].血漿中抗氧化酶活性與機(jī)體的健康和免疫力密切相關(guān)[10-11].總抗氧化能力(T-AOC)、總超氧化物歧化酶活性(T-SOD)、過氧化氫酶(CAT)等指標(biāo)作為血漿中相關(guān)的抗氧化酶和氧化酶可消除機(jī)體內(nèi)的自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷.而黃嘌呤氧化酶(XOD)作為體內(nèi)重要的核酸代謝酶之一，可加快自由基的產(chǎn)生.因此，為探討魚體在受到病原菌侵襲后免疫功能的變化，本試驗對齊口裂腹魚進(jìn)行溫和氣單胞菌的人工回感試驗并檢測血漿中抗氧化指標(biāo)的變化，以期為齊口裂腹魚的疾病診斷和防控積累科學(xué)資料.

1 材料和方法

1.1 試驗動物

健康齊口裂腹魚購于四川某養(yǎng)殖場，體重400± 50 g，體長37±5 cm.

1.2 試驗菌株

菌株WS6202分離自患病鯽魚，經(jīng)鑒定為溫和氣單胞菌，保存于本實驗室-80℃超低溫冰箱.

1.3 試驗器材及試劑

抗凝劑(3.8%檸檬酸鈉)、紫外分光光度計(TU-1901)、離心機(jī)(Eppendorf)、總抗氧化能力、總超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和黃嘌呤氧化酶試劑盒均購于南京建成生物工程研究所.

1.4 動物回感及血液采集

將40條健康齊口裂腹魚隨機(jī)分為正常組和感染組.正常飼養(yǎng)一周后進(jìn)行實驗，在飼養(yǎng)過程中，正常充氧.根據(jù)麥?zhǔn)媳葷岱▽⒈４婢昱渲瞥蓾舛葹?.0× 108cfu/mL的菌懸液，每條魚注射菌液1.0 mL，對照組注射等量0.75%生理鹽水.每天觀察記錄魚體狀況，在6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、90 h分別從對照組和實驗組隨機(jī)采樣3條尾靜脈抽血.剖解發(fā)病魚體，無菌條件下分離細(xì)菌，進(jìn)行再次鑒定.

1.5 血漿指標(biāo)的測定

按照1∶9的比例將抗凝劑與抽取血液混合后室溫下靜止1 h，離心10 min(3500 r/min)，上樣液體即為血漿.根據(jù)南京建成生物試劑盒說明書進(jìn)行TSOD、T-AOC、XOD和CAT指標(biāo)的測定.數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，采用單方差因素進(jìn)行差異顯著性分析(P＜0.05或P＜0.01為顯著差異).

2 結(jié)果

2.1 臨床及剖解變化

齊口裂腹魚經(jīng)腹腔注射24 h后逐漸出現(xiàn)游動緩慢，胸鰭、腹鰭基部出血，眼球突出，腹部腫大，對照組未見異常變化.剖解可見，肝臟腫大，呈土黃色，脾臟腫大，腸道充盈剖開可見泡沫狀液體.再次分離培養(yǎng)病原菌，經(jīng)鑒定為溫和氣單胞菌，這可確認(rèn)齊口裂腹魚的發(fā)病由溫和氣單胞菌引起.

2.2 血漿指標(biāo)的測定

齊口裂腹魚在感染溫和氣單胞菌后，測定感染組中T-SOD、T-AOC和CAT指標(biāo)均出現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢，但XOD活性在感染24 h后呈上升水平(表1)，這在一定程度上反映出齊口裂腹魚機(jī)體的健康免疫狀況.

表1 齊口裂腹魚感染溫和氣單胞菌血漿指標(biāo)的變化Table 1 Changes of serum indices of Schizothorax prenanti infected with Aeromomas sobria

2.2.1 總超氧化物歧化酶(T-SOD)

由圖1可知，與對照組相比，感染組血漿中TSOD活力呈先升高再降低的變化趨勢，在感染6 h和 12 h時T-SOD活力極顯著性升高(P＜0.01)，但在24 h后又明顯低于對照組，且差異極顯著(P＜0.01).

圖1 總超氧化物歧化酶(T-SOD)活力測定結(jié)果Fig.1 The results of the activities of T-SOD

2.2.2 總抗氧化能力(T-AOC)

由圖2可知，與對照組相比，感染6 h后T-AOC活力開始上升，24 h達(dá)到高峰出現(xiàn)極顯著差異(P＜ 0.01).但在48 h后開始下降，且在90 h后低于正常水平.

圖2 總抗氧化能力(T-AOC)測定結(jié)果Fig.2 The results of T-AOC

2.2.3 過氧化氫酶(CAT)

由圖3可知，與對照組相比，感染6 h后CAT活力呈上升趨勢，且在48 h出現(xiàn)極顯著性升高(P＜0.01)，隨后下降略低于正常水平.

2.2.4 黃嘌呤氧化酶(XOD)

由圖4可知，與對照組相比，在感染12 h內(nèi)XOD活力未見明顯變化，但在24 h后隨著感染時間的延長而升高，出現(xiàn)差異極顯著(P＜0.01).

圖3 過氧化氫酶(CAT)測定結(jié)果Fig.3 The results of the activities of CAT

圖4 黃嘌呤氧化酶(XOD)測定結(jié)果Fig.4 The results of the activities of XOD

3 討論

血漿學(xué)是研究魚體生理生化理論基礎(chǔ)的重要內(nèi)容之一，血漿指標(biāo)的測定可為魚體健康狀況、疾病診斷和免疫力的評價提供參考數(shù)據(jù).肖玲遠(yuǎn)等[12]和陳永祥等[13]研究發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖型齊口裂腹魚血漿中總蛋白含量、血糖等指標(biāo)明顯高于野生型齊口裂腹魚.在齊口裂腹魚飼料中添加適量的黃芪多糖或β-葡聚糖可明顯改變機(jī)體血漿中酶活指標(biāo)，不僅可提高齊口裂腹魚的生長性能，且可提高免疫功能[14-15].這表明外界環(huán)境和其他條件的改變都可引起齊口裂腹魚血漿學(xué)指標(biāo)的改變，進(jìn)一步影響魚體的生長和免疫功能.

魚體在受到病原菌侵襲后，會立刻激活非特異性免疫防御系統(tǒng)，清除外來異物，保護(hù)機(jī)體健康，但當(dāng)魚體出現(xiàn)發(fā)病或是死亡時機(jī)體免疫力顯著下降.日本鰻鱺(Anguilla Anguilla)感染嗜水氣單胞菌初期機(jī)體血漿中SOD活性指標(biāo)出現(xiàn)顯著性上升，但在后期出現(xiàn)下降[16].鋸緣青蟹(Scylla serrata)在感染白斑綜合癥的瀕死期SOD活力顯著下降[17].南方大口鯰(Silurus meridionalis)在投喂溫和氣單胞菌滅活疫苗后血漿中抗體效價明顯升高.在本研究中齊口裂腹魚感染溫和氣單胞菌6 h后T-SOD、T-AOC和CAT活性均顯著性升高，這可表明齊口裂腹魚在感染初期時，溫和氣單胞菌可刺激魚體激活免疫防御系統(tǒng)，提高魚體免疫功能.但在齊口裂腹魚感染48 h后活性指標(biāo)均下降，且在90 h后低于對照組，這與盧衛(wèi)紅等研究結(jié)果略有差異，日本鰻鱺和大口黑鱸(Micropterus salmoides)感染溫和氣單胞菌后肝臟、腎臟、鰓等組織中SOD活性明顯低于健康組，且發(fā)病死亡魚體組織中的SOD活性與健康組相比極顯著性下降[18-19].這些差異一方面可能是由于測定血漿的時間點不同所引起，另一方面可能是魚的種類不同所致.

T-SOD、T-AOC和CAT作為機(jī)體重要的抗氧化酶可相互協(xié)作有效清除機(jī)體自由基，提高機(jī)體抵抗力，但當(dāng)機(jī)體組織器官受到損傷時，黃嘌呤氧化酶可協(xié)助機(jī)體自由基的產(chǎn)生，加速魚體的發(fā)病[21-22].劉偉成等研究隨著鎘脅迫時間的延長，大彈涂魚(Boleophthalmus pectinirostris)肝臟中XOD活性顯著性升高[23].在本研究中，當(dāng)齊口裂腹魚感染溫和氣單胞菌24 h后XOD指標(biāo)不斷上升.這進(jìn)一步表明溫和氣單胞菌感染齊口裂腹魚后，隨著病程的發(fā)展會在一定程度上損傷魚體內(nèi)臟器官，破壞細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)和功能，致使免疫能力下降.

綜上所述，T-SOD、T-AOC、CAT和XOD等4個血漿指標(biāo)的變化可作為判定齊口裂腹魚健康狀況和疾病診斷的參考指標(biāo).這也為水產(chǎn)細(xì)菌性疾病疫苗的研發(fā)和免疫防治奠定理論基礎(chǔ).

[1]杜宗君，黃小麗，汪開毓.齊口裂腹魚潰瘍病病原的分離鑒定[J].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，29(2):274-279.

[2]耿毅，汪開毓，吳麟，等.齊口裂腹魚敗血癥的病原分離與鑒定[J].水利漁業(yè)，2004，24(4):71-73.

[3]劉港彪，王利，王吉坤，等.齊口裂腹魚維氏氣單胞菌16S rDNA序列分析[J].水生態(tài)學(xué)雜志，2012，33(1):92-96.

[4]蘇應(yīng)兵，鄒桂偉，袁科平，等.斑點叉尾鮰暴發(fā)性敗血癥病原的分離與鑒定[J].淡水漁業(yè)，2006，36(5):37-43.

[5]劉敏，韓英.鯉魚溫和氣單胞菌的分離鑒定和藥敏試驗[J].哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2005，36(4):486-489.

[6]徐海圣，舒妙安.黃鱔溫和氣單胞菌病病原的分離鑒定及免疫應(yīng)答[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2003，23(3):240-244.

[7]邢根娣，胡秀彩，李雪.鯽魚腸道溫和氣單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].江蘇師范大學(xué)學(xué)報，2013，31(4):52-56.

[8]黃冠軍，劉天強(qiáng)，劉衍鵬，等.溫和氣單胞菌PCR快速診斷方法的建立[J].淡水漁業(yè)，2012，42(1):89-92.

[9]彭金菊，馬驛，梁淑鋆，等.30種中藥及其復(fù)方對溫和氣單胞菌的抗菌作用[J].廣東海洋大學(xué)學(xué)報，2009，29(6):42-47.

[10]TAVARES DM.A morphological and cytochemical study of erythrocytes，thrombocyts and leukocytes in four freshwater teleosts[J].Journal of Fish Biology，2006，68(5):1822-1833.

[11]于翔，李赫，宋文華，等.五種免疫添加劑對草魚非特異性免疫功能的影響[J].水產(chǎn)養(yǎng)殖，2011，32(7):39-45.

[12]肖玲遠(yuǎn)，陳永祥，沈詩軍，等.齊口裂腹魚血漿學(xué)指標(biāo)的測定[J].畢節(jié)學(xué)院學(xué)報，2007，25(4):76-80.

[13]陳永祥，肖玲遠(yuǎn)，嚴(yán)太明，等.野生和養(yǎng)殖裂腹魚血漿學(xué)指標(biāo)的比較研究[J].水生生物學(xué)報，2009，33(5):905-912.

[14]向梟，陳建，周興華，等.黃芪多糖對齊口裂腹魚生長、體組成和免疫指標(biāo)的影響[J].水生生物學(xué)報，2011，35(2):291-301.

[15]張遼，溫安詳.β-葡聚糖對齊口裂腹魚生長及免疫功能的影響[J].動物營養(yǎng)學(xué)報，2009，21(5):688-694.

[16]張偉妮，林旋，王壽昆，等.人工感染嗜水氣單胞菌對日本鰻鱺血漿酶活力的影響[J].淡水漁業(yè)，2012，42(1):20-24.

[17]劉問，錢冬，潘清清，等.WSSV對鋸緣青蟹的致病性及血漿酶指標(biāo)影響[J].水生生物學(xué)報，2009，33(6):1112-1119.

[18]盧衛(wèi)紅，王安利，陳健酬.大口黑鱸感染溫和氣單胞菌抗氧化功能的研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，48(7):1719-1723.

[19]盧衛(wèi)紅，王安利，陳健酬，等.感染溫和氣單胞菌日本鰻鱺的抗氧化功能研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，49(6):1434-1438.

[20]賀蓉，陳禮強(qiáng)，王金勝，等.南方大口鯰對溫和氣單胞菌的免疫反應(yīng)[J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2005，27(5):692-696.

[21]VELISEK J，SVOBODOVA Z，PIACKOVA V，et al.Effects of acute exposure to metribuzin on some hematological，biochemical and histopathological parameters of common carp(Cyprinus carpio L.)[J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology，2009，82(4): 492-495.

[22]蔡小輝，劉旭佳，彭銀輝，等.人工感染3種弧菌對鯔魚血漿酶活力的影響[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2014，45(1):137-142.

[23]劉偉成，李明云，黃福勇，等.鎘脅迫對大彈涂魚肝臟黃嘌呤氧化酶和抗氧化酶活性的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2006(17):1310-1314.

(責(zé)任編輯:李建忠，付強(qiáng)，張陽，羅敏；英文編輯:周序林，鄭玉才)

Changes of serum antioxidant enzymes in Schizothorax prenanti artificially infected with Aeromomas sobria

ZHAO Jing1，WANG Li2，ZHONG Hong-mei2
(1.Institute of Qinghai-Tibet Plateau，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，P.R.C.；2.School of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，P.R.C.)

In order to discuss the effects of Aeromomas sobria on serum antioxidant enzymes in Schizothorax prenanti，health Schizothorax prenanti were artificially infected with Aeromomas sobria.The activities of total superoxide dismutase(T-SOD)，total antioxidant capacity(T-AOC)，xanthine oxidase(XOD)and catalase(CAT)were investigated at 6 time points.The results showed that the activities of T-SOD significantly increased at 12 h(P＜0.01)and then decreased after 24 h.The activities of TAOC increased and reached the highest level at 48 h(P＜0.01)，then quickly decreased.The activities of CAT initially increased and then decreased after 48 h.The activities of XOD continuously increased after 24 h(P＜0.01).These results suggested that the four serum indices tested could be important references of health and diagnosis of Schizothorax prenanti.

antioxidant enzyme；Aeromomas sobria；Schizothorax prenanti

S941.42；S943

A

2095-4271(2016)06-0621-05

10.11920/xnmdzk.2016.06.005

2016-06-22

王利(1977-)，女，漢族，成都人，副教授，博士.研究方向:動物醫(yī)學(xué).E-mail:qinxin916＠aliyun.com

四川省科技支撐項目(2016NZ0044)；西南民族大學(xué)研究生學(xué)位點建設(shè)項目(2016XWD-S071007)