趙馨 魏然 尹愛華

(廣東省婦幼保健院 醫(yī)學遺傳中心，廣東 廣州 510010)

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無創(chuàng)產(chǎn)前診斷在胎兒染色體結(jié)構(gòu)異常中的研究進展

趙馨 魏然 尹愛華*

(廣東省婦幼保健院 醫(yī)學遺傳中心，廣東 廣州 510010)

尹愛華，教授、主任醫(yī)師、醫(yī)學博士、博士生導師；廣東省婦幼保健院出生缺陷防治與產(chǎn)前診斷中心/醫(yī)學遺傳中心主任、廣東省婦幼代謝與遺傳醫(yī)學重點實驗室副主任，醫(yī)院重點科技人才、學科帶頭人；曾在香港大學、哈佛大學、悉尼大學訪學，進修遺傳咨詢與產(chǎn)前診斷技術(shù)。目前任國家產(chǎn)前診斷專家組專家、中國醫(yī)師協(xié)會遺傳醫(yī)師分會常務(wù)委員兼青年委員會副主任委員、中國優(yōu)生科學協(xié)會常務(wù)理事兼出生缺陷防控專業(yè)委員會副主任委員、廣東省醫(yī)學會醫(yī)學遺傳分會副主任委員、廣東省地中海貧血防治協(xié)會副會長、廣東省醫(yī)學會婦幼保健學分會產(chǎn)前診斷學組組長、廣東省婦幼保健協(xié)會常務(wù)理事、廣東省優(yōu)生優(yōu)育協(xié)會生化免疫委員會副主任委員、海峽兩岸醫(yī)藥衛(wèi)生交流協(xié)會遺傳與生殖專業(yè)委員會常務(wù)委員兼副青年委員會主任委員。2014年榮獲"廣東青年五四獎?wù)?。先后牽頭承擔國家生殖健康與出生缺陷重大專項、國家自然基金項目、國家863計劃項目子課題及省、市部級重點課題十多項，獲得國家教育部科技進步二等獎1項、國家科技進步獎二等獎1項、廣東省科技進步一等獎1項、廣州市科技進步一等獎1項、國家發(fā)明專利5項。發(fā)表了論著、文章近100篇，其中SCI文章19篇。

一直以來，人們致力于開發(fā)一種早期、安全、準確的產(chǎn)前篩查方法以排查胎兒染色體異常，降低新生兒出生缺陷率。傳統(tǒng)的介入性產(chǎn)前診斷方法有0.5%～1%的流產(chǎn)風險。因此，人們開始尋找一種準確又無創(chuàng)的產(chǎn)前診斷途徑。研究至今，在孕婦外周血中發(fā)現(xiàn)了胎兒有核紅細胞、胎兒游離DNA、胎兒游離RNA等新興的研究物質(zhì)，為非介入性產(chǎn)前診斷提供可能，其中基于胎兒游離DNA的胎兒染色體21、18、13-三體綜合征的產(chǎn)前篩查已成功應(yīng)用于臨床，胎兒其他染色體數(shù)目異常以及結(jié)構(gòu)異常、單基因病等的診斷方法也成為研究熱點，本文就其在胎兒染色體結(jié)構(gòu)異常中的研究進展做一綜述。

1 孕婦外周血中胎兒游離DNA的發(fā)現(xiàn)及生物學特性

在1997年，Lo等[1]首次在孕婦血漿中檢測到胎兒游離DNA(cffDNA)的存在。隨著研究發(fā)現(xiàn)cffDNA在孕婦外周血中的含量豐富，較胎兒細胞大約多出20倍，最早可在妊娠5周從母體外周血液中檢測到，并隨孕周增長而增加，妊娠晚期在母血DNA中的濃度可達6.2%。而在胎盤娩出后，又可以數(shù)分鐘的半衰期從孕婦血漿中迅速清除，兩個小時即可從母親外周血中完全消失，不會影響下次妊娠檢測結(jié)果。關(guān)于其來源，有學說認為cffDNA主要來源于滋養(yǎng)層或胎盤細胞的凋亡，少量來自于胎兒血循環(huán)或胎兒細胞。約85%的胎兒DNA分子片段長度為100～300bp，而大部分孕婦自身DNA分子片段長度大于1000bp，母胎DNA多分子片段差異為從孕婦外周血中富集胎兒DNA提供了可能；近年已有學者從cffDNA中譜畫出胎兒的完整基因組DNA，因此，cffDNA是無創(chuàng)產(chǎn)前診斷最理想的分子標記。但是孕婦血漿DNA是由孕婦自身DNA和cffDNA混合構(gòu)成，識別孕婦外周血中cffDNA要求高精確度及高準確性的檢測工具，二代測序技術(shù)以及數(shù)字PCR的出現(xiàn)，為利用cffDNA的產(chǎn)前診斷研究提供了廣泛的發(fā)展前景[2]。

2 孕婦外周血中cffDNA在產(chǎn)科領(lǐng)域中的應(yīng)用

對cffDNA進行準確的定性及定量檢測，發(fā)現(xiàn)在子癇前期[3]、胎盤源性胎兒生長受限[4, 5]、胎盤植入[6]、早產(chǎn)[7]、以及妊娠肝內(nèi)膽汁淤積綜合征[8]的孕婦中，母血中cffDNA的含量異常增高，且與疾病嚴重程度呈正相關(guān)，原因可能是此類疾病共同的病理基礎(chǔ)即胎盤小動脈痙攣[3]、血管內(nèi)皮損傷[7, 8]和缺氧及再充氧[3]作用造成胎盤損傷，氧化應(yīng)激增加胎盤細胞的凋亡和壞死，以及肝細胞破壞[8]和腎小球腎小管功能障礙[3, 8]影響降解有關(guān)。孕期監(jiān)測到胎兒cffDNA濃度異常升高可提示病理性妊娠高風險。

3 孕婦外周血中cffDNA在無創(chuàng)單基因病中的應(yīng)用

單基因遺傳病是由一對等位基因控制的遺傳性疾病?；赾ffDNA的無創(chuàng)產(chǎn)前研究至今分為3個階段：①第一階段，檢測父源性致病位點；②第二階段，檢測父源性遺傳序列中雜合度高的STR位點或者SNP，不僅解決了由cffDNA含量過低造成假陰性的問題，同時也擴大了檢測范圍，即使夫妻雙方擁有相同的突變位點，也可通過其他SNP位點排除胎兒的純合突變；③第三階段的檢測利用數(shù)字PCR、高通量測序等高敏感性及準確性的檢測平臺，可檢測母源性致病位點，結(jié)合單倍型構(gòu)建，準確推斷胎兒基因型。迄今，已有軟骨發(fā)育不良、阿佩爾綜合征、Huntington舞蹈病、囊性纖維化、地中海貧血等單基因病研究報道[9-13]。

4 孕婦外周血中cffDNA在胎兒染色體異常中的應(yīng)用

4.1 孕婦外周血中cffDNA在胎兒染色體數(shù)目異常中的應(yīng)用 臨床上使用的無創(chuàng)診斷胎兒21-三體綜合征的方法原理是利用高敏感性檢測方法區(qū)別孕有非等倍體胎兒與孕有正常胎兒的孕婦外周血中致病染色體數(shù)目中微小差異[14]。2008年[15]首次將高通量測序技術(shù)應(yīng)用于胎兒21體綜合征的無創(chuàng)檢測中，計數(shù)cffDNA中所有染色體序列，并將其與人類基因組序列對比，根據(jù)同一條染色體上多個序列計數(shù)來判斷靶染色體數(shù)目異常。其優(yōu)點在于不會受限于檢測胎兒特異性序列，或母胎差異性位點，通過檢測孕婦血漿中cffDNA的所有序列讀數(shù)，經(jīng)過比對孕有正常胎兒孕婦外周血中相應(yīng)染色體的序列讀數(shù)，最終統(tǒng)計分析得出結(jié)論。此為胎兒染色體非整倍體檢測奠定基礎(chǔ)。

自2011年開始，利用高通量測序平臺檢測胎兒21、18、13染色體非整倍體的方法已廣泛應(yīng)用于臨床，包括北美、歐洲以及亞洲，靈敏度及特異性均高于99%，但是檢測準確性與胎兒DNA占母血總DNA的濃度有關(guān)，小于4%無法檢出結(jié)果。有報道指出，迄今為止，全世界超過60個國家已采用此項技術(shù)完成75萬例以上的檢測[16]。

特納綜合征(45，XO)、克氏綜合征(47，XXY)和XYY綜合征是常見的性染色體非整倍性，由于X染色體GC含量造成偏移、性染色體之間的高度同源性、Y染色體含有較多的回文結(jié)構(gòu)、Y染色體長度變異及胎兒染色體存在嵌合可能等加大了無創(chuàng)產(chǎn)前診斷胎兒性染色體非整倍體分析的難度。經(jīng)過多位研究者的研究，利用cffDNA檢測胎兒性染色體非整倍體可達到96.2%靈敏度(95%置信區(qū)間 78.4～99.8)，假陽性率0.3%(95%置信區(qū)間0～1.8)[17]。

雙胎妊娠進行胎兒非整倍體鑒定的關(guān)鍵在于雙胎合子類型的確定以及單個胎兒cffDNA在母血中的含量測定。單卵雙胎的兩個胎兒染色體核型完全相同，各胎兒cffDNA在母血中的比例相對恒定，可作為單胎妊娠檢測。雙卵雙胎需要對每個胎兒在母血中cffDNA濃度進行精確測定，而雙胎妊娠中各胎兒cffDNA含量變異較大[18]。Canick等[19]已知雙胎合子類型，并假定每個胎兒在母血中cffDNA含量均等的前提下，檢測了25例樣本，檢出7例21-三體胎兒，1例13-三體胎兒，以及17例正常胎兒，檢出率100%(置信區(qū)間59%～100%)，假陽性率0(95置信區(qū)間10%～19.5%)。

4.2 孕婦外周血中cffDNA在胎兒染色體微重復微缺失異常中的應(yīng)用 除了非整倍體，染色體結(jié)構(gòu)異常也是導致先天畸形、發(fā)育遲緩等的重要原因。近年來，隨著CMA技術(shù)的發(fā)展，產(chǎn)后CMA技術(shù)的應(yīng)用已證實在出生缺陷、生長發(fā)育遲緩、智力低下兒的遺傳學中擁有至關(guān)重要的作用，2009年開始，美國婦產(chǎn)科協(xié)會、歐洲細胞遺傳協(xié)會等先后發(fā)表了指南，指出產(chǎn)前胎兒超聲結(jié)構(gòu)畸形或MRI異常時，CMA常是進行CMA檢查的適應(yīng)證，因此，當無創(chuàng)胎兒21、18、13-三體綜合的產(chǎn)前篩查在臨床上取得成功后，將應(yīng)用范圍拓展至染色體微重復微缺失綜合征的診斷成為研究主要方向，而近年來，已有利用高通量測序檢測cffDNA診斷胎兒染色體微重復微缺失的病例報道，但尚無無創(chuàng)方法發(fā)現(xiàn)胎兒染色體嵌合的報道。

2011年，《新英格蘭雜志》首次報道了一例通過高通量測序檢出胎兒22號染色體上4.2Mb的缺失案例，該孕婦于孕35周采血，胎兒DNA占母血中總DNA的5.7%[20]。

Jensen[21]選擇22號染色體上3×106bp作為靶序列，對孕19～20周的高危胎兒以及正常胎兒的母血進行靶序列測序分析，鑒定兩個胎兒21號染色體上3.0Mb缺失，但實驗要求cffDNA占母血中總DNA的10%以上，檢測深度4倍。

Yu等[22]利用二代測序平臺，檢測出6例致病CNVs 3Mb病例，證實通過高通量測序檢測cffDNA可檢測胎兒染色體微缺失微重復綜合征，并提高測序深度，可以檢測低至1Mb左右胎兒染色體拷貝數(shù)變異，并發(fā)現(xiàn)一例母體自身攜帶染色體微重復片段，而胎兒染色體正常的病例，因母體攜帶染色體異常測序得出的Z值遠大于胎兒異常的Z值，但是要達到95%檢測敏感性，每例樣本需讀取240Mb讀數(shù)。

Srinivasan等[23]隨后研究11位孕有異常核型胎兒的孕婦，提高測序深度達200Mb reads，證實高通量測序平臺可檢測出所有的20-三體綜合征以及微重復微缺失，不適用于嵌合體核型檢測，在易位標本中，可通過斷裂點附近的小片段缺失來判斷斷裂位置，無法提示平衡易位，并且通過提高測序深度，最高可達100kb分辨率，發(fā)現(xiàn)了諸多在孕中期染色體核型分析不能發(fā)現(xiàn)的微小病變。以上研究也要求較高的測序深度及較高的胎兒DNA濃度。

Chen[24]結(jié)合既往研究采取的動態(tài)閾值、二次元分割算法以及GC偏倚糾正方法，開發(fā)了低覆蓋率(0.08倍)測序母體外周血DNA檢測大于10Mb的胎兒染色體微缺失微重復的方法，檢測1311例樣本，檢出4例致病片段，大小為9.01～28.46Mb之間，檢測敏感性100%，特異性99.92%，假陰性率0%。

Rampa[25]設(shè)計了一種新的Hidden Markov 模型，將SNP位點等位基因不平衡性、父母基因型相近的SNP位點信息和測序的深度要求有機統(tǒng)一起來，檢測硅片中模擬ccffDNA濃度分數(shù)13%的母體外周血模型，發(fā)現(xiàn)可檢出90%致病片段大于4.4Mb的樣本，檢出40%致病片段在50～400Kb的染色體異常，目前暫無進一步臨床驗證研究。

Yin[26]團隊利用半導體測序技術(shù)，對cffDNA進行全基因組測序。檢測出1476例超聲異常胎兒的孕母外周血，在不用測序深度及不同cffDNA在母血漿中濃度比例的情況下，評估高通量測序檢測胎兒染色體微重復微缺失綜合征的臨床應(yīng)用價值，發(fā)現(xiàn)檢出率與cffDNA在母血漿中的濃度比例及測序深度正相關(guān)，在3.5M reads時，可檢出71.8%的染色體片段異常，檢測5Mb以上片段的靈敏度98.15%，特異度97.84%，假陽性率2.16%，假陰性率1.85%。提供檢測深度至10M reads，檢測1Mb以上染色體片段，靈敏度可至97.08%，特異度98.6%，假陽性率1.99%，假陰性率2.92% ；并在檢測中發(fā)現(xiàn)55例假陽性，考慮其中53%與孕婦被染色體片段重復及缺失相關(guān)，其余病例原因不明。

5 未來與展望

發(fā)現(xiàn)cffDNA至今已近20年，經(jīng)多年的研究實踐，現(xiàn)已成功應(yīng)用于臨床，即無創(chuàng)胎兒21、18、13-三體綜合征的產(chǎn)前篩查，有效地降低了不必要的介入性產(chǎn)前診斷。目前部分國家，胎兒性染色體異常以及雙胎妊娠胎兒染色體異常的無創(chuàng)檢測方法也逐步走向臨床。經(jīng)研究提示，利用高通量測序技術(shù)檢測孕婦血漿中cffDNA診斷胎兒染色體微重復微缺失綜合征是可行的，但由于cffDNA在母血中濃度較低、測序深度等造成的成本過高以及較高的陽性率，至今該無創(chuàng)技術(shù)仍處于研究中，相信隨著生物信息學的進一步發(fā)展以及對測序成本逐漸降低，在不久的將來，這項技術(shù)也將應(yīng)用于臨床。

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編輯：宋文穎

10.13470/j.cnki.cjpd.2016.04.001

2016-11-12)

*通訊作者：尹愛華，E-mail：yinaiwa@126.vip.com