賴志珍 季春蓮 許秀娟 孟建標(biāo) 張 薇 胡馬洪

·論著·

通腑益氣湯對膿毒癥模型大鼠TNF-α、IL-lβ 及ICAM-1水平的影響

賴志珍 季春蓮 許秀娟 孟建標(biāo) 張 薇 胡馬洪

目的觀察通腑益氣湯對膿毒癥模型大鼠血清TNF-α、IL-lβ及ICAM-1水平影響和腸組織的病理改變。方法將雄性SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為模型組、氧氟沙星組、通腑益氣湯組，每組12只。采用經(jīng)典盲腸結(jié)扎穿孔法（CLP）制備大鼠膿毒癥模型，氧氟沙星組采用灌胃氧氟沙星16mg/kg，通腑益氣湯組在此基礎(chǔ)上給予通腑益氣湯水煎劑（含生藥1g/mL）灌胃，每天1次，連續(xù)3天，模型組用等量生理鹽水灌胃。檢測各組大鼠血清TNF-α、IL-lβ及ICAM-1水平和光學(xué)顯微鏡下觀察腸組織病理改變并進行評分。結(jié)果模型組大鼠血清TNF-α、IL-lβ及ICAM-1分別為（95.26±34.73）ng/mL、（30.83±12.32）pg/mL、（914.72±82.13）pg/mL，氧氟沙星組分別為（78.46±30.24）ng/mL、（24.72±10.53）pg/mL、（790.69±60.24）pg/mL，通腑益氣湯組分別為（60.38±21.81）ng/mL、（19.31±8.62）pg/mL、（681.69±52.62）pg/mL，與模型組和氧氟沙星組比較，通腑益氣湯組大鼠血清TNF-α、IL-lβ、ICAM-1水平明顯降低（P＜0.05）；模型組、氧氟沙星組、通腑益氣湯組腸組織損傷評分分別為（4.21±0.61）分、（3.56±0.32）分、（2.84±0.27）分，與模型組和氧氟沙星組比較，通腑益氣湯組腸組織損傷病理學(xué)評分最低（P＜0.05）。結(jié)論通腑益氣湯對膿毒癥模型大鼠腸黏膜的保護作用可能與其抑制TNF-α、IL-1β過度表達，進而下調(diào)ICAM-1水平有關(guān)。

大鼠；膿毒癥；TNF-α；IL-lβ；ICAM-1；腸損傷；通腑益氣湯

KEY WORDSrats;sepsis;TNF-α;IL-lβ;ICAM-1;intestinal injury;Tongfu Yiqi decoction

膿毒癥（sepsis）是由感染引起的全身炎性反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），可發(fā)展為嚴(yán)重膿毒癥、膿毒癥休克及多臟器功能衰竭[1]。西醫(yī)對阻斷膿毒癥的病理發(fā)展過程尚缺乏有效的治療方法，中醫(yī)藥治療膿毒癥有著廣泛的前景，這在近期中國膿毒癥中西醫(yī)結(jié)合診治專家共識指南中有體現(xiàn)[2]。通腑益氣湯是我科在長期臨床實踐中總結(jié)出的治療膿毒癥合并胃腸功能障礙的經(jīng)驗方。本研究擬觀察通腑益氣湯對膿毒癥模型大鼠血TNF-α、IL-lβ及ICAM-1水平的影響，并觀察腸黏膜的病理改變，探討其抑制炎癥反應(yīng)的作用。

1 實驗材料

1.1 動 物 健康SPF級雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量（300±20）g，購于浙江省實驗動物中心，合格證號：SCXK（浙）2014-0001，置于室溫21℃，相對濕度30% ～70%，自然光照和基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)。

1.2 藥 物 大黃（后下）10g，芒硝6g，厚樸、枳實各10g，黃芪20g，當(dāng)歸12g。加水濃煎制成湯劑68mL，過濾除菌分裝-20℃保存?zhèn)溆?，含生?g/mL。

1.3 試劑和儀器 氧氟沙星膠囊（批號W026，永信藥品工業(yè)有限公司）；生理鹽水（批號41203274，杭州民生藥業(yè)有限公司）；靜脈輸液針（批號111230，圣光醫(yī)用制品有限公司）；密閉式靜脈留置針（蘇州碧迪醫(yī)療器械有限公司）。TNF-α、IL-lβ及 ICAM-1 ELISA試劑盒均為美國Endogen公司原裝產(chǎn)品，由深圳晶美生物有限公司上海分公司提供，酶標(biāo)儀ELX808系美國Biotek公司產(chǎn)品。

2 實驗方法

2.1 造模及分組 動物實驗經(jīng)浙江省醫(yī)學(xué)實驗動物管理委員會同意。將36只雄性清潔級SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為模型組、氧氟沙星組、通腑益氣湯組，每組12只。參照文獻[3]報道的盲腸結(jié)扎穿孔法（CLP）制備膿毒癥大鼠模型，術(shù)畢給予動物皮下注射生理鹽水10mL/kg以補充術(shù)中液體丟失。CLP是誘發(fā)膿毒癥的經(jīng)典方法，其不僅可以通過穿孔處溢出的糞便進入腹腔，引起混合感染，同時結(jié)扎后的盲腸可因缺血壞死，釋放炎癥因子，誘發(fā)膿毒癥。本研究膿毒癥模型大鼠5天后開始出現(xiàn)死亡，9天存活率為零，證明模型制備成功。

2.2 給 藥 通腑益氣湯組在造模6h后給予10mL/kg的通腑益氣湯和16mg/kg的氧氟沙星灌胃，1天1次，直至造模后第3天；氧氟沙星組在造模6h后給予每天灌胃16mg/kg的氧氟沙星及10mL/kg生理鹽水，模型組于相同時間點給予等量生理鹽水灌胃。

2.3 標(biāo)本采集與檢測

2.3.1 各組血清TNF-α、IL-lβ及ICAM-1水平 于第4天給予10%水合氯醛（0.3mg/100g）腹腔內(nèi)注射麻醉，取大鼠單側(cè)頸總動、靜脈血，3000r/min,離心15min，分離提取血清后置-67℃低溫冰箱保存待測。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定血清TNF-α、IL-lβ、ICAM-1）水平。嚴(yán)格按照說明書進行。

2.3.2 光鏡下觀察各組腸黏膜病理 于第4天留取血標(biāo)本后處死大鼠，取距肛門5cm處腸黏膜30～50mg組織分別置于4%甲醛溶液中固定，石蠟包埋、切片、HE染色后，光鏡下觀察。先由兩位病理科醫(yī)師在不了解動物實驗分組的情況下按Chiu等[4]的方法進行腸組織損傷評分，以0～5分表示不同的損傷級別。評分標(biāo)準(zhǔn)：0分：腸黏膜絨毛正常；1分：絨毛頂端上皮下出現(xiàn)囊狀間隙，并伴有毛細血管充血；2分：上皮下間隙擴大,固有層中度水腫，中央乳糜管擴張；3分：固有層明顯水腫，腸黏膜上皮層細胞變性、壞死，少數(shù)絨毛頂端脫落；4分：上皮層細胞變性、壞死、脫落，部分絨毛脫落,固有層裸露，毛細血管擴張、充血；5分:絨毛脫落、固有層崩解,出血或潰瘍形成。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組大鼠血清TNF-α、IL-lβ及ICAM-1水平比較 與氧氟沙星組和模型組比較，通腑益氣湯組血清TNF-α、IL-lβ、ICAM-1水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清TNF-α、IL-lβ及ICAM-1水平比較（±s）

表1 各組大鼠血清TNF-α、IL-lβ及ICAM-1水平比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與氧氟沙星組比較，▲P＜0.05

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3.2 各組大鼠腸組織損傷評分比較 與氧氟沙星組和模型組比較，通腑益氣湯組大鼠腸組織損傷病理學(xué)評分最低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。各組大鼠腸黏膜病理改變結(jié)果見插頁圖1。

表2 各組大鼠腸組織損傷評分比較（±s）

表2 各組大鼠腸組織損傷評分比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與氧氟沙星組比較，▲P＜0.05

組別模型組氧氟沙星組通腑益氣湯組鼠數(shù)12 12 12腸組織損傷評分（分）4.21±0.61 3.56±0.32* 2.84±0.27*▲

4 討論

膿毒癥的發(fā)病機制極為復(fù)雜，其中免疫炎癥反應(yīng)紊亂是重要的發(fā)病機制之一。膿毒癥的免疫炎癥反應(yīng)紊亂源于機體促炎抗炎機制失衡，在膿毒癥早期，促炎因子（如TNF-α、IL-lβ）占優(yōu)勢而表現(xiàn)為一種爆發(fā)式炎癥反應(yīng)，隨后，代償性的引起抗炎因子（如IL-4，IL-10，IL-13）激活而造成免疫抑制[5]。動物實驗和臨床研究證實，在創(chuàng)傷、燒傷、休克、嚴(yán)重膿毒癥等病理狀態(tài)下，腸道可發(fā)生不同程度的組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的改變，包括腸黏膜及黏膜下水腫、絨毛變短、腸上皮細胞分化、增殖加快，甚至腸道細胞壞死、凋亡，導(dǎo)致腸黏膜屏障功能損害，通透性增加、細菌毒素移位[6-7]。當(dāng)細菌和（或）內(nèi)毒素入血后，可激活或誘生大量促炎性介質(zhì)或細胞因子，這些因素互為因果、相互激活、相互放大，導(dǎo)致局部甚至全身性不可控制性的炎癥級聯(lián)反應(yīng)，最終發(fā)生MODS[8]。胃腸道作為體內(nèi)最大的免疫器官，它是MODS的始動器官，而腸道損害和膿毒癥互為因果，呈惡性循環(huán)，故其又是膿毒癥的靶器官。

目前已確認(rèn)的促炎細胞因子主要有TNF-α、IL-1β等,這些細胞因子在生物損傷和SIRS的發(fā)生發(fā)展的病理過程中扮演重要的角色，其分泌量增加以及引起的各種炎癥因子的瀑布式釋放，炎癥反應(yīng)過程中TNF-α是始動因素，IL-1β起到協(xié)同作用，IL-1β不能直接活化炎性白細胞，但可以引起IL-8的分泌，通過改變前炎癥介質(zhì)或抗炎癥細胞因子的表達和影響組織多型核中性粒細胞（PMN）聚集而促進炎癥的發(fā)展，從而引起組織細胞損傷[9-11]。

ICAM-1是一種具有多種生物學(xué)功能的跨膜糖蛋白，能介導(dǎo)細胞黏附、趨化、淋巴細胞歸巢等，參與炎癥和免疫反應(yīng)，在機體的生理和病理過程中發(fā)揮作用。在某些細胞因子如白介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子（TNF）的作用下其表達增強，可導(dǎo)致組織器官炎癥免疫損傷。有研究[12]發(fā)現(xiàn)，在腸道反應(yīng)急性期，活化的血管內(nèi)皮細胞表面的ICAM-1表達顯著上調(diào)，而ICAM-1缺失小鼠的死亡率顯著下降，腸道的炎癥浸潤和損傷程度較輕，直接證明ICAM-1在腸損傷發(fā)展中起重要作用。

中醫(yī)無“膿毒癥”病名，但根據(jù)其臨床癥狀，參照中華中醫(yī)藥學(xué)會發(fā)布《中醫(yī)內(nèi)科常見病診療指南》（ZYYXH/T11.-2008），“膿毒癥”可歸為“外感熱病”、“脫證”、“痞滿”、“神昏”、“臟竭癥”及“溫毒”、“走黃”、“內(nèi)陷”癥等范疇。劉清泉[13]提出，正虛毒損、瘀滯絡(luò)脈是膿毒癥的基本病機，由于正氣不足，毒邪內(nèi)蘊，內(nèi)陷營血，絡(luò)脈氣血營衛(wèi)運行不暢，導(dǎo)致毒熱、瘀血、痰濁內(nèi)阻，瘀滯絡(luò)脈，令各臟器受邪而損傷，引發(fā)該病。通腑益氣湯是在經(jīng)典大承氣湯峻下通腑的基礎(chǔ)上，加黃芪、當(dāng)歸而成，方中黃芪補氣固脫、升陽舉陷，當(dāng)歸活血補血，大黃、芒硝瀉熱通便，厚樸、枳實行氣散結(jié)，并助芒硝、大黃加速積滯排泄。此方瀉中有補，有降有升。

本研究結(jié)果顯示，通腑益氣湯組TNF-α、IL-lβ水平較氧氟沙星組和模型組明顯降低（P＜0.05）。表明通腑益氣湯可抑制炎癥因子（TNF-α、IL-lβ）的過度表達；同時，通腑益氣湯組ICAM-1水平較氧氟沙星組和模型組明顯降低（P＜0.05），提示通腑益氣湯能抑制全身炎癥反應(yīng)，進而下調(diào)ICAM-1的水平。模型組大鼠腸絨毛及固有層大片脫落，周圍可見炎癥細胞，可見固有層出血或潰瘍；氧氟沙星組大鼠腸絨毛間隙增寬，絨毛和固有層部分脫落，毛細血管充血；通腑益氣湯組大鼠腸絨毛頂端上皮下出現(xiàn)囊狀間隙，排列尚規(guī)則，固有層與腸黏膜輕度分離，病理改變明顯減輕。分別與氧氟沙星組和模型組比較，通腑益氣湯組腸組織損傷病理學(xué)評分最低（P＜0.05）。病理結(jié)果提示，通腑益氣湯灌胃治療對膿毒癥大鼠腸道炎癥反應(yīng)具有明顯的抑制作用和對腸道良好的修復(fù)作用，可能機制為：通腑益氣湯可能通過降低膿毒癥大鼠的炎癥反應(yīng)，進而改善腸道微血管的通透性，減輕腸壁水腫，降低腸黏膜通透性，抑制腸道細菌移位和內(nèi)毒素的吸收，修復(fù)腸絨毛，抑制并減輕腸黏膜炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果表明，通腑益氣湯對膿毒癥大鼠腸黏膜的保護作用可能與其抑制TNF-α、IL-lβ的過度激活，進而下調(diào)ICAM-1的水平有關(guān)。

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（收稿：2015-12-28 修回：2016-01-18）

Effect of Tongfu Yiqi Decoction on TNF-α,IL-lβ and ICAM-1 in Rats with Sepsis

Chunlian,XU Xiujuan,MENG Jianbiao,ZHANG Wei,HU Mahong. Department of Intensive Care Unit,Tongde Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou(310012),ChinaLAI Zhizhen,JI

ObjectiveTo investigate the effects of Tongfu Yiqi decoction on serum levels of TNF-α,IL-lβ,and ICAM-1 and intestinal injury in rats with sepsis.MethodsThirty-six male SD rats were randomly divided into 3 groups:model group,ofloxacin group and Tongfu Yiqi decoction group（Chinese medicine group）,with 12 rats in each group.Sepsis model was reproduced by cecal ligation and puncture（CLP）.Ofloxacin group received ofloxacin （16mg/kg）via gastric infusion,Chinese medicine group received Tongfu Yiqi decoction（crude drug 1g/mL）with gastric infusion,once daily for 3 d,model group received an equal dose of normal saline in the same way.The serum concentrations of TNF-α,IL-lβ and ICAM-1 in each group were determined,the intestinal histopathological changes were evaluated and scored by light microscope after treatment.ResultsThe serum concentrations of TNF-α,IL-lβ and ICAM-1 in model group were 95.26±34.73ng/mL,30.83±12.32pg/mL,914.72±82.13pg/mL;those in ofloxacin group were 78.46±30.24ng/mL,24.72±10.53pg/mL,790.69±60.24pg/mL;those in Chinese medicine group were 60.38±21.81ng/mL,19.31±8.62pg/mL,681.69±52.62pg/mL;compared to other two groups,a significant decrease in those index in Chinese medicine group was noted（P＜0.05）.The scores of intestinal injury in model group, ofloxacin group,and Chinese drugs group were 4.21±0.61,3.56±0.32,2.84±0.27,respectively,with a significant difference among them（P＜0.05）.Conclusion Tongfu Qiyi decoction might suppress the release of inflammatory mediators（TNF-α,IL-lβ）and down-regulate ICAM-1 response to ameliorate the intestinal injury.

浙江省中醫(yī)藥科學(xué)研究基金項目（No.2012ZB015）

浙江省立同德醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科（杭州 310012）

胡馬洪，Tel：13819197067；E-mail：gkim12395@126.com