周煒棟楊蒙召陳 曄

·實(shí)驗(yàn)研究·

自噬在丹參酮ⅡA減輕內(nèi)毒素性急性肺損傷中的作用及相關(guān)機(jī)制研究

周煒棟1楊蒙召1陳 曄2

目的探討自噬在丹參酮ⅡA減輕內(nèi)毒素性急性肺損傷中的作用及相關(guān)機(jī)制。方法將32只SD雄性大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、丹參酮ⅡA組和3-MA組（自噬抑制組）。通過氣管內(nèi)滴入0.05%內(nèi)毒素（LPS）溶液0.02mL建立大鼠急性肺損傷模型及腹腔預(yù)注射自噬抑制劑3-MA（15mg/kg）或丹參酮ⅡA（1mL/kg·d）后摘取肺組織，免疫組化法檢測(cè)肺組織病理改變，ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-6、IL-10水平，Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ及泛素相關(guān)蛋白SQSTM1/ P62水平。結(jié)果免疫組化示模型組肺泡間隔增厚，肺泡腔狹窄，大量炎癥細(xì)胞滲出；丹參酮IIA組則明顯改善；3-MA組抑制自噬后肺泡炎癥細(xì)胞滲出明顯。與對(duì)照組比較，模型組LC3-Ⅱ灰度值明顯升高（4954.39±433.62比2408.66±250.12，P＜0.05），SQSTM1/P62灰度值下降（2316.21±274.71比4176.72±422.05，P＜0.05），炎癥因子TNF-α[（11.00±1.43）pg/mL比（3.30±0.75）pg/mL、IL-6（41.89± 8.82）pg/mL比（21.89±2.83）pg/mL、IL-10（91.34±16.94）pg/mL比（28.15±6.91）pg/mL]濃度升高（P均＜0.05）；與模型組比較，丹參酮IIA組LC3-Ⅱ灰度值顯著升高（6064.37±552.26比4954.39±433.62，P＜0.05），SQSTM1/P62灰度值下降（1233.33±143.72比2316.21±274.71，P＜0.05），炎癥因子[TNF-α （8.98±1.27）pg/mL比（11.00±1.43）pg/mL、IL-6（33.07±5.15）pg/mL比（41.89±8.82）pg/mL、IL-10 （59.76±19.25）pg/mL比（91.34±16.94）pg/mL]濃度下降（P均＜0.05）；與丹參酮IIA比較，3-MA組LC3-Ⅱ灰度值下降（1558.71±177.16比6064.37±552.26，P＜0.05），SQSTM1/P62升高（4360.06± 464.31比1233.33±143.72，P＜0.05），炎癥因子[TNF-α（11.08±1.58pg）/mL比（8.98±1.27）pg/mL、IL-6 （39.87±5.13）pg/mL比（33.07±5.15）pg/mL、IL-10（77.52±9.28）pg/mL比（59.76±19.25）pg/mL]濃度升高（P均＜0.05）。結(jié)論丹參酮ⅡA可能通過增強(qiáng)內(nèi)毒素性急性肺損傷大鼠的自噬水平，減輕內(nèi)毒素性急性肺損傷。

大鼠；自噬；丹參酮ⅡA；內(nèi)毒素；急性肺損傷；炎癥因子

內(nèi)毒素所致急性肺損傷（acute lung injury，ALI）[1]是呼吸系統(tǒng)常見的危重癥。丹參酮ⅡA是中藥丹參的主要活性成分，具有抗凝、抗炎、抗黏附作用[2]。研究[3]表明，丹參酮ⅡA對(duì)急性肺損傷具有保護(hù)作用。自噬（autophagy）是細(xì)胞內(nèi)可溶性的大分子物質(zhì)（如核酸，蛋白質(zhì)，碳水化合物和脂質(zhì)）及功能失調(diào)的細(xì)胞器（如線粒體，核糖體，過氧化物酶體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）高度保守的非特異性降解過程[4]。微管相關(guān)后自輕鏈3 （LC3）是自噬相關(guān)基因（autophagy-related gene，ATG）8表達(dá)的產(chǎn)物,分為Ⅰ型和Ⅱ型。當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，Ⅰ型經(jīng)泛素樣修飾與磷脂酰乙醇胺結(jié)合，定位于自噬體膜上，形成LC3-Ⅱ，其被認(rèn)為是自噬體的標(biāo)志分子。P62是由原癌基因c-myc編碼的蛋白，當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，P62與泛素化蛋白結(jié)合，再與自噬體膜上的LC3-Ⅱ蛋白形成復(fù)合物，并被運(yùn)送至自噬溶酶體中降解，因此，當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，P62水平下降；自噬受抑制時(shí)，P62水平增高。文獻(xiàn)[5-6]報(bào)道，自噬可以清除病理性炎癥反應(yīng)產(chǎn)物從而減輕其對(duì)細(xì)胞或細(xì)胞器的損傷。本研究探討自噬在丹參酮ⅡA減輕內(nèi)毒素性急性肺損傷中的作用及相關(guān)機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 清潔級(jí)SD大鼠32只，雄性，體質(zhì)量（210±15）g，浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：X10C2168。所有SD大鼠分籠飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格的嚙齒類食物喂養(yǎng)，自由飲水，室內(nèi)溫度控制在（21±2）℃，濕度控制在（55±2）%。

1.2 材 料 內(nèi)毒素（LPS）、3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）購自美國(guó) Sigma公司（批號(hào)20140121，20130809）；抗LC3-Ⅱ多克隆抗體購自美國(guó)Novus公司（NB600-1384）；GAPHD、SQSTM1/p62抗體購自美國(guó)CST公司（批號(hào)20131204，20130913）；TNF-α、IL-6、IL-10酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)試劑盒購自美國(guó)R&D公司（批號(hào)20140112，20131109，20131211）；丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液購自上海第一生化藥業(yè)有限公司（批號(hào)20140305）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組及模型制備 將32只實(shí)驗(yàn)用清潔級(jí)SD大鼠編號(hào)后按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為四組：正常對(duì)照組；模型組：參照文獻(xiàn)[6]方法，在大鼠氣管內(nèi)滴入0.05%的LPS溶液0.02mL；丹參酮IIA組：在內(nèi)毒素性急性肺損傷造模后連續(xù)7天給予大鼠腹腔注射1mL/（kg·d）的丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液；3-MA組（自噬抑制組）：在建立內(nèi)毒素性急性肺損傷模型前30min先給予大鼠腹腔注射15mg/kg的自噬抑制劑（3-MA），造模后連續(xù)7天再給予大鼠腹腔注射1mL/ （kg·d）的丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液。

2.2 免疫組化 4%多聚甲醛固定取下的肺組織，用梯度乙醇溶液進(jìn)行脫水后石蠟包埋，切片。二甲苯60℃ 20min脫蠟，梯度乙醇溶液水化后烘干、蘇木精-伊紅（HematoxylinEosin，HE）染色，光鏡下觀察各組大鼠肺病理組織形態(tài)學(xué)改變。

2.3 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測(cè)LC3-Ⅱ和SQSTM1/p62表達(dá) 取適量肺組織，加入液氮后在攆缽中攆成粉末，倒入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 丹參酮ⅡA及自噬對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用 免疫組化顯示，對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡結(jié)構(gòu)清晰；模型組肺泡間隔明顯增厚，肺泡腔狹窄，腔內(nèi)可見出血及大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。內(nèi)毒素LPS成功誘導(dǎo)了大鼠急性肺損傷。丹參酮ⅡA組免疫組化顯示大鼠肺泡結(jié)構(gòu)趨于正常，肺泡腔出血減少，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減輕。與丹參酮ⅡA組比較，3-MA組（自噬抑制組）各種肺損傷表現(xiàn)嚴(yán)重：肺泡腔明顯狹窄，出血增多，腔內(nèi)可見大量炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)（插頁圖1）。

3.2 四組大鼠LC3-Ⅱ、SQSTM1/P62表達(dá)量比較

蛋白免疫印跡分析自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，與對(duì)照組比較，模型組自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)量增加（P＜0.05），SQSTM1/p62表達(dá)降低（P＜0.05），自噬水平增強(qiáng)；與模型組比較，丹參酮ⅡA組LC3-Ⅱ表達(dá)量升高（P＜0.05），SQSTM1/p62明顯降低（P＜0.05），自噬水平進(jìn)一步增強(qiáng)；與丹參酮ⅡA組比較，3-MA組（自噬抑制組）LC3-Ⅱ表達(dá)量降低（P＜0.05），SQSTM1/p62表達(dá)升高（P＜0.05），自噬水平下降。見表1-2、圖2（插頁）。

3.3 四組大鼠血漿炎癥因子表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠血漿TNF-α、IL-6、IL-10表達(dá)量明顯增多（P均＜0.05）；丹參酮ⅡA組TNF-α、IL-6、IL-10表達(dá)量較模型組下降（P均＜0.05）；3-MA組（自噬抑制組）TNF-α、IL-6、IL-10表達(dá)較丹參酮ⅡA組增加（P均＜0.05）。見表3。中在冰上裂解30min，每隔10min震蕩1次，13 300r/ min離心12min后取上清液，BCA法進(jìn)行蛋白定量。樣本中加入5×loading上樣緩沖液并等體積補(bǔ)水后置于電飯鍋內(nèi)煮沸7min。每個(gè)樣本取60μg進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，跑完后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉2h，在4℃冰箱中分別孵育GAPDH、LC3-Ⅱ和SQSTM1/p62抗體過夜。TBS-T洗3次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2h，ECL法顯影并在富士LAS-4000曝光機(jī)上讀取圖像。

2.4 ELISA檢測(cè)血漿TNF-α、IL-6、IL-10水平 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)，步驟按說明書進(jìn)行。

表1 四組大鼠LC3-Ⅱ表達(dá)量比較（±s）

表1 四組大鼠LC3-Ⅱ表達(dá)量比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與丹參酮ⅡA組比較，▲P＜0.05

只數(shù)組別對(duì)照組模型組丹參酮ⅡA組3-MA組3 3 3 3 LC3-Ⅱ2408.66±250.12 4954.39±433.62* 6064.37±552.26△* 1558.71±177.16▲GAPDH 6984.45±704.34 5701.04±565.32 5577.45±585.53 8354.62±755.11 LC3-Ⅱ/GAPDH 0.345 0.869 1.087 0.186

表2 四組大鼠P62表達(dá)量比較（±s）

表2 四組大鼠P62表達(dá)量比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與丹參酮ⅡA組比較，▲P＜0.05

組別對(duì)照組模型組丹參酮ⅡA組3-MA組只數(shù)3 3 3 3 P62 4176.72±422.05 2316.21±274.71* 1233.33±143.72△4360.06±464.31▲GAPDH 6667.73±697.59 8006.09±778.38 7284.35±688.18 7407.54±783.28 P62/GAPDH 0.626 0.289 0.169 0.589

表3 各組炎癥因子表達(dá)比較（pg/mL±s）

表3 各組炎癥因子表達(dá)比較（pg/mL±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與丹參酮ⅡA組比較，▲P＜0.05

IL-10 28.15±6.91 91.34±16.94* 59.76±19.25*△77.52±9.28▲組別對(duì)照組模型組丹參酮ⅡA組3-MA組只數(shù)8 8 8 8 TNF-α 3.30±0.75 11.00±1.43* 8.98±1.27*△11.08±1.58▲IL-6 21.89±2.83 41.89±8.82* 33.07±5.15*△39.87±5.13▲

4 討論

內(nèi)毒素所致急性肺損傷的主要機(jī)制是內(nèi)毒素活化多條細(xì)胞內(nèi)的炎癥信號(hào)傳導(dǎo)通路[7]引起各種炎癥因子和炎癥介質(zhì)的過度釋放,機(jī)體促炎與抗炎反應(yīng)失平衡后大量炎癥細(xì)胞、炎癥因子和炎癥介質(zhì)聚集和浸潤(rùn)于肺部[8]，常導(dǎo)致肺血?dú)饨粨Q異常，換氣功能減退的病理過程，治療不及時(shí)可發(fā)展成為急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）[9]甚至呼吸衰竭。丹參的主要成分丹參酮ⅡA對(duì)內(nèi)毒素致炎癥細(xì)胞釋放高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein，HMGB1）[10]具有明顯的抑制作用，HMGB1一旦分泌到細(xì)胞外，即可發(fā)揮致炎作用[11]，因此丹參酮ⅡA可以通過調(diào)節(jié)促炎和抗炎因子平衡減輕炎癥介導(dǎo)的肺組織損害，在一定程度上緩解內(nèi)毒素性急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展。此外，目前認(rèn)為內(nèi)毒素的主要成分脂多糖可以誘導(dǎo)增強(qiáng)自噬水平[12]，而自噬可以通過清除已發(fā)生過度炎癥損傷或功能異常的細(xì)胞或細(xì)胞器[13]，從而保護(hù)正常的肺功能。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠肺組織與對(duì)照組相比，肺泡間隔明顯增厚，肺泡腔狹窄，腔內(nèi)可見出血及大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。免疫印跡表明，模型組自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)增強(qiáng)，SQSTM1/p62減弱，丹參酮ⅡA進(jìn)一步增強(qiáng)了急性肺損傷組織自噬水平。增強(qiáng)的自噬水平可能在丹參酮ⅡA減輕內(nèi)毒素性急性肺損傷中具有保護(hù)作用。隨后的Elisa檢測(cè)結(jié)果亦顯示丹參酮ⅡA組較模型組炎癥水平減弱，而抑制自噬炎癥表達(dá)增強(qiáng)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，丹參酮ⅡA可能通過調(diào)節(jié)炎癥水平，抑制炎癥因子、炎癥介質(zhì)的釋放[14]，減輕內(nèi)毒素性急性肺損傷的程度。自噬一方面可以降解因炎癥反應(yīng)死亡或受損的細(xì)胞或細(xì)胞器等并重新利用，以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。另一方面，自噬信號(hào)通路參與調(diào)控免疫應(yīng)答和控制過度炎癥反應(yīng)中也發(fā)揮著重要作用[15-16]：自噬通過與I型干擾素信號(hào)通路、TLR信號(hào)通路和炎性體之間的相互作用限制過度的炎性反應(yīng)，保護(hù)正常的肺組織，減輕內(nèi)毒素性急性肺損傷。

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（收稿：2015-09-10 修回：2015-12-20）

Beneficial Effects of Autophagy in Tanshinone IIA Reducing Endotoxin-induced Acute Lung Injury And Its Related Mechanisms

ZHOU Weidong1,YANG Mengzhao1,CHEN Ye2. 1Department of Respiratory Diseases,County Chinese Medical Hospital of Pingyang Zhejiang,Wenzhou(325401),China;2Department of Respiratory Diseases,Xinhua Hospital of Zhejiang,Hangzhou(310005),China

ObjectiveTo investigate the effect of autophagy in Tanshinone IIA reducing endotoxin-induced acute lung injury in rats and the underlying mechanism.MethodsThirty-two rabbits were randomly divided into 4 groups（n=8）:control group,acute lung injury model group,tanshinone IIA group,and autophagy inhibition group. Except for control group,rats in other groups were intratracheally given 0.02 mL of 0.05%lipopolysaccharide to establish the model of acute lung injury,then tanshinone IIA group and autophagy inhibition group were treated with intraperitoneal injection of tanshinone IIA（1mL·kg-1·d-1）and autophagy inhibitor 3-MA（15mg/kg）,respectively.After the treatment,lung tissue in each group were extracted for immunohistochemistry and the detection of TNF-α,IL-6,and IL-10 with ELISA and the measurement of autophagy related protein LC3-II and SQSTM1/P62 with Western blotting.ResultsHistopathologic examination showed edematous changes of thickening of alveolar walls, narrowed alveolar,and massive polymorphonuclear infiltration in model group.These changes in tanshinone IIA group were significantly alleviated,however,after 3-MA inhibited autophagy,obvious polymorphonuclear infiltration were observed.Compared with control group,the level of autophagy associated protein LC3-Ⅱincreased（4954.39± 433.62 vs 2408.66±250.12,P＜0.05）and SQSTM1/P62 decreased（2316.21±274.71 vs 4176.72±422.05,P＜0.05）and the levels of TNF-α（11.00±1.43pg/mL vs 3.30±0.75pg/mL）,IL-6（41.89±8.82pg/mL vs 21.89±2.83pg/mL）,IL-10 （91.34±16.94pg/mL vs 28.15±6.91pg/mL）increased in acute lung injury model group（all P＜0.05）.After the treatment of tanshinone IIA,the level of LC3-Ⅱ increased（6064.37±552.26）,SQSTM1/P62 decreased（1233.33±143.72）and the levels of TNF-α（8.98±1.27pg/mL）,IL-6（33.07±5.15pg/mL）,and IL-10（59.76±19.25pg/mL）decreased （compared with acute lung injury model group,all P＜0.05）.However,compared with tanshinone IIA group,the level of LC3-Ⅱin autophagy inhibition group decreased（1558.71±177.16）,SQSTM1/P62 increased（4360.06±464.31）, and the levels of TNF-α（11.08±1.58pg/mL）,IL-6（39.87±5.13pg/mL）,IL-10（77.52±9.28pg/mL）increaesed（all P＜0.05）.ConclusionTanshinone IIA can enhance the level of autophagy in endotoxin-induced acute lung injury,resulting in reduction of the injury.

rats;autophagy;tanshinone IIA;endotoxin;acute lung injury;inflammatory cytokines

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（No.81302935）

1浙江省平陽縣中醫(yī)院呼吸內(nèi)科（溫州 325401）；2浙江省新華醫(yī)院呼吸內(nèi)科（杭州 310005）

陳曄，Tel：13588489515；E-mail：chenye1375@sina.com