楊光勇，郭海濤，劉茜明，何光志

(貴陽中醫(yī)學院，貴陽550002)

scFv-LAA0融合蛋白的制備及對人肺腺癌細胞H460、小鼠肺腺癌增殖抑制作用觀察

楊光勇，郭海濤，劉茜明，何光志

(貴陽中醫(yī)學院，貴陽550002)

目的 制備重組抗白介素4受體(IL-4R)單鏈抗體基因與竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶(LAAO)的融合蛋白(scFv-LAAO融合蛋白)，并觀察其對人肺腺癌細胞H460、小鼠肺腺癌增殖抑制作用。方法 ①采用重疊延伸PCR技術將抗IL-4R單鏈抗體與竹葉青蛇毒LAAO基因連接成scFv-LAAO融合基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-scFv-LAAO，轉(zhuǎn)染BL21(DE3)原核表達菌，誘導表達scFv-LAAO融合蛋白，用SDS-PAGE法檢測scFv-LAAO融合蛋白的分子量，用Western blotting法檢測scFv-LAAO融合蛋白的His-tag表達。②設空白對照組、環(huán)磷酰胺組和融合蛋白組(包括高、中、低劑量融合蛋白組)，分別用培養(yǎng)基、2.0 mg/mL環(huán)磷酰胺及4.0、2.0、1.0 mg/mL的scFv-LAAO融合蛋白培養(yǎng)人肺腺癌H460細胞，用MTT法測算環(huán)磷酰胺組和高、中、低劑量融合蛋白組細胞增殖抑制率。取75只小鼠，建立荷肺腺癌動物模型，隨機分為空白對照組、環(huán)磷酰胺組和融合蛋白組(包括高、中、低劑量融合蛋白組)，分別腹腔注射生理鹽水、0.1 mL/10 g體質(zhì)量的環(huán)磷酰胺和100、50和20 mg/kg的scFv-LAAO融合蛋白，1次/d，連用10 d后停藥，停藥7 d后稱量各組小鼠瘤重，計算環(huán)磷酰胺組和高、中、低各劑量融合蛋白組抑瘤率；同時統(tǒng)計存活時間。結(jié)果 scFv-LAAO融合基因長度2 000～3 000 bp。用融合基因轉(zhuǎn)染BL21(DE3)原核表達菌后，將細菌裂解從裂解液中分離出的蛋白分子量86 kD，與scFv-LAAO融合蛋白分子量相符，且用Western blotting法在分離到的蛋白中檢出scFv-LAAO融合蛋白組氨酸標簽。環(huán)磷酰胺組和高劑量融合蛋白組人肺腺癌H460細胞增殖抑制率、小鼠抑瘤率和生存時間相比，P均>0.05；環(huán)磷酰胺組和高劑量融合蛋白組H460細胞增殖抑制率、小鼠抑瘤率和生存時間高于低、中劑量融合蛋白組，P均<0.05；低劑量融合蛋白組H460細胞增殖抑制率、小鼠抑瘤率和生存時間低于中劑量融合蛋白組，P均<0.05。結(jié)論 成功制備scFv-LAAO融合蛋白。scFv-LAAO融合蛋白可以抑制人肺腺癌細胞H460、小鼠肺腺癌增殖。

抗白介素4受體單鏈抗體；竹葉青蛇毒LAAO；白細胞肺腫瘤；肺腺癌；細胞增殖

竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶(LAAO)對多種癌細胞具有直接殺傷和誘導調(diào)亡的作用，但對正常細胞也有殺傷作用[1]；白介素4受體(IL-4R)在癌細胞上特異性過度表達，是抗癌藥物作用的良好靶標[2]。構(gòu)建抗IL-4R單鏈抗體與竹葉青蛇毒LAAO的融合蛋白，有助于實現(xiàn)竹葉青蛇毒LAAO對腫瘤細胞的特異性殺傷。目前尚未有構(gòu)建抗IL-4R單鏈抗體與竹葉青蛇毒LAAO的融合蛋白，并將其用于靶向治療肺腺癌的相關報道。本研究采用分子生物學手段將編碼抗IL-4R單鏈抗體片段基因(scFv)和編碼竹葉青蛇毒LAAO的基因構(gòu)建成復合基因scFv-LAAO，插入載體pET-28a使BL21(DE3)原核表達菌表達融合蛋白，并觀察scFv-LAAO融合蛋白對人肺腺癌細胞H460、小鼠肺腺癌增殖抑制作用。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 E.coli BL21(DE3)由本實驗室保存。pET-28a由上海英駿生物公司提供。Anti-6×His tag抗體 (HRP)與Rabbit anti-mouse antibody購自Abcam公司?？敲顾刭徸员本┧魅R寶生物科技有限公司，XhoⅠ內(nèi)切酶與EcoRⅠ內(nèi)切酶購自美國Thermo Scientific公司。SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、考馬斯亮藍R250與ECL Plus熒光檢測試劑ECL超敏發(fā)光液、蛋白Marker PR1800、4×蛋白上樣緩沖液 購自北京索萊寶生物科技有限公司。PVDF膜購自Millipore公司；健康昆系小鼠(4～6周齡、體質(zhì)量18～20 g、雄性、清潔級)和人肺腺癌細胞株H460購自中科院生物化學與細胞生物學研究所。

1.2 scFv-LAAO融合蛋白的制備

1.2.1 竹葉青蛇毒LAAO基因設計與合成 竹葉青蛇毒LAAO基因序列已在之前的實驗中得到，見參考文獻[3]，在LAAO序列5′端加上帶有一段與抗IL-4R單鏈抗體scFv基因序列相同的重疊序列(40 bp)以及一段連接肽基因，另外在重疊序列-linker-LAAO基因序列的3′端加上XhoⅠ酶切位點。

1.2.2 引物設計 設計引物F1和引物F2去除抗IL-4R單鏈抗體scFv基因序列的Xho I酶切位點；設計引物F1和F3，通過重疊延伸RCR(SOE-PCR)技術連接抗IL-4R單鏈抗體(scFv)與竹葉青蛇毒LAAO基因成融合基因scFv-LAAO。委托上海英俊生物公司合成的引物序列如下：引物F1：5′-GAATTCATGGCCCAGGTCCAGCT-3′；引物F2：5′-GCTGAAACGGGCGGCCGCAGAA-3′；引物F3：5′-ATGACGATGAACTTTAACTCGAG-3′。

1.2.3 scFv與竹葉青蛇毒LAAO基因的連接 參考文獻[4]方法制備scFv基因，其5′端帶有EcoRⅠ酶切位點。與LAAO連接之前用引物F1、F2去除XhoⅠ酶切位點，反應體系參照參考文獻[5]。scFv與LAAO的SOE-PCR反應體系參照參考文獻[5]，PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳并用膠回收試劑盒回收基因片段。

1.2.4 pET-28a載體/scFv-LAAO基因片段的雙酶切與目的片段回收 反應體系參照參考文獻[5]，雙酶切體系按照限制性內(nèi)切酶XhoⅠ與EcoRⅠ說明書操作。取酶切得到的scFv-LAAO基因片段進行1%瓊脂糖凝膠電泳分別回收目的片段。按照同樣方法對pET-28a載體進行雙酶切和回收目的片段。

1.2.5 重組質(zhì)粒pET-28a-scFv-LAAO的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化 按照快速DNA連接試劑盒說明書連接pET-28a-scFv-LAAO融合基因，反應體系參照其說明書。參照《分子克隆實驗指南》[6]，將pET-28a重組質(zhì)粒scFv-LAAO導入E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞，復蘇后進行培養(yǎng)。

1.2.6 重組質(zhì)粒酶切鑒定鑒定 挑取10個單菌落用裝有15 mL的TB培養(yǎng)液(卡那霉素50 μg/mL)的100 mL培養(yǎng)瓶中，于37 ℃環(huán)境下震蕩培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8，用高純質(zhì)粒小量制備試劑盒提取質(zhì)粒。先后用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ對該質(zhì)粒進行雙酶切鑒定；將成功酶切的質(zhì)粒送上海英駿生物公司測序，利用DNA Star7.10軟件對測序結(jié)果進行蛋白質(zhì)氨基酸序列翻譯，并對翻譯結(jié)果進行預測分析。

1.2.7 重組毒素scFv-LAAO抗體蛋白的誘導表達 以參考文獻[7,8]及Novagen公司的pET系統(tǒng)操作手冊為指導。挑取平板上的單個菌落接種至裝有10 mL的TB培養(yǎng)基(含卡那霉素50 μg/mL)的50 mL錐形瓶中于37 ℃ 振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6， 加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，于37 ℃ 快速振蕩培養(yǎng)誘導重組蛋白表達3 h。

1.2.8 scFv-LAAO融合蛋白鑒定 以參考文獻[8]為指導，將誘導重組蛋白表達3 h的菌體裂解并離心，將上清液和沉淀溶解液分別進行SDS-PAGE分析。確定為可溶性表達后，取100 μL上清液取加入20 μL的4×蛋白上樣緩沖液(含DTT)混合，于沸水中加熱使蛋白變性，冷卻至常溫后進行離心，取上清液用SDS-PAGE方法分離樣品中的蛋白。進行考馬斯亮藍染色檢測所得蛋白分子量并用Western blotting法檢測 scFv-LAAO融合蛋白組氨酸標簽。

1.3 不同濃度scFv-LAAO融合蛋白培養(yǎng)的人肺腺癌H460細胞增殖情況觀察 采用MTT法。用低血清RPMI1640 培養(yǎng)基將培養(yǎng)的人肺腺癌細胞株H460稀釋至(1～2)×105/mL，每孔 100 μL接種于 96 孔培養(yǎng)板，在5%的CO2濃度培養(yǎng)箱中于37 ℃培養(yǎng)至細胞貼壁后棄培養(yǎng)液。設空白對照組、環(huán)磷酰胺組和融合蛋白組(包括高、中、低劑量融合蛋白組，分別加入含scFv-LAAO融合蛋白RPMI1640培養(yǎng)基用低終濃度為4.0、2.0、1.0 mg/mL)?？瞻讓φ战M加入等量的RPMI1640 培養(yǎng)基。每組每個濃度設3個平行孔，培養(yǎng)4 h取出培養(yǎng)板，每孔加入50 μL的MTT(1 mg/mL), 4 h后棄MTT，加入DMSO 100 μL/孔溶解formazan結(jié)晶。環(huán)磷酰胺組用藥劑量終濃度為2.0 mg/mL，處理方法同融合蛋白組。用酶標儀檢測各組每孔的OD490值，根據(jù)OD490值各組增殖抑制率。增殖抑制率(%)=[(對照組OD值-藥物作用組OD值)/對照組OD值] ×100%。

1.4 不同濃度scFv-LAAO融合蛋白腹腔注射后荷人肺腺癌小鼠的抑瘤率和存活時間觀察 將75只健康昆系小鼠動物隨機分為空白對照組、環(huán)磷酰胺組和融合蛋白組(包括高、中、低劑量融合蛋白組)，每組15只。將人肺癌H460細胞復蘇后進行培養(yǎng)，調(diào)整活細胞數(shù)至1×106/mL，在小鼠右腋下注射接種0.2 mL/只，3周后荷瘤肺癌小鼠出現(xiàn)腫塊。高、中、低劑量融合蛋白組小鼠腹腔注射scFv-LAAO融合蛋白100、50和20 mg/kg；環(huán)磷酰胺組腹腔注射環(huán)磷酰胺10 mg/kg，用量為0.1 mL/10 g體質(zhì)量。各組每天給藥1次，連續(xù)10 d。停藥第7 d后，每組處死5只小鼠，剖取瘤塊進行稱重。腫瘤抑制率(%)=(對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100%。余下小鼠停藥后，繼續(xù)觀察小鼠存活天數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 scFv-LAAO融合蛋白的構(gòu)建結(jié)果 對通過SOE-PCR連接的scFv-LAAO基因進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果在2 000～3 000 bp有一條明顯的條帶，與預期2 355 bp長度相似，表明scFv與LAAO兩段基因連接成功。用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和EcoRⅠ對重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，1%瓊脂糖凝膠進行電泳后在2 000～3 000 bp有一條明顯的條帶，符合插入的scFv-LAAO片段大小。將成功酶切的質(zhì)粒送上海英駿生物公司測序，通過Geneious9.1.2軟件分析scFv-LAAO序列共計2 355 bp，利用DNA Star7.10軟件對測序結(jié)果進行蛋白質(zhì)氨基酸序列翻譯，結(jié)果scFv-LAAO序列能編碼785個氨基酸，蛋白分子量在86 kD左右?？捡R斯亮藍染色結(jié)果表明分離到的蛋白以可溶性形式表達，分子量為86 kD。Western blotting法檢測到分離到的蛋白的scFv-LAAO融合蛋白組氨酸標簽。

2.2 各組人肺腺癌H460細胞增殖抑制率比較 環(huán)磷酰胺組和低、中、高劑量融合蛋白組人肺腺癌H460細胞增殖抑制率分別為55.29%±0.83%、25.88%±0.57%、52.35%±0.57%、59.41%±0.57%，環(huán)磷酰胺組和高劑量融合蛋白組H460細胞增殖抑制率相比，P>0.05；環(huán)磷酰胺組和高劑量融合蛋白組H460細胞增殖抑制率高于低、中劑量融合蛋白組，P均<0.05；低劑量融合蛋白組H460細胞增殖抑制率低于中劑量融合蛋白組，P均<0.05。

2.3 各組小鼠的抑瘤率和存活時間比較 環(huán)磷酰胺組和低、中、高劑量融合蛋白組小鼠抑瘤率和存活時間見表1。環(huán)磷酰胺組和高劑量融合蛋白組小鼠抑瘤率、存活時間相比，P均>0.05；環(huán)磷酰胺組和高劑量融合蛋白組抑瘤率、存活時間高于低、中劑量融合蛋白組，P均<0.05；低劑量融合蛋白組抑瘤率、存活時間低于中劑量融合蛋白組，P均<0.05。

表1 環(huán)磷酰胺組和低、中、高劑量融合蛋白組小鼠抑瘤率和存活時間比較±s)

3 討論

將兩段基因連接形成新的融合基因最常用的和效果最好的方法為SOE-PCR，這項技術在醫(yī)學和分子生物學研究等領域得到廣泛應用[9～11]。SOE-PCR的主要原理是用PCR方法將兩段基因擴增出一段長約40 bp的堿基序列重疊區(qū)，再通過兩段基因的上、下游引物進行連接與擴增[12～14]。因竹葉青蛇毒LAAO基因是由人工合成的，故在LAAO基因的5′端設計了與scFv的3′端的重疊區(qū)，作為兩段基因的連接橋梁，同時在基因序列3′端加上了XhoⅠ酶切位點，還加上了一條連接肽保證蛋白形成時正確空間折疊。以上修改簡化了SOE-PCR的操作過程和引物設計，其中40 bp堿基序列重疊區(qū)的長度有利于兩段基因的成功連接[14]。scFv對腫瘤組織的穿透力強，可以與其他效應分子連接成抗腫瘤融合蛋白等特點，是保持抗體親和性和特異性的最小功能性抗體片段[15,16]，廣泛應用于醫(yī)學和生物技術研究領域。本研究結(jié)果顯示，IL-4R單鏈抗體與scFv-LAAO融合基因長度2 000～3 000 bp。用融合基因轉(zhuǎn)染BL21(DE3)原核表達菌后，從細菌培養(yǎng)液上清中分離出的蛋白分子量86 kD，與scFv-LAAO融合蛋白分子量相符，且用Western blotting法在分離到的蛋白中檢出scFv-LAAO融合蛋白組氨酸標簽。表明我們成功將scFv與竹葉青蛇毒LAAO基因通過SOE-PCR技術進行連接，用pET28a載體搭載scFv-LAAO融合基因，最后利用BL21(DE3)表達菌表達出了scFv-LAAO融合蛋白。

研究表明，蛇毒中的LAAO是一種有潛力的抗腫瘤制劑，將其開發(fā)為一種新型的抗腫瘤藥具有廣闊的臨床應用前景[3,17]。張玉潔等[18]分離純化竹葉青蛇毒LAAO，發(fā)現(xiàn)其具有誘導癌細胞凋亡和抗菌作用；重組竹葉青蛇毒LAAO對腫瘤細胞有顯著的增殖抑制殖作用[1]。然而，竹葉青蛇毒LAAO對腫瘤殺傷作用沒有選擇性。而IL-4R在癌細胞上特異性過度表達，是抗癌藥物的良好靶標[2]。因此，本研究結(jié)合兩者的特性，制備了scFv-LAAO融合蛋白，并觀察其體內(nèi)外抗癌作用。本研究結(jié)果顯示，環(huán)磷酰胺組和高劑量融合蛋白組H460細胞增殖抑制率、小鼠抑瘤率和生存時間高于低、中劑量融合蛋白組；低劑量融合蛋白組H460細胞增殖抑制率、小鼠抑瘤率和生存時間低于中劑量融合蛋白組。表明scFv-LAAO融合蛋白在體內(nèi)外均有抗肺腺癌作用。筆者認為scFv-LAAO融合蛋白的抗癌機制為，通過其抗IL-4R單鏈抗體svFv部分選擇性結(jié)合腫瘤細胞上的IL-4R，并通過竹葉青蛇毒LAAO部分發(fā)揮殺傷腫瘤細胞的作用。scFv-LAAO融合蛋白具有一定抗腫瘤作用，可進一步研究其作用機制與效果，開發(fā)新型的抗癌藥或診斷試劑。scFv-LAAO融合蛋白相比目前市場上的單克隆抗體，對抗原的親和力高，分子量小,細胞膜穿透力強，易滲透腫瘤組織，抗原性弱，排異反應小。本研究為開發(fā)利用scFv-LAAO融合蛋白提供實驗依據(jù)，為進一步研制新型的抗腫瘤藥物打下了良好的基礎。

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Preparation of scFv-LAAO fusion protein and its anti-proliferative effect on human lung adenocarcinoma H460 cells and mouse lung adenocarcinoma cells

YANGGuangyong,GUOHaitao,LIUQianming,HEGuangzhi

(GuiYangCollegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang550002,China)

Objective To prepare the fusion protein of recombinant anti-interleukin-4 receptor (IL-4R) single antibody gene and Trimeresurus stejnegeri venom L-amino acid oxidase (LAAO) gene (scFv-LAAO fusion protein), and then to observed its anti-proliferative effect on human lung adenocarcinoma H460 cells and mouse pulmonary adenocarcinoma cells. Methods ① We connected IL-4R scFv gene and LAAO gene to make the scFv-LAAO fusion gene by splicing overlapping extension PCR (SOE-PCR), constructed the pET28a-scFv-LAAO recombinant plasmid, and then used the plasmid to transfect the BL21(DE3) prokaryotic expression bacterium and induced it to express the scFv-LAAO fusion protein. The molecular weight of scFv-LAAO fusion protein was detected by SDS-PAGE, and the expression of His-tag of scFv-LAAO fusion protein was detected by Western blotting. ② Setting the control group, cyclophosphamide group and fusion protein group (including high-dose group, medium-dose group and low-dose group), and in the six groups we separately cultured the human lung adenocarcinoma cells H460 with cell culture medium, cyclophosphamide (2.0 mg/mL), and scFv-LAAO fusion protein (4.0, 2.0 and 1.0 mg/mL). We detected and calculated the inhibition rates of cell proliferation of the cyclophosphamide group and fusion protein group (high-dose group, medium-dose group and low-dose group) by MTT. Seventy-five mice were selected to establish the animal models of lung adenocarcinoma, and then were randomly divided into the control group, cyclophosphamide group and fusion protein group (including high-dose group, medium-dose group and low-dose group), and the six groups were separately given physiological saline, cyclophosphamide (0.1 mL/10g), scFv-LAAO fusion protein (100, 50 and 20 mg/kg) through intraperitoneal injection once per day for 10 days. Seven days after drug withdrawal, we weighed the mice of each group, calculated the anti-tumor rate of cyclophosphamide group, high-dose group, medium-dose group and low-dose group of fusion protein, at the same time we recorded the survival time of statistics. Results The length of scFv-LAAO fusion gene was 2 000～3 000 bp. After the prokaryotic expression bacterium BL21(DE3) was transfected by the fusion gene, the fusion protein scFv-LAAO was extracted from the supernatant of bacteria lysate, and its molecular weight was about 86 kD, which coincided with scFv-LAAO fusion protein, and the His-tag of scFv-LAAO fusion protein was detected by Western bloting. No significant difference was found in the cell proliferation inhibition rate, anti-tumor rate and survival time of human lung adenocarcinoma H460 cells between the cyclophosphamide group and high-dose fusion protein group (allP>0.05). The cell proliferation inhibition rate, anti-tumor rate and survival time of human lung adenocarcinoma H460 cells of the cyclophosphamide group and high-dose fusion protein group was higher than that of the medium-dose and low-dose fusion protein groups (allP<0.05). Meanwhile, the cell proliferation inhibition rate, anti-tumor rate and survival time of the low-dose group was lower than that of the medium-dose group (allP<0.05).Conclusion The scFv-LAAO fusion protein is successfully prepared, and ScFv-LAAO fusion protein can inhibit the proliferation of human lung adenocarcinoma H460 cells and mouse lung adenocarcinoma cells.

anti-interleukin-4 receptor single antibody; Trimeresurus stejnegeri venom L-amino acid oxidase; lung neoplasms; pulmonary adenocarcinoma; cell proliferation

貴州省社會發(fā)展科技攻關項目(20113020)；貴州省科學技術基金資助項目(20122075)；貴州省委組織部高層次人才科研條件

特助經(jīng)費資助項目(TZJF201128);貴州省教育廳創(chuàng)新群體重大研究項目(201636)。

楊光勇(1988-)，男，碩士，助理實驗師，主要研究方向為分子生物學。E-mail: 768305874@qq.com

簡介：何光志(1977-)，男，博士，教授，碩士生導師，主要研究方向為中西醫(yī)結(jié)合基礎。E-mail: heguangzhi7711@sina.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.47.002

R392.11;Q789;Q939.48

A

1002-266X(2016)47-0004-05

2016-07-11)