侯 艷，朱子成，朱娜娜，陳克農(nóng)，欒非時(shí)，王學(xué)征*

(1 農(nóng)業(yè)部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150030；2 東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，哈爾濱150030)

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EMS誘變西瓜突變體庫(kù)的構(gòu)建及表型分析

侯 艷1,2，朱子成1,2，朱娜娜1,2，陳克農(nóng)1,2，欒非時(shí)1,2，王學(xué)征1,2*

(1 農(nóng)業(yè)部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150030；2 東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，哈爾濱150030)

采用1.0%誘變劑甲基磺酸乙酯(EMS)處理西瓜品系W1-17種子9 h，然后對(duì)M1和M2代群體單株在葉、花、莖、育性、分支習(xí)性等方面進(jìn)行表型變異觀察，同時(shí)選取M2代典型變異株系，利用23對(duì)西瓜SSR引物進(jìn)行分析鑒定，構(gòu)建西瓜突變體庫(kù)。結(jié)果表明：(1)EMS誘變使M1代幼苗形態(tài)呈現(xiàn)出葉畸形、葉褶皺、部分黃化、花畸形、雄花不散粉、卷須畸形、矮小、生長(zhǎng)緩慢、不育等特異性狀，獲得由1 252個(gè)單株組成的西瓜突變體M1群體，群體總變異頻率為18.33%。(2)M2代共篩選到205個(gè)突變植株，40種表型變異，表現(xiàn)在子葉性狀(黃化、扭曲不對(duì)稱、折疊等)、葉和莖性狀(葉黃化、變小、裂刻變深，莖變細(xì)，節(jié)間變短，分支少等)、花性狀(花變大，花色變淺，兩性花，花瓣皺縮、部分退化、數(shù)目突變，柱頭畸形，雄蕊不成熟等)和其他性狀(生長(zhǎng)緩慢、不育等)等方面，總的表型突變率達(dá)到了19.59%。(3)針對(duì)M2代10個(gè)典型變異植株，通過(guò)SSR引物分析發(fā)現(xiàn)有9份材料在DNA水平上有變異。本研究初步構(gòu)建了含有120個(gè)M1代家系及1 051株M2代植株、40種表型變異的西瓜突變體庫(kù)。

西瓜；甲基磺酸乙酯誘變；突變體庫(kù)；SSR

西瓜(Citrulluslanatus)是重要的園藝作物，具有很高的食用價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。中國(guó)是世界上西瓜種植面積最大的國(guó)家，西瓜生產(chǎn)地位不斷上升，選育具有優(yōu)異性狀的品種是提高生產(chǎn)水平和效益的根本[1]。西瓜起源于非洲，原本是野生物種，后來(lái)經(jīng)人為馴化為可食性西瓜。但在長(zhǎng)期的育種過(guò)程中，人為選擇目標(biāo)性狀導(dǎo)致遺傳基礎(chǔ)狹窄。目前，研究者們已經(jīng)把眼光從傳統(tǒng)育種轉(zhuǎn)移到種質(zhì)資源創(chuàng)新中，希望找到西瓜自身不具備的優(yōu)良性狀。近幾年的研究顯示，通過(guò)輻射誘變、太空誘變和自然突變等獲得突變植株，從而進(jìn)行重要基因挖掘，加快了西瓜種質(zhì)資源的創(chuàng)新進(jìn)程[2-5]。

目前，繼模式植物擬南芥全基因組測(cè)序成功之后，番茄[6]、黃瓜[7]、西瓜[8]、甜瓜[9]、甘藍(lán)[10]、油菜[11]等作物全基因組測(cè)序也相繼完成，從中獲得了大量的基因組序列，但卻不知其功能，因此利用生物信息學(xué)手段對(duì)物種間的同源序列進(jìn)行比較分析研究，促使基因組學(xué)研究迅速進(jìn)入后基因組學(xué)時(shí)代，其著重研究的內(nèi)容是對(duì)目標(biāo)性狀基因的挖掘與功能鑒定。具體來(lái)說(shuō)，研究者們著重研究植物各個(gè)基因的功能，進(jìn)一步挖掘它們?cè)谥参锏纳L(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中是如何協(xié)作的。通過(guò)逐一分析寡基因和多基因的突變表型以及不同基因在“時(shí)空隧道”中的表達(dá)，從而準(zhǔn)確地鑒定每個(gè)基因的功能以及它們之間的互作關(guān)系[12]。因此，少數(shù)自然基因突變植株早已不能滿足蔬菜遺傳育種的研究要求，最大限度地涵蓋全基因組突變體庫(kù)的創(chuàng)建和應(yīng)用已成為基因功能研究最高效的方法之一。

與其他誘變方法相比，化學(xué)誘變因其低成本、易操作、高專一性，產(chǎn)生點(diǎn)突變頻率高, 而出現(xiàn)染色體畸變頻率低等特點(diǎn)，所以其應(yīng)用最為普遍[13]。與其他化學(xué)誘變劑相比，雖然甲基磺酸乙酯(EMS) 誘變也產(chǎn)生一定比例染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)量方面的雙重變異，但其重點(diǎn)是產(chǎn)生由單一堿基對(duì)變化所形成的點(diǎn)突變。因?yàn)樵贒NA 水平上發(fā)生變化，在植物體上出現(xiàn)原來(lái)未出現(xiàn)的性狀，可能是由原有等位基因的變異導(dǎo)致的。并且EMS誘導(dǎo)形成的突變體多為顯性突變，因此對(duì)突變體篩選的操作更為簡(jiǎn)單。在蔬菜遺傳育種研究中，EMS被證明是效率高且負(fù)面作用小、使用范圍最廣的誘變劑[14]。EMS無(wú)論從突變類型還是突變率來(lái)講，都是構(gòu)建突變體庫(kù)的最佳誘變劑。目前，油菜[15]、小麥[16]、水稻[17]、大豆[18]、番茄[19]、黃瓜[20]、甜瓜[21]等植物EMS 突變體庫(kù)均已成功構(gòu)建，它們?cè)谟N及其功能基因組研究中發(fā)揮了重要作用。

創(chuàng)建突變體庫(kù)篩選突變體可以為西瓜育種提供新的種質(zhì)材料，從而推進(jìn)西瓜種質(zhì)創(chuàng)新。本研究以東北農(nóng)業(yè)大學(xué)西甜瓜育種研究室自育的西瓜品系W1-17為材料，以EMS 為誘變劑，處理西瓜W1-17種子以創(chuàng)建突變體庫(kù)，調(diào)查M1和M2代植株主要農(nóng)藝性狀，初步篩選突變體，進(jìn)行突變表型鑒定和分析，為進(jìn)一步構(gòu)建西瓜突變體庫(kù)、拓寬西瓜資源遺傳背景和開(kāi)展西瓜功能基因組學(xué)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

供試西瓜材料W1-17由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院西甜瓜研究室提供的高代自交系，果肉紅色、肉質(zhì)脆嫩、口感極佳且具有早熟和適應(yīng)性廣等特點(diǎn)。誘變劑甲基磺酸乙酯(EMS)購(gòu)于美國(guó) Sigma 公司，為無(wú)色溶液(區(qū)別于其公司生產(chǎn)的固體 EMS 誘變劑)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子誘變處理 EMS處理西瓜種子最佳濃度和時(shí)間的確定參照前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[2]，處理過(guò)程如下：將 W1-17西瓜種子用指甲刀磕口后，100粒為1個(gè)處理；在通風(fēng)櫥中浸入20 mL濃度1.0%EMS中，然后在28 ℃的搖床上震蕩9 h；浸種結(jié)束后，在通風(fēng)櫥中每個(gè)處理加入 1 mol/L 硫代硫酸鈉(Na2S2O3)10 mL，混勻后，將溶液倒掉；然后再加入 20 mL 100 mmol/L硫代硫酸鈉(Na2S2O3)，輕搖 5 min，將溶液倒掉，再用100 mmol/L Na2S2O3洗3遍；加入20 mL 蒸餾水輕搖5 min，將溶液倒掉，用水洗 3 遍；將處理完畢的種子平鋪在濕潤(rùn)濾紙上，稍干后，在 28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行催芽。

1.2.2 M1代試驗(yàn)設(shè)計(jì) 2013年5月，將處理后的種子播種于園藝實(shí)驗(yàn)中心溫室試驗(yàn)田內(nèi)，出苗后記為Ml代植株。定植前統(tǒng)計(jì)成活株數(shù)，觀察Ml代的各種農(nóng)藝性狀，標(biāo)記后拍照記錄，6月份自交授粉，8月份收瓜留種。

1.2.3 M2代試驗(yàn)設(shè)計(jì) 2014年3月，從M1代收獲的種子中挑選部分進(jìn)行培育，每份種子培育出的植株為1個(gè)M2代株系，各在試驗(yàn)田種10株單株，不足10株的定植所有成活苗，收獲的種子收入種子庫(kù)。M2代出苗后將野生型作為對(duì)照，觀察、記錄西瓜生長(zhǎng)情況和突變情況，計(jì)算突變頻率。在此期間，記錄典型的性狀變異材料。2014年8月按單株收獲并保存種子于種子庫(kù)。

突變頻率=突變株數(shù)/成活總株數(shù)×100%。

1.2.4 M3代試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將具有典型變異性狀的M2代材料單株收獲后留種，取不同變異單株種子在室內(nèi)種植，提取幼苗DNA用于SSR分子檢測(cè)。DNA提取參照Saghai-Maroof等[22]方法，略作修改。選用Zhang等[23]發(fā)表的西瓜核心引物23對(duì)，由金唯智有限公司合成。西瓜SSR-PCR反應(yīng)體系及程序參考盛云燕等[24]和張法惺等[25]略有改動(dòng)。PCR反應(yīng)總體系為20 μL，PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PE-9600型和TGRADIENT型PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行。反應(yīng)體系組成為：模板DNA(30 ng/μL)1 μL，引物(2 μmol/L)2 μL，10×Buffer(含Mg2+15 mmol/L)2 μL，dNTPs(10 mmol/L)0.3 μL，Taq酶(2 U/μL)0.2 μL，無(wú)菌去離子水14.5 μL，總體積20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 1 min，48 ℃復(fù)性 1 min，72 ℃延伸 90 s，38 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min；4 ℃ 保存。PCR完成后，將PCR產(chǎn)物同3 μL 10×Buffer離心混合后，置于4 ℃冰箱冷卻待用。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，統(tǒng)計(jì)不同突變類型與野生型間的譜帶差異。

1.3 性狀調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)與數(shù)據(jù)處理

西瓜性狀調(diào)查參照《西瓜種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[26]。數(shù)據(jù)處理使用DPS(Vol. 7.05)統(tǒng)計(jì)軟件完成，采用Microsoft Excel 2003 軟件進(jìn)行平均值和作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 EMS誘變西瓜突變體庫(kù)的構(gòu)建及突變體表型分析

2.1.1 M1群體突變表型篩選 將經(jīng)過(guò)EMS處理過(guò)的西瓜W1-17種子播種于溫室，最終獲得了由1 252個(gè)單株組成的西瓜突變體庫(kù)M1群體。對(duì)M1群體單株全生育期的主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行了調(diào)查和分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EMS誘變不僅抑制和延遲了西瓜W1-17種子的發(fā)芽和成苗[2]，同時(shí)對(duì)M1代幼苗形態(tài)產(chǎn)生影響，使之呈現(xiàn)出一些特異性狀，野生型植株生長(zhǎng)正常，葉片裂刻中等，雌雄異花同株(圖1,10～12)。而M1代植株則出現(xiàn)了葉畸形、葉褶皺、部分黃化、雌花出現(xiàn)雄蕊、雄花無(wú)花粉、卷須畸形、植株矮小、生長(zhǎng)緩慢、不育等特異性狀(圖1,1～9)，突變率為18.33%。M1單株人工自交授粉，成熟期單株收獲，共得到種子120份。

2.1.2 M2群體突變表型篩選 M1代共得到120份種子，每份種子為1個(gè)株系，M2代得到了含有120個(gè)株系和1 051個(gè)單株的突變體庫(kù)，共篩選到205個(gè)突變植株，40種表型變異。在植株生長(zhǎng)過(guò)程中，經(jīng)過(guò)觀察，在植株主要的農(nóng)藝性狀和生物性狀上均發(fā)現(xiàn)了突變體，這些性狀主要有：子葉黃化、子葉扭曲不對(duì)稱、子葉折疊等(圖2)；葉黃化、葉變小、葉裂刻變深、莖變細(xì)、節(jié)間變短、分支少等(圖3)；花變大、花色變淺、兩性花、花瓣皺縮、花瓣部分退化、雄蕊數(shù)目增多、柱頭畸形、雄蕊不成熟等(圖4)；還有整株生長(zhǎng)緩慢、不育，總的表型突變率達(dá)到了19.59%(表1)。

2.1.3 EMS對(duì)西瓜W1-17的變異效應(yīng) 經(jīng)過(guò)EMS誘變后，與W1-17野生型相比較，連續(xù)觀察W1-17突變體庫(kù)M1和M2群體在不同生育時(shí)期的表型，部分株系苗期、成熟期都有突變表型，突變表型甚至超過(guò)2種。參照《西瓜種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》，進(jìn)行了全面的記錄。經(jīng)過(guò)篩選和整理，共獲得葉、莖、花、其他等4大類性狀的突變體共205份(表1)。W1-17野生型植株表型為：子葉長(zhǎng)圓形，子葉、真葉均為綠色，真葉裂刻中等，無(wú)褶皺，無(wú)蠟質(zhì)。M2代中葉片的突變頻率在幾種性狀中最高(10.04%)。主要表現(xiàn)有子葉完全黃化、邊緣黃化、子葉不對(duì)稱、葉片變大或變小、葉片裂刻變深或變淺、真葉黃化、葉片褶皺或無(wú)蠟質(zhì)等。突變頻率最低的幾個(gè)性狀分別為：子葉半黃化、子葉斑點(diǎn)、葉片裂刻變深、葉片褶皺、節(jié)間變長(zhǎng)、花色變淺、花冠小等性狀，頻率低至0.1%。植株莖性狀突變表現(xiàn)在莖粗和節(jié)間長(zhǎng)度的變化。植株花性狀突變表現(xiàn)在花冠大小、花瓣畸形、柱頭和雄蕊畸形等。另外，還發(fā)現(xiàn)6株分支方式變異，14株生長(zhǎng)緩慢、長(zhǎng)勢(shì)弱，12株花粉不育等突變類型，初步建立了西瓜W1-17突變體庫(kù)。

1.植株矮??；2.卷須畸形；3.完全花；4.真葉邊緣黃化；5. 葉裂變淺；6. 真葉畸形；7. 真葉失綠；8. 柱頭畸形；9. 真葉畸形、葉脈黃化；10.野生型植株；11.野生型雌花；12.野生型雄花圖1 M1代部分突變性狀(箭頭)1. Dwarf plants; 2. Tendril deformity; 3. Perfect flowers; 4. Edge of leaf etiolated; 5. Blade crack moment deepens; 6. Leaf malformation; 7. Leaf chlorosis; 8. Stigma deformity; 9. Leaf malformation, yellow vein; 10. Contrast plant; 11. Contrast female flower; 12. Contrast male flowerFig.1 Partial mutant traits of M1 generation(arrow)

2.2 西瓜M3代典型突變體SSR分析

2.2.1 突變株DNA的提取效果 保留M2代雄蕊不成熟、子葉邊緣黃化、矮化株、節(jié)間短、葉色變淺、分支變異、柱頭變異、葉變小、莖變粗、枯萎病抗性增強(qiáng)這10個(gè)典型突變植株的種子，培育獲得M3代幼苗后，提取DNA，其DNA用紫外分光光度計(jì)和1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖5所示，提取的DNA雜質(zhì)(RNA和蛋白質(zhì))較少，提取DNA的濃度和純度均可用于SSR反應(yīng)。

2.2.2 突變株在DNA水平上的變異分析 利用23對(duì)西瓜SSR引物對(duì)9個(gè)典型突變植株的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，結(jié)果表明19個(gè)引物可以擴(kuò)增出清晰的條帶，其中6條引物擴(kuò)增出具有多態(tài)性的片段，片段多態(tài)性可歸納為兩種，即DNA片段的增加和缺失。圖6是部分引物電泳結(jié)果。

1.1片子葉；2.3片子葉；3.子葉完全黃化；4.子葉半黃化；5. 子葉邊緣黃化；6. 子葉翅狀不對(duì)稱；7. 子葉扭曲不對(duì)稱；8. 子葉折疊；9. 子葉雙葉脈；10.子葉斑點(diǎn)；11. 子葉邊緣黃化；12.野生植株圖2 M2代植株子葉性狀突變體1. One cotyledon; 2.Three cotyledon; 3. The cotyledons of etiolated; 4. Half yellow cotyledon; 5.Edge of cotyledons etiolated; 6.Cotyledons winged asymmetry; 7.Cotyledons twist asymmetric;8.Cotyledons folded; 9.Cotyledons double veins; 10.Cotyledons spots; 11.Edge of cotyledons etiolated; 12. ContrastFig.2 Cotyledon mutant traits of M2 generation

1. 第一真葉淺黃化；2. 葉脈黃化；3.葉片黃化；4.葉變??；5. 葉片裂刻變深；6. 葉邊緣內(nèi)卷；7 .葉片褶皺；8.莖變細(xì)；9.節(jié)間變短；10.分支少圖3 M2代植株葉和莖性狀突變體1. The first leaf light yellow; 2. Yellow vein; 3. Leaf chlorosis; 4. The small leaf; 5. Blade crack moment deepens; 6. Leaf edge involute; 7.Blade fold; 8 .Stem thinning; 9. Shorter internode; 10.Less branchFig.3 Leaf and stem mutant traits of M2 generation

1.花變大；2.花瓣皺縮；3.花瓣分布不勻；4.部分花瓣向下展開(kāi)；5.花瓣數(shù)目突變；6.花色變淺；7.兩性花；8.雄蕊原基；9.柱頭畸形；10.雄蕊數(shù)目變多；11.雄蕊不成熟；12.花瓣部分退化圖4 M2代植株花性狀突變體1.Bigger flowers; 2.Wrinkled petals; 3.Petals uneven distribution; 4.Part of the petals unfold downward; 5.The number of petals mutation; 6.Color becomes shallow; 7.Hermaphrodite flower; 8.Stamen primordial; 9.Stigma variation; 10.Stamens number increasing; 11.Stamens not mature; 12.Partial degradation of petalsFig.4 Flowers mutant traits of M2 generation

表型Phenotype表型變異株數(shù)Phenotypemutationnumber總株數(shù)Totalnumberofseeding表型突變率Phenotypemutationrate/%子葉Cotyledon1片子葉Onecotyledon310510．293片子葉Threecotyledon510510．48子葉完全黃化Thecotyledonsofetiolated210510．19子葉半黃化Halfyellowcotyledon110510．10子葉邊緣黃化Edgeofcotyledonsetiolated610510．57子葉翅狀不對(duì)稱Cotyledonswingedasymmetry910510．86子葉扭曲不對(duì)稱Cotyledonstwistasymmetric1210511．14子葉折疊Cotyledonsfolded510510．48子葉雙葉脈Cotyledonsdoubleveins210510．19子葉斑點(diǎn)Cotyledonsspots110510．10葉Leaf葉色變淺Leavesturnpale610510．57葉色變深Darkerleafcolor510510．48葉變小Thesmallleaf1110511．05葉變大Largerleaf410510．38葉片裂刻變淺Leaveslobeslighter310510．29葉片裂刻變深Bladecrackmomentdeepens110510．10第一真葉淺黃化Thefirstleaflightyellow710510．67葉脈黃化Yellowvein210510．19葉片黃化Leafchlorosis810510．76葉邊緣內(nèi)卷Leafedgeinvolute810510．76葉片無(wú)蠟質(zhì)Leaveswithoutwax310510．29葉片褶皺Bladefold110510．10莖Stem莖變細(xì)Stemthinning810510．76莖變粗Stemsthicken510510．48節(jié)間變短Shorterinternode910510．86節(jié)間變長(zhǎng)Internodelength110510．10花Flower花期早Earlyflowering310510．29花期晚Lateblooming510510．48花冠小Theflowerbecomessmall110510．10花冠大Biggerflowers410510．38花瓣畸形Petalsdeformity1310511．24花色變淺Colorbecomesshallow110510．10兩性花Hermaphroditeflower1210511．14柱頭畸形Stigmavariation310510．29雄蕊畸形Stamensdeformity410510．38子房變大Ovarylarger310510．29其他Other生長(zhǎng)緩慢Slowgrowth1010510．95不育Sterility1210511．14分支方式變異Branchvariation610510．57突變體總數(shù)Totalmutants205105119．59

統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)，雄蕊不成熟突變株在242～238和217 bp處各缺失1條條帶，分支變異突變株缺失了1條大約217的片段和1條242～238 bp片段，節(jié)間短突變株在201 bp和190～180 bp處增加了2條條帶；葉變小突變株則缺失1條大小為527～404 bp片段，矮化株增加大小為404～309 bp片段，莖變粗和枯萎病抗性增強(qiáng)突變株都增加了1條190 bp片段，子葉邊緣黃化突變株缺失1條404～309 bp片段，葉色變淺突變株則同時(shí)增加1條160 bp片段，又缺失1條190 bp片段(表2)。由于分子標(biāo)記不受環(huán)境及其他因素的影響，擴(kuò)增出來(lái)的多態(tài)性片段能較真實(shí)地反映出不同性狀變異株在分子水平上的差異，推測(cè)在不同染色體組的DNA某一片段上確實(shí)存在著基因突變。

M. Marker; 1～10. DNA圖5 M2群體DNAFig.5 DNA of M2 group

M.分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.野生型；2.雄蕊不成熟；3.子葉邊緣黃化；4.矮化株、5.節(jié)間短；6.葉色變淺；7.分支變異；8.柱頭變異；9.葉變??；10.莖變粗；11.枯萎病抗性增強(qiáng)圖6 引物BVWS00048(A)、BVWS00658(B)和BVWS00106(C)擴(kuò)增結(jié)果M.Marker;1.Contrast;2.Stamens immature; 3.Cotyledon edge yellowing; 4.Dwarfing plants;5. Short internodes; 6.Lighter leaf color; 7.Branch variation; 8.Stigma variation; 9.Leaf smaller; 10.Stem thickening; 11.Fusarium wilt resistance enhancementFig.6 Amplified results of primer BVWS00048(A),BVWS00658(B) and BVWS00106(C)

突變體 Themutant 引物編號(hào)PrimerNo．缺失片段Thefragmentofdeletion/bp增加片段Thenewfragment/bp染色體位置Chromosomelocation雄蕊不成熟StamensimmatureBVWS00155242～238；2171分支變異BranchvariationBVWS00155242～238；2171節(jié)間短ShortinternodesBVWS00314201；190～1802葉變小LeafsmallerBVWS00048527～4043矮化DwarfingplantsBVWS00209404～3099枯萎病抗性增強(qiáng)FusariumwiltresistanceenhancementBVWS001061903莖變粗StemthickeningBVWS001061905子葉邊緣黃化CotyledonedgeyellowingBVWS00209404～3099葉色變淺LighterleafcolorBVWI001701901607

3 討 論

3.1 西瓜突變體庫(kù)的構(gòu)建

3.1.1 西瓜遺傳背景和EMS誘變的優(yōu)點(diǎn) 由于特殊種質(zhì)資源缺乏、遺傳背景狹窄導(dǎo)致西瓜相關(guān)功能基因組學(xué)研究進(jìn)展緩慢。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，出現(xiàn)越來(lái)越多的方法分析和發(fā)掘功能基因，通過(guò)構(gòu)建突變體庫(kù)來(lái)精確目標(biāo)基因功能是其中最有效的方法。在蔬菜中，EMS是應(yīng)用最廣且副作用最小的誘變劑，它用于農(nóng)作物誘變育種，并在油菜[27]，番茄[28]等多數(shù)農(nóng)作物中取得重大成就。目前還沒(méi)有創(chuàng)建大規(guī)模西瓜突變體庫(kù)的報(bào)道，其最重要的原因在于下述四個(gè)方面：第一，采用基于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)的T-DNA 插入法是構(gòu)建突變體庫(kù)的最廣泛、最成熟的方法，但對(duì)西瓜進(jìn)行大規(guī)模的轉(zhuǎn)基因研究，不僅操作困難，而且轉(zhuǎn)化率低；第二，西瓜生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，在中國(guó)西瓜通常只能種植兩季；第三，西瓜單株種植面積大，因此很少有研究小組能利用大型種植區(qū)域進(jìn)行大規(guī)模突變體庫(kù)的創(chuàng)建；第四，西瓜是雌雄同株異花植株，需要人工授粉，工作量大。

本研究利用 EMS 誘變技術(shù)進(jìn)行西瓜突變體庫(kù)的初步研究，以下三點(diǎn)是其主要原因。第一，操作方法簡(jiǎn)單，投入成本少。EMS處理材料無(wú)需大型儀器，一次就能誘變大量的材料，誘變效果較好。通常，利用EMS誘變植物材料種子，可通過(guò)后代自交的方法而得到可遺傳的變異類型。第二，EMS 產(chǎn)生突變的密度高，可以使得一個(gè)單株含有大量的突變位點(diǎn)，所以無(wú)需大量植株就可使突變位點(diǎn)涵蓋全基因組。第三，EMS誘變不會(huì)滲入外源基因，能夠使突變材料直接應(yīng)用于遺傳育種中，消除了轉(zhuǎn)基因技術(shù)給人類帶來(lái)的安全問(wèn)題[29]。

隨著基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，在通過(guò)高通量測(cè)序手段對(duì)全基因組進(jìn)行比較分析的條件下，學(xué)者們已創(chuàng)建了玉米[30]、黃瓜[31]、白菜[32]等植物的不飽和突變體庫(kù)，加快了其相關(guān)遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域的研究步伐。本研究采用EMS誘變和SSR分子分析相結(jié)合的方法，篩選部分突變體，初步創(chuàng)建了突變體庫(kù)。但是本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)建西瓜突變?nèi)后w數(shù)量較少，今后還需要進(jìn)一步構(gòu)建數(shù)量更大的西瓜突變體庫(kù)。

3.1.2 突變材料的發(fā)掘 理化誘變時(shí)，多會(huì)導(dǎo)致幼苗白化現(xiàn)象和黃化現(xiàn)象，兩者的頻率都不低，說(shuō)明兩種突變體是較容易產(chǎn)生的類型。Jung等[33]使用T-DNA插入篩選白化水稻突變體，并成功分離出該白化基因，推測(cè)該基因可能涉及Mg鰲合酶合成，通過(guò)酶合成來(lái)控制水稻葉綠素的生物合成。已有研究表明葉色突變基因可以直接或間接影響葉綠素的合成和降解，改變突變體中的葉綠素含量，引起光合效率下降，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致植株死亡[34]。本試驗(yàn)篩選得到黃化苗突變體，是否存在等位突變，對(duì)葉綠素的產(chǎn)生機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

株高是高等作物的重要農(nóng)藝性狀之一，如若植物的高度同大多數(shù)野生西瓜一樣過(guò)于高大則容易造成營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)盛導(dǎo)致減產(chǎn)，而矮生植株高產(chǎn)、便于實(shí)現(xiàn)機(jī)械化管理，所以選育矮化株是西瓜重要的育種目標(biāo)，了解和探索矮化基因也成為重要的研究目標(biāo)。由于株高受環(huán)境影響較明顯，所以不排除發(fā)現(xiàn)的矮化材料其實(shí)是由環(huán)境因素造成的可能性，需要經(jīng)過(guò)后代進(jìn)一步鑒定。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了節(jié)間長(zhǎng)度明顯短于對(duì)照，且整株成熟期高度不足1 m的矮化植株9株，并對(duì)其中1個(gè)株系進(jìn)行了SSR鑒定。由于其他矮化突變體極難自交授粉，本研究通過(guò)雜交留下后代，可供以后進(jìn)一步研究。

3.2 突變體表型性狀的鑒定

3.2.1 環(huán)境因素對(duì)突變表型性狀鑒定的影響 研究者對(duì)突變材料進(jìn)行田間性狀調(diào)查的時(shí)候，易受環(huán)境因素的影響，將受病原菌侵染和水肥管理等栽培條件影響所產(chǎn)生的變異性狀歸屬于由EMS誘變產(chǎn)生的變異性狀，所以明確該性狀是否是誘變導(dǎo)致的變異則顯得尤為重要。本研究將同一株系所種植的單株中3株都出現(xiàn)同一變異性狀歸為可遺傳變異，少于3株的變異性狀則需對(duì)比M1代調(diào)查結(jié)果來(lái)看是否是可遺傳變異。

3.2.2 西瓜突變體篩選方法 突變體鑒定方法中最常用的是表型鑒定，但調(diào)查結(jié)果易受到環(huán)境等因素的影響，只從田間表型來(lái)判斷是否是可遺傳的突變是不行的。細(xì)胞學(xué)和生理生化鑒定雖然能從染色體變化、蛋白質(zhì)含量變化等方面對(duì)突變植株進(jìn)行研究，從而進(jìn)一步推測(cè)遺傳變異發(fā)生的可能，但常常受到方法和鑒定指標(biāo)的限制。分子標(biāo)記技術(shù)可以從基因水平上直接揭示材料之間的差異，操作簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性好，本試驗(yàn)采取SSR檢測(cè)的方法鑒定西瓜突變體。

本試驗(yàn)選擇SSR標(biāo)記鑒定的好處在于它是從DNA水平上檢驗(yàn)突變體的變化，它可以在植株的任一部位、任一時(shí)期進(jìn)行檢測(cè)，不受外界因素的影響。無(wú)論從質(zhì)量還是含量上，SSR標(biāo)記對(duì)所提取的DNA要求不高，且是共顯性遺傳，多態(tài)性好，數(shù)目眾多，能夠遍布全基因組[35]。利用SSR分子標(biāo)記進(jìn)行鑒定，可以在分子水平上進(jìn)行驗(yàn)證突變體的真實(shí)性。

本試驗(yàn)使用的是西瓜23對(duì)核心SSR引物，對(duì)10份突變體株系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有9株突變株與對(duì)照有差異，其余植株則沒(méi)有差異。差異的結(jié)果有2種，片段的有無(wú)差異和片段長(zhǎng)度的差異，前者可能是由于EMS點(diǎn)突變產(chǎn)生的堿基對(duì)顛換、轉(zhuǎn)換導(dǎo)致的[36]，后者可能是由于EMS誘變另一機(jī)理：甲基磺酸乙酯和核苷結(jié)構(gòu)的磷酸發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生磷酸酯，導(dǎo)致糖-磷酸骨架的斷裂，這一變化可產(chǎn)生缺失突變和插入突變，引起DNA 鏈長(zhǎng)度的改變，最終導(dǎo)致差異條帶長(zhǎng)度的變化[37]。該試驗(yàn)結(jié)果證明，部分突變株在DNA水平發(fā)生改變，這為突變體的形成提供了充分的證據(jù)。但本研究只是對(duì)突變個(gè)體的初步鑒定，突變的性狀是否純合，突變基因能否遺傳，以及基因突變位點(diǎn)和基因?qū)?yīng)的性狀，都還需進(jìn)一步研究了解。另外，試驗(yàn)中突變體的差異位點(diǎn)較低，可以尋找附近位點(diǎn)基因和尋找新的基因用于功能基因分析的探索[38]。

綜上所述，本試驗(yàn)初步構(gòu)建了含有120個(gè)M1代家系及1 051株M2代植株的西瓜突變體庫(kù)。M2代得到了40種不同的變異類型，總變異頻率達(dá)19.59%。針對(duì)典型變異植株，使用23對(duì)SSR引物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)9份材料在DNA水平上有變異。下一步將進(jìn)行M3代田間表型篩選，除了進(jìn)行正向遺傳學(xué)外，還將利用Tilling等反向遺傳學(xué)技術(shù)在突變體庫(kù)中篩選與鑒定與重要目標(biāo)性狀相關(guān)的基因。

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(編輯:裴阿衛(wèi))

Construction of EMS Mutagenesis Watermelon Mutant Library and Phenotypic Analysis

HOU Yan1,2，ZHU Zicheng1,2, ZHU Nana1,2,CHEN Kenong1,2,LUAN Feishi1,2，WANG Xuezheng1,2*

(1 Ministry of Agriculture Key Laboratory of Biology and Germplasm Enhancement of Horticultural Crops in Northeast China，Harbin 150030，China; 2 Horticulture College，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

The watermelon strain W1-17 was treated with ethylmethanesulfonate (EMS) at 1.0% for 9 h, and phenotypic variation of M1and M2,including the leaf, flower, stalk, fertility and branching habits etc, were studied. The typical mutant lines of M2were selected simultaneously, and 23 watermelon SSR primers were used for analysis and identification, and the mutant library of watermelon was constructed finally. The results showed that: (1) the M1seedlings mutagenized showed differently morphological characteristics such as leaf deformity, leaf folds, partial yellowing, floral abnormality, male flowers do not loose powder, tendril deformity, short stature, slow growth and infertility, ect. The M1population of watermelon mutant was composed of 1 252 individual plants, the total mutation frequency was 18.33%.(2) 205 M2mutant plants were screened, and 40 phenotypic variations were found in cotyledon traits (yellowing, asymmetric twist, fold etc.), leaf and stem traits (leaf yellowing, smaller, cracked deep, thin stems, internodes shorter, less branched and so on), floral traits (flowers become larger, lighter color, bisexual flowers, petals shrinkage, partial degradation, the number of mutations, stigma deformities, stamens immature) ,and other traits (slow growth, infertility, etc.), the total phenotypic mutation rate reached 19.59%. (3) For the 10 representative mutant plants of M2generation, 9 samples were found to be mutated at the DNA level by SSR primer analysis. In this study, a mutant library of watermelon containing 120 M1generation lines and 1051 M2generation plants and 40 phenotypic variations was constructed.

watermelon; ethylmethanesulfonate (EMS) mutagenesis; mutant library; SSR

1000-4025(2016)12-2411-10

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.12.2411

2016-10-10;修改稿收到日期:2016-11-29

黑龍江省科技攻關(guān)項(xiàng)目(GC13B109)；國(guó)家西甜瓜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-026-02)

侯 艷(1991-)，女，在讀碩士研究生，主要從事西甜瓜種質(zhì)資源創(chuàng)新研究。E-mail：330829426@qq.com

*通信作者:王學(xué)征，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事西甜瓜遺傳育種研究。E-mail：xz6206815@163.com

Q813.5;Q789

A