董婧妍

山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院，山西汾陽032200

腫瘤組織切片在病理學(xué)實驗教學(xué)中的應(yīng)用

董婧妍

山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院，山西汾陽032200

目的探索腫瘤組織切片在病理學(xué)實驗教學(xué)中的應(yīng)用。方法應(yīng)用三種成熟的染色技術(shù)（HE染色、特殊染色和免疫組化染色）對多例腫瘤組織及其對應(yīng)的正常組織切片進行染色。結(jié)果通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)三種染色方法腫瘤組織切片和其對應(yīng)的正常組織切片都有顯著差異：①常規(guī)染色（HE染色）切片可見腫瘤組織的細胞較正常組織細胞在形態(tài)及排列上都有明顯不同，腫瘤組織細胞胞核較大且形態(tài)不規(guī)則，核質(zhì)比較小；②特殊染色切片可見腫瘤組織的網(wǎng)狀纖維、膠原纖維和彈性纖維的分布及含量都與正常組織有顯著差異；③免疫組化染色切片可見腫瘤組織中P53和PCNA（增殖細胞核抗原）的表達都顯著高于正常組織。結(jié)論鏡下對比腫瘤組織切片和正常組織切片使觀察非常直觀，清晰，便于分析，將腫瘤組織切片應(yīng)用于病理學(xué)的實驗教學(xué)中，顯著強化了腫瘤病理學(xué)實驗教學(xué)的效果，一方面有利于學(xué)生對腫瘤組織病變特點的掌握和理解，另一方面提升了學(xué)生的科學(xué)思維能力和實際操作能力。

腫瘤組織切片；病理學(xué)；實驗教學(xué)

病理學(xué)是一門研究疾病發(fā)病原因、發(fā)病機理、病理改變、發(fā)展規(guī)律及疾病發(fā)病過程機體的形態(tài)學(xué)變化和功能代謝變化的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)學(xué)科[1]，同時也是一門實踐性非常強的具有臨床醫(yī)學(xué)性質(zhì)的學(xué)科。病理學(xué)是連接臨床醫(yī)學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的橋梁學(xué)科，而實驗教學(xué)又是病理學(xué)教學(xué)過程中的重要組成部分，因此，提高病理學(xué)實驗教學(xué)質(zhì)量就是病理學(xué)教學(xué)的關(guān)鍵所在[2]。國內(nèi)傳統(tǒng)的病理學(xué)實驗教學(xué)方法一直是只針對發(fā)生病變的組織切片進行教學(xué)，而很少有針對正常組織切片進行教學(xué)[3]，這種缺乏對比且相對抽象的教學(xué)方式導(dǎo)致學(xué)生很難掌握顯微鏡下病理圖像的特點，也難以對病變部位進行精確的比較和分析，這些都在一定程度上直接影響了病理學(xué)實驗教學(xué)的質(zhì)量。為改善病理學(xué)實驗教學(xué)的效果，該研究通過不同的染色方法對腫瘤組織切片和正常組織切片進行染色，然后通過顯微鏡觀察對比腫瘤組織和正常組織的差異性，使學(xué)生可以非常準(zhǔn)確、清晰地了解腫瘤組織的病變特征。

1 材料與方法

1.1 樣本收集

收集山西省腫瘤醫(yī)院病理科保存的腫瘤組織標(biāo)本35例，其中肝癌、腸癌、乳腺癌、宮頸癌、肺癌各7例，所有腫瘤組織均經(jīng)病理學(xué)檢查確證。分別取非壞死部位的腫瘤組織和腫瘤組織邊緣外5 cm處的正常組織，所取組織塊較理想的體積為2.0 cm×2.0 cm×0.3 cm，用4%的甲醛固定腫瘤組織和正常組織，并將二者一起包埋，切片，切片厚度約4 um[4]。

1.2 檢測指標(biāo)及方法

對所有組織切片均用三種成熟的染色技術(shù)：HE染色、特殊染色和免疫組化染色技術(shù)進行染色。HE染色（又名：蘇木精-伊紅染色），是組織學(xué)和病理學(xué)最常用的染色方法之一，其染色原理是不同組織結(jié)構(gòu)與不同染料的結(jié)合程度不同，染料蘇木精能將嗜堿性結(jié)構(gòu)（包括核糖體、細胞核等）染成藍色，而伊紅能將嗜酸性結(jié)構(gòu)（包括細胞質(zhì)、細胞外基質(zhì)等）染成粉紅色，進而觀察比較腫瘤組織和正常組織的結(jié)構(gòu)和細胞形態(tài)等差異[4]。特殊染色也是科研及病理實驗的重要手段之一，其主要原理是利用各種特定的染料進行染色，來識別組織細胞中的不同組分[6]，包括：網(wǎng)狀纖維、膠原纖維、彈性纖維、肌肉、纖維素及淀粉等組分，該研究應(yīng)用識別網(wǎng)狀纖維、膠原纖維和彈性纖維的三聯(lián)染色法，對比分析腫瘤組織和正常組織的網(wǎng)狀纖維、膠原纖維和彈性纖維的形態(tài)差異性。免疫組化染色是利用免疫學(xué)的基本原理即抗原抗體特異性結(jié)合，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑如：熒光素、金屬離子、酶和同位素等顯色，進而對組織細胞內(nèi)特定的抗原進行定位、定性和定量的研究[6]。該研究應(yīng)用EnviSion法對腫瘤組織和正常組織進行染色，進而比較腫瘤組織和正常組織的P53及增殖細胞抗原PCNA的表達水平。P53和PCNA的單克隆抗體以及免疫組化試劑盒PV-9000均購自北京中山生物試劑有限公司[4]，實驗中的陽性對照為已知的腫瘤組織切片和正常組織切片，陰性對照用PBS替代。

2 結(jié)果

2.1 HE染色

HE染色切片可見腫瘤組織和正常組織在組織結(jié)構(gòu)、細胞形態(tài)、大小及排列上都有明顯不同：①與正常組織相比，腫瘤組織結(jié)構(gòu)具有非常明顯的異型性，腫瘤細胞喪失了常規(guī)的排列方式，其排列結(jié)構(gòu)、極向或?qū)哟味挤浅Ｎ蓙y；②同樣來源的正常組織的細胞形態(tài)和大小都相對一致，而腫瘤組織不同細胞的形態(tài)及大小則有顯著差異，不具有一致性，且腫瘤組織細胞通常都比正常組織的細胞大；③絕大多數(shù)正常組織的細胞都只有一個細胞核，而腫瘤組織的細胞中則可能出現(xiàn)雙核、多核或者異形核等結(jié)構(gòu)，且其細胞核體積一般比正常組織細胞的細胞核稍大，從而導(dǎo)致腫瘤細胞的核質(zhì)比相比正常組織細胞的核質(zhì)比顯著增加，同時，不同腫瘤細胞的細胞核大小也不太一致。

2.2 特殊染色

該研究應(yīng)用識別網(wǎng)狀纖維、膠原纖維和彈性纖維的三聯(lián)染色法，特殊染色切片可見腫瘤組織的網(wǎng)狀纖維、膠原纖維和彈性纖維的分布及含量都與正常組織有顯著差異。

①網(wǎng)狀纖維是非常細而短的纖維，正常組織的網(wǎng)狀纖維有很多細小的分支，交織形成致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，故稱網(wǎng)狀纖維，在分化程度較低或中等的腫瘤組織中，癌巢周圍的網(wǎng)狀纖維因部分分解而較少，而在高度分化的腫瘤組織中，癌巢周圍則富集了大量的網(wǎng)狀纖維。

②膠原纖維是結(jié)締組織中起支撐作用的主要纖維，特殊染色后因呈紅色而可與周圍的間質(zhì)明顯區(qū)分開來，進而易于觀察發(fā)生病變時膠原纖維的變化。正常組織的膠原纖維呈波浪形分布，且粗細不均一，多個膠原纖維分支交織成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在分化程度較低或中等的腫瘤組織中，癌巢周圍的膠原纖維因部分分解而較少，而在高度分化的腫瘤組織中，癌巢周圍則富集了大量的膠原纖維。

③彈性纖維是結(jié)締組織中發(fā)生形成較晚的一種纖維，具有堅固、彈性大、容易伸展等特性，主要在結(jié)締組織中起彈性作用。彈力纖維經(jīng)特殊染色后呈綠色，可與周圍的間質(zhì)明顯區(qū)分開來，進而易于觀察發(fā)生病變時彈性纖維的變化。在正常組織中，彈性纖維含量較少，著色相對較淺，通常呈單條分布，通過分支交織呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而在腫瘤組織中，癌巢周圍的彈性纖維含量較少，主要分布于血管上。

2.3 免疫組化染色

免疫組化染色切片可見腫瘤組織中P53和PCNA（增殖細胞核抗原）的表達都顯著高于正常組織。

①野生型P53基因又稱抑癌基因，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤相關(guān)性最高的抑癌基因，而突變型的P53則是一種腫瘤促進因子，它可以消除野生型P53的抑癌功能，野生型的P53蛋白極不穩(wěn)定，半衰期僅數(shù)分鐘，而突變型的P53蛋白相對比較穩(wěn)定，且半衰期較長，因而可以被免疫組化染色方法檢測出來，P53基因的缺失或突變在腫瘤中的發(fā)生概率非常高，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。正常組織中檢測不到突變型的P53，因而呈陰性，而腫瘤組織中P53蛋白染色呈陽性，分布于細胞核內(nèi)。

②增值細胞核抗原（PCNA）只存在于正常增值細胞和腫瘤細胞內(nèi)，腫瘤細胞具有非常旺盛的增殖活性，PCNA蛋白可以作為評價細胞增殖狀態(tài)的標(biāo)志物，亦可以作為腫瘤細胞的標(biāo)志物。在正常組織細胞中，PCNA蛋白染色很低或呈陰性，而在腫瘤組織細胞中，PCNA蛋白被染成褐色，且定位于增值細胞的細胞核內(nèi)，在增殖活躍的腫瘤組織中表達量高，而在增殖緩慢的區(qū)域表達量相對較低。

3 討論

病理學(xué)實驗教學(xué)是病理學(xué)教學(xué)過程中至關(guān)重要的一個環(huán)節(jié)，能非常直觀、生動地展示病變的狀態(tài)，病理學(xué)實驗?zāi)茏寣W(xué)生非常近距離地觀察分析各種疾病，從而激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)的積極性和興趣。學(xué)生通過病理學(xué)實驗課能對理論課程所涉及疾病進行具體實踐，一方面使學(xué)生更深入和全面地掌握疾病本質(zhì)，真正理解疾病發(fā)生發(fā)展的全過程，從而幫助學(xué)生打好疾病相關(guān)的理論基礎(chǔ)，另一方面也培養(yǎng)了學(xué)生獨立思考問題、分析問題、解決問題以及主動學(xué)習(xí)的能力。

國內(nèi)傳統(tǒng)的病理學(xué)實驗教學(xué)方法一直是只針對發(fā)生病變的組織切片進行教學(xué)，而很少有針對正常組織切片進行教學(xué)，從而導(dǎo)致學(xué)生在實驗過程中無法將腫瘤組織切片和正常組織切片進行對比觀察，這種缺乏對比且相對抽象的教學(xué)方式導(dǎo)致學(xué)生很難掌握顯微鏡下病理圖像的特點，也難以對病變部位進行精確的比較和分析，同時也很難調(diào)動學(xué)生學(xué)習(xí)的積極性和主觀能動性，這些都在一定程度上直接影響了病理學(xué)實驗教學(xué)的質(zhì)量。

該研究通過不同的染色方法對腫瘤組織切片和正常組織切片進行染色，然后通過顯微鏡觀察對比腫瘤組織和正常組織的差異性，從而非常直觀、感性和生動地了解腫瘤組織的病變特征，實現(xiàn)了從單純的記憶腫瘤組織特征向通過對比深入理解并記憶腫瘤組織特征的突破，從被動記憶轉(zhuǎn)變?yōu)橹鲃佑洃?，也加深了對疾病相關(guān)知識的掌握和記憶，從而顯著改善了病理學(xué)實驗教學(xué)的質(zhì)量。病理學(xué)實驗教學(xué)中常用的染色技術(shù)包括：HE染色（又名：蘇木精-伊紅染色）、特殊染色和免疫組化染色。HE染色切片可見腫瘤組織和正常組織在組織結(jié)構(gòu)、細胞形態(tài)、大小及排列上都有明顯不同，腫瘤組織細胞胞核較大且形態(tài)不規(guī)則，核質(zhì)比較小，通過顯微鏡下直觀的對比分析，能使學(xué)生非常形象、準(zhǔn)確地掌握腫瘤組織區(qū)別于正常組織的病理特征，并形成持久記憶。特殊染色切片可見腫瘤組織的網(wǎng)狀纖維、膠原纖維和彈性纖維的分布及含量都與正常組織有顯著差異，通過對比觀察，可加深學(xué)生對腫瘤組織中這三種纖維的結(jié)構(gòu)、形態(tài)和分布都有深入認識和掌握。免疫組化染色切片可見腫瘤組織中P53和PCNA（增殖細胞核抗原）的表達都顯著高于正常組織。P53和PCNA都是腫瘤的特異性標(biāo)志物，免疫組化染色檢測到的P53含量越高，表明腫瘤的惡性程度越高，細胞高速增殖是腫瘤細胞的一個主要特征，PCNA含量越高表明腫瘤組織的細胞處于高速增殖的狀態(tài)。在病理學(xué)實驗教學(xué)課上通過上述三種染色方法分析比較腫瘤組織和正常組織的差異性，從不同的角度加深了學(xué)生對腫瘤組織特異性的理解和掌握，拓寬了學(xué)生的視野，幫助學(xué)生打好了各種疾病相關(guān)的理論基礎(chǔ)，極大地改善了病理學(xué)實驗教學(xué)的質(zhì)量。

[1]方靜.病理學(xué)實驗教學(xué)改革初探[J].考試周刊,2008(6):209-210.

[2]趙英芳,李海華,馬俊兵,等.病理學(xué)實驗教學(xué)現(xiàn)狀與改革思路探討[J].包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2008,24(5):526-527.

[3]陳素娟,林信富,林瑤,等.病理學(xué)實驗教學(xué)方法探索[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報:基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教育版,2011,13(1):38-40.

[4]牛兆山,趙潔,徐靜,等.腫瘤組織與正常組織對比切片在病理實驗教學(xué)中應(yīng)用[J].青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2011,47 (1):84-86.

[5]牛兆山,趙潔,徐靜.“動態(tài)變化”的腫瘤組織切片在病理學(xué)實驗教學(xué)中的應(yīng)用[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報：基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教育版,2010（51）：51-52.

[6]戴林,呂曉紅,李志紅,等.特殊染色和免疫組織化學(xué)染色在腎上皮性腫瘤診斷中的應(yīng)用[J].中華病理學(xué)雜志,2004, 33(2):140-142.

Application of Neoplasmic Tissue Slices in the Experiment Teaching of Pathology

DONG Jing-yan
Fenyang School,Shanxi Medical College,Fenyang,Shanxi Province,032200 China

Objective To explore the application of neoplasmic tissue slices in the experiment teaching of pathology. Methods The multiple cases of tumor tissues and corresponding normal tissue slices were dyed by three mature staining techniques(HE staining,special staining and immunohistochemical staining).Results The microscope observation showed that there were obvious differences in the tumor tissues and corresponding normal tissue slices between three staining methods.(1)The routine staining showed that there were obvious differences in the shape and arrange between the tumor tissue cells and normal tissue cells,and the karyon of tumor tissue cell was bigger and the shape was irregular,and the caryoplasm was smaller.(2)The special staining showed that there were obvious differences in the reticular fibers,collagen fibrils and distribution and content of flexible fibers between the tumor tissue cells and normal tissue cells.(3)The immunohistochemical staining showed that the expressions of P53 and PCNA in tumor tissues were obviously higher than those in normal tissues.Conclusion The tumor tissue slice and normal tissue slice make the observation very intuitionistic and clear and easy to analyze,and the application of tumor tissue slices to the experiment teaching of pathology obviously intensifies the effect of experiment teaching of pathology,which can not only be conducive to the students’mastery and understanding of tumor tissue lesion features but also improve the scientific thinking ability and practical operation ability of students.

Tumor tissue slice;Pathology;Experiment teaching

R36

A

1672-5654（2016）11（c）-0084-03

10.16659/j.cnki.1672-5654.2016.33.084

2016-08-29）

董婧妍（1986.11-），女，山西汾陽人，本科，助理實驗師，研究方向：病理學(xué)實驗。