吳成亮　巢時斌▲　曾敬人　蘇占營　辜　敏.江西省九江市婦幼保健院輔助生殖科，江西九江　33000；.江西省九江市婦幼保健院信息科，江西九江　33000

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玻璃化冷凍技術(shù)在人類胚胎中的應(yīng)用價值

吳成亮1巢時斌1▲曾敬人2蘇占營1辜敏1
1.江西省九江市婦幼保健院輔助生殖科，江西九江332000；2.江西省九江市婦幼保健院信息科，江西九江332000

［摘要］目的探討玻璃化冷凍技術(shù)在人類胚胎中的應(yīng)用價值。方法選擇2014年3月～2016年2月在我院生殖中心做試管嬰兒的264例不孕不育患者，經(jīng)患者知情同意后，將實施體外受精-胚胎移植術(shù)患者卵裂期胚胎和囊胚符合冷凍標準的胚胎進行玻璃化冷凍保存。根據(jù)患者情況解凍胚胎移植，觀察胚胎復(fù)蘇后的臨床妊娠效果。結(jié)果玻璃化冷凍74個周期，解凍胚胎149枚，解凍后存活胚胎147枚，存活率98.66%；種植胚胎56枚，種植率38.10%；臨床妊娠42例（單胎27例，雙胎14例，宮外孕1例），臨床妊娠率為56.76%。結(jié)論玻璃化冷凍法是人類胚胎保存的優(yōu)選方法，獲得了理想的復(fù)蘇率、種植率和妊娠率。

［關(guān)鍵詞］試管嬰兒；玻璃化冷凍技術(shù)；人類胚胎；應(yīng)用價值

▲通訊作者

從1978年世界第一例“試管嬰兒”Louise Brown出生至今，全世界已經(jīng)有超過500多萬例通過人類輔助生殖技術(shù)（human assisted reproductive technology，ART）誕生的嬰兒。而我國人類輔助生殖技術(shù)經(jīng)過將近40年的長足發(fā)展，現(xiàn)如今人工促排、取卵與實驗室的體外受精、胚胎培養(yǎng)技術(shù)及胚胎的冷凍、移植技術(shù)都已經(jīng)達到了國際先進水平［1］。在IVF周期中，我們通常將新鮮移植后的多余胚胎進行囊胚培養(yǎng)或者冷凍保存。胚胎的冷凍已經(jīng)成為人類輔助生殖技術(shù)中不可缺少的重要組成部分，可降低多胎率，有效預(yù)防卵巢過度刺激征（ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS）。而近年來出現(xiàn)的玻璃化冷凍技術(shù)與傳統(tǒng)的程序化冷凍相比，具有不需要大型設(shè)備、液氮用量少、耗時少、成本低、節(jié)省人力、操作簡單、應(yīng)用范圍廣、復(fù)蘇率高等優(yōu)點［2］?？梢哉f，玻璃化冷凍法是一項簡單、快速、經(jīng)濟、有效的冷凍方法，已經(jīng)被越來越多的生殖中心所采用。我院生殖中心于2014年3月～2016年2月行試管嬰兒（in Vitro fertilization，IVF）264個周期，本文就玻璃化冷凍技術(shù)在輔助生殖中的應(yīng)用加以論述，現(xiàn)報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

選擇2014年3月～2016年2月期間因不孕不育在本中心行常規(guī)體外受精-胚胎移植（IVF-ET）或卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）治療的264例患者，其中200例進行玻璃化冷凍胚胎814枚，期間對74例患者的149枚胚胎進行玻璃化解凍復(fù)蘇移植。

1.2材料

日本加藤（KITAZATO）公司玻璃化冷凍、解凍試劑套盒，冷凍試劑包括平衡液（equilibration solution，ES）、冷凍液（vitrification solution，VS）；解凍試劑含有解凍液（thawing solution，TS）、稀釋液（diluent solufion，DS）、洗液1（washing solution l，WS1）和洗液2（washing solution 2，WS2），開放性冷凍載桿（cryotop），液氮。

1.3冷凍胚胎的標準

參照文獻［3］的卵裂期胚胎分級方法并結(jié)合本中心實際工作將D3胚胎分為4級：Ⅰ級胚胎卵裂球均勻，胚胎無碎片或有少量碎片（＜5%）；Ⅱ級胚胎卵裂球均勻，胚胎碎片＜20%；Ⅲ級胚胎卵裂球均勻或不均勻，胚胎碎片＜50%；Ⅳ級胚胎卵裂球均勻或不均勻，胚胎碎片≥50%。中心規(guī)定Ⅰ～Ⅲ級胚胎予以冷凍，Ⅳ級胚胎不予冷凍。囊胚冷凍標準為第5、6天發(fā)育到4BC 或4BC以上的胚胎方可進行玻璃化冷凍。

1.4玻璃化冷凍

在室溫下（24℃）將1～2個胚胎移入平衡液中（equilibration solution，ES），預(yù)平衡6～7 min（卵裂期胚胎）/8～10 min（囊胚）后，再將ES中的胚胎移入玻璃化冷凍液（vitrification solution，VS），充分混勻后在60 s以內(nèi)將胚胎迅速放置冷凍載桿（cryotop）頂端標記位置，并將載桿投入液氮裝管保存。

1.5玻璃化解凍

把冷凍載桿（cryotop）從液氮中取出，將頂端迅速放入37℃預(yù)熱的解凍液（thawing solution，TS）中60 s，再將解凍后的胚胎依次移入稀釋液（diluent solufion，DS）、洗液1（washing solution l，WS1）和洗液2（washing solution 2，WS2）中，時間分別控制在3、5、5 min，之后將胚胎移入G2（vitrilife）胚胎培養(yǎng)液，再放入37℃、6%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h，準備移植。

1.6復(fù)蘇胚胎后的觀察

卵裂球存活：胞質(zhì)均勻，有光澤，完整的細胞膜；胚胎存活：復(fù)蘇后卵裂球存活＞50%以上，有光澤，均一，有立體感。

1.7胚胎移植

對于月經(jīng)正常、有規(guī)律排卵的患者采用自然周期，B超檢測卵泡大小及子宮內(nèi)膜厚度，結(jié)合促黃體生成素（LH）、雌二醇（E2）值確定排卵時間，肌注黃體酮（廣州白云山明興制藥有限公司，國藥準字：H44020229，規(guī)格：20 mg/支）40 mg，1次/d，3～5 d后移植凍融胚胎；對于月經(jīng)不正常、排卵不規(guī)律、多囊卵巢綜合征（PCOS）及黃體功能不全的患者采用人工周期，自月經(jīng)來潮第3天開始口服戊酸雌二醇（補佳樂，Delpharm Lille SAS，國藥準字J20080036，規(guī)格：21片/盒）遞增法，當內(nèi)膜厚度≥8 mm時開始肌注黃體酮，3～5 d后移植凍融胚胎。胚胎移植后14 d，尿妊娠試驗陽性，血HCG升高（≥10 mIU/mL）為生化妊娠；胚胎移植后4～5 周B超下顯示有孕囊及胎心血管搏動，確定臨床妊娠。

2　結(jié)果

選擇2014年3月～2016年2月264例輔助生殖周期中有200例周期進行了玻璃化冷凍，冷凍率為75.76%（200/264）。其中解凍周期為74例，解凍胚胎149枚，解凍后有147枚胚胎存活，存活率為98.66% （147/149）；每周期平均移植凍融胚胎1.99枚（147/ 74）；147枚存活胚胎中有56枚胚胎種植，種植率為38.10%（56/147）；臨床妊娠42例（單胎27例，雙胎14例，宮外孕1例），臨床妊娠率為56.76%（42/74）。

3　討論

隨著輔助生殖技術(shù)日新月異的發(fā)展，胚胎冷凍技術(shù)在輔助生殖中顯得越來越重要。自Mukaida等［4］于1998年首次報道應(yīng)用玻璃化冷凍人類卵裂期胚胎成功妊娠以來，玻璃化冷凍技術(shù)在全世界生殖中心迅速被推廣應(yīng)用。由王俊霞等［5］報道的中國首例玻璃化冷凍胚胎順利分娩于2004年。玻璃化冷凍的原理：在一定的降溫速率下，利用高濃度、極其黏稠的冷凍保護劑溶液將液態(tài)直接凍結(jié)為一種黏稠的、無結(jié)構(gòu)的玻璃狀態(tài)或者無冰晶結(jié)構(gòu)的固態(tài)。這種玻璃狀態(tài)由于內(nèi)部沒有形成冰晶，能保持其溶液狀態(tài)的分子和離子分布，在冷凍和解凍的過程中冷凍液也不會在液態(tài)和晶體形態(tài)之間來回轉(zhuǎn)換，從而避免了冰晶對細胞的物理化學(xué)損傷，可望獲得更好的冷凍效果［6］。

本篇報道74例冷凍周期解凍149枚胚胎，解凍后存活147枚胚胎，存活率為98.66%；其中有56枚胚胎種植，種植率為38.10%；臨床妊娠42例（單胎27例，雙胎14例，宮外孕1例），臨床妊娠率為56.76%。解凍后胚胎存活率、胚胎種植率和臨床妊娠率均高于國內(nèi)［7］及國外［8］文獻報道。與我們中心實驗人員在運行前期進行了大量的鼠胚試驗、已能夠熟練掌握胚胎的玻璃化冷凍解凍技術(shù)有關(guān)；同時中心應(yīng)用日本加藤（KITAZATO）公司玻璃化冷凍、解凍試劑套盒及cryotop冷凍載桿，試劑的質(zhì)量穩(wěn)定，cryotop載桿操作起來比較方便。其中應(yīng)用的cryotop最小容量法，Kuwayama［9］認為是一種非常有效的保存人類卵子和胚胎的方法。

玻璃化冷凍技術(shù)現(xiàn)已普遍應(yīng)用于輔助生殖領(lǐng)域，技術(shù)不斷在更新，然而冷凍效果可受多方面影響。首先玻璃化冷凍技術(shù)對操作人員要求高，因為玻璃化冷凍需要極短的操作時間及更加熟練的操作技術(shù)，所以對操作人員進行嚴格的訓(xùn)練和考核，人員考核通過并且確定掌握該技術(shù)后方能進入臨床實際工作。其次，玻璃化冷凍效果受冷凍速率的影響，這也是玻璃化冷凍的關(guān)鍵步驟。胚胎從室溫快速降至-196℃所需要的時間稱為冷凍速率，冷凍過程中掌握好冷凍速率不僅可以減輕胚胎的低溫損傷，而且還可降低高濃度冷凍保護液的毒性作用［10］。第三，冷凍保護劑，是指所有在冷凍和解凍過程中能夠保護細胞、預(yù)防和減輕冷凍損傷的化學(xué)成分。但是玻璃化保護劑對細胞有毒性，保護劑的濃度越高，對細胞的毒性越強，甚至致畸。一旦濃度太高，將對所要冷凍的細胞或組織造成重度損傷，使其在生物保存中無法應(yīng)用［11，12］。冷凍保護劑按生物化學(xué)特征可分為滲透性冷凍保護劑和非滲透性冷凍保護劑兩大類。滲透性冷凍保護劑又稱細胞內(nèi)冷凍保護劑，有乙二醇（EG）、丙二醇（PROH）、丙三醇（甘油）、二甲基亞砜（DMSO）等。這些有機物具有良好的水溶性，相對分子量小，多在63～97，能自由穿透細胞膜，迅速進入細胞內(nèi)，細胞毒性弱，能夠降低冰點，減少或者避免冰晶的形成。非滲透性冷凍保護劑又稱細胞外冷凍保護劑，因分子量大，不能穿過細胞膜，加入細胞外液后，將產(chǎn)生細胞膜內(nèi)外的滲透壓差異，水分將從細胞內(nèi)流入細胞外。細胞因水分被抽出而發(fā)生皺縮，細胞內(nèi)水分減少，滲透壓增加，冰晶形成受到抑制。非滲透性冷凍保護劑還有一個重要作用：復(fù)溫解凍，預(yù)防細胞發(fā)生滲透性休克。非滲透性冷凍保護劑包括蔗糖、棉籽糖、葡萄糖、果糖等，目前玻璃化冷凍中普遍使用的是蔗糖［13］。第四，冷凍載體，玻璃化冷凍采用的載體包括開放載體和封閉載體。開放性載體降溫速度快，方便胚胎實現(xiàn)玻璃化，但存在污染風險。然而到目前為止，還沒有文獻報道由于液氮引起人類疾病傳播的案例［14］。更何況在平常的工作中，對于病毒攜帶者的胚胎我們是單獨液氮罐保存的。封閉式載體雖然杜絕了污染風險，但操作時間增加，對技術(shù)人員的要求更高。其中大多數(shù)載體價格偏高。目前生殖領(lǐng)域多種載體并存的原因就是由于還沒有找到一種操作時間短、既安全又便宜的載體，也限制了玻璃化技術(shù)的應(yīng)用。

總之，玻璃化冷凍設(shè)備要求低、節(jié)省人力、應(yīng)用范圍廣、復(fù)蘇率存活高，已成為人類輔助生殖技術(shù)中的一項成熟、有效、實用的衍生技術(shù)。同時，由于高濃度的冷凍保護劑的使用，我們又會擔心玻璃化冷凍的安全性［15］。雖然近年來國內(nèi)出生的凍融胚胎移植的嬰兒明顯增多，還沒有出生缺陷增加的報道，但是玻璃化冷凍技術(shù)應(yīng)用于人類胚胎的時間畢竟比較短，隨訪數(shù)據(jù)偏少，因此，我們?nèi)孕栝L期對患者隨訪跟蹤，以確保玻璃化冷凍技術(shù)廣泛使用于人類胚胎的同時保證子代安全性。

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Application value of vitrification technique in human embryos

WU Chengliang1CHAO Shibin1ZENG Jingren2SU Zhanying1GU Min1
1.Department of Assisted Reproduction，Jiujiang Maternal and Child Care Center in Jiangxi Province，Jiujiang 332000，China；2.Department of Information，Jiujiang Maternal and Child Care Center in Jiangxi Province，Jiujiang 332000，China

［Abstract］Objective To explore the application value of vitrification technique in human embryos. Methods After obtaining the informed consent of 264 infertile patients who tried to have test tube babies in the reproductive center of our hospital from March 2014 to February 2016，vitrification technique was used to preserve the cleavage stage embryos and the embryos meeting the blastaea freezing standards of the patients having received external fertilization-embryo transplantation. The embryo was unfreezed and transplanted according to the patient situation and the clinical pregnancy effect after embryo recovery was observed. Results After 74 periods of vitrification，149 embryos were unfreezed，of which 147 embryos survived，with the survival rate of 98.66%，56 embryos were implanted，with the implant rate of 38.10%，and 42 cases of clinical pregnancy were achieved（27 cases of single birth，14 cases of twins and 1 case of ectopic pregnancy），with the clinical pregnancy rate of 56.76%. Conclusion Vitrification is a preferred method of preserving human embryos as it obtains the desired recovery rate，implantation rate and pregnancy rate.

［Key words］Test tube baby；Vitrification techniaue；Human embryos；Application value

［中圖分類號］R318.52

［文獻標識碼］B

［文章編號］1673-9701（2016）10-0099-03

［基金項目］江西省衛(wèi)生廳科技計劃（20143059）

收稿日期：（2016-03-10）