王東源，王玉舜，谷 禹，金天明，高 豐

（1. 吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，長春 130062；2. 北辰區(qū)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，天津 300400；3. 天津農(nóng)學(xué)院 動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384）

豬圓環(huán)病毒2型吉林株的分離鑒定及全基因序列分析

王東源1,2，王玉舜2，谷 禹2，金天明3，高 豐1,通信作者

（1. 吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，長春 130062；2. 北辰區(qū)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，天津 300400；3. 天津農(nóng)學(xué)院 動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384）

利用大體病理剖檢、病理組織學(xué)觀察、病原分離、PCR檢測等方法對長春郊區(qū)一例豬圓環(huán)病毒病進(jìn)行了病理學(xué)和病原學(xué)診斷，證實造成病豬死亡的原因為豬圓環(huán)病毒2型（porcine circovirus 2, PCV2）感染所致，并將該分離毒株命名為PCV2-JL/China/2015。參照Genbank已公布的PCV2基因序列，設(shè)計合成一對用于PCV2全基因序列擴增的特異性引物，成功獲得PCV2-JL/China/2015毒株的全基因序列。序列測定結(jié)果顯示，PCV2-JL/China/2015毒株基因組全長為1 767 bp；遺傳進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，該分離株與我國湖南長沙病毒株FJ594471-1C01分離株親緣關(guān)系較近，處于同一進(jìn)化分支上。

豬圓環(huán)病毒2型；分離鑒定；全基因序列

豬圓環(huán)病毒?。╬orcine circovirus diseases, PCVD）是由豬圓環(huán)病毒2型（porcine circovirus 2，PCV2）引起的一種新型的傳染病，PCV2在分類上屬于圓環(huán)病毒科，圓環(huán)病毒屬成員，是一種無囊膜、小的、共價閉合的單股環(huán)狀負(fù)鏈DNA病毒，主要侵害8～12周齡的仔豬，臨床感染豬主要表現(xiàn)為消瘦，皮膚蒼白，呼吸障礙，偶爾伴發(fā)有腹瀉和黃疸[1-2]。PCV2具有免疫抑制性，主要損害豬的免疫系統(tǒng)，進(jìn)而引發(fā)繼發(fā)感染，或者與其他病毒一起引發(fā)混合感染，由此給養(yǎng)豬業(yè)造成難以估算的經(jīng)濟損失。目前，該病已被我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定為二類動物疫病。

2014年12月，吉林省長春郊區(qū)一養(yǎng)豬戶飼養(yǎng)豬群發(fā)生疑似豬圓環(huán)病毒病疫情，其新購的90頭斷奶仔豬中先后有10多頭陸續(xù)發(fā)病，發(fā)病仔豬初期出現(xiàn)食欲不振、呼吸困難、體溫輕微升高，不愛運動，常呈趴臥姿勢。后期病豬表現(xiàn)為消瘦、腹瀉、全身皮膚蒼白，部分病豬在后肢和會陰部皮膚可見有暗紅色不規(guī)則的斑點/塊狀丘疹，最后病豬出現(xiàn)全身多系統(tǒng)衰竭而死亡。本研究利用大體病理剖檢、病理組織學(xué)觀察、病原分離、PCR檢測等方法從病原學(xué)和病理學(xué)角度對該起病例的發(fā)生原因進(jìn)行綜合分析，證實為豬圓環(huán)病毒2型感染所致。利用豬腎傳代細(xì)胞（PK-15細(xì)胞）從脾臟、淋巴結(jié)等病料組織中成功分離獲得1株病毒，并將該分離毒株命名為PCV2- JL/China/ 2015。為了進(jìn)一步明確該分離株的分子特性，利用PCR擴增獲得PCV2-JL/China/ 2015的全基因組序列，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹分析。結(jié)果顯示，該分離株與我國湖南長沙病毒株FJ594471-1C01分離株親緣關(guān)系較近，處于同一進(jìn)化分支上。本研究結(jié)果不僅為PCVD的臨床診斷、病理學(xué)研究提供依據(jù)，而且可為進(jìn)一步開展PCV2致病機制、疫苗等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

樣品采集自長春郊區(qū)養(yǎng)豬戶送檢疑似豬圓環(huán)病毒病病死仔豬，PK-15細(xì)胞由本實驗室保存；MiniBEST病毒DNA提取試劑盒、rTaqDNA聚合酶、dNTP Mixture、瓊脂糖、DNA MarkerDL 2000、pMD-18T載體等購自大連Takara公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品；DMEM粉劑、胎牛血清、胰蛋白酶為GIBCO公司產(chǎn)品；青霉素、鏈霉素等購自上海生物工程有限公司；多聚甲醛、蘇木素染液、伊紅染液、無水乙醇、石蠟（熔點分別為54 ℃和56 ℃）、二甲苯、NaCl、KCl等均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 病理剖檢及樣本采集

按照常規(guī)的病理剖檢技術(shù)對臨床送檢病死仔豬進(jìn)行尸檢，并詳細(xì)記錄各個器官的病理變化。采集其心、肝、脾、肺、腎、腸、淋巴結(jié)等組織臟器，其中一部分用4％多聚甲醛進(jìn)行固定，另外一部分則于-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病理切片制作

對采集的心、肝、脾、肺、腎、腸、淋巴結(jié)等組織臟器進(jìn)行修塊，之后置于4％多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定，經(jīng)沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋等處理后進(jìn)行切片，并對其進(jìn)行H.E.染色。對制作好的病理切片，利用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。

1.4 病毒分離與鑒定

采集病死仔豬的淋巴結(jié)、脾臟、肺臟組織，加入滅菌的PBS勻漿研磨制成懸液，之后5 000 r/min 離心15 min，吸取離心上清液，按20％比例加入配制的雙抗溶液，4 ℃感作過夜。經(jīng)0.22 μm濾器進(jìn)行無菌處理后，將其接種于長至單層的PK-15細(xì)胞，37 ℃吸附1.5 h后，加入含2％胎牛血清的DMEM維持液，同時設(shè)立正常細(xì)胞對照。在37 ℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h后收獲第1代病毒，由于PCV2不引起PK-15細(xì)胞病變，因此繼續(xù)盲傳12代，每隔3代收集接種細(xì)胞培養(yǎng)液，提取病毒DNA進(jìn)行PCR檢測。用于PCR檢測的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列為P1：5′-AGAAACAAGTGGTGGGACG-3′；P2：5′-AGGAGTTGACGACAGGGTC-3′。PCR擴增體系為：10×PCR Buffer 2.5 μL，rTaqDNA聚合酶 0.25 μL，dNTP Mixture 0.75 μL，基因組DNA模板 1 μL，P1 1 μL，P2 1 μL，補加ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性5 min，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR擴增結(jié)束后，取7 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 PCV2-JL/China/2015全基因組測序

利用Primer 5.0軟件設(shè)計合成1對特異性引物用于PCV2-JL/China/2015全基因序列擴增，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列為，P3：5′-GCGAATTCAACCTTAACCTTTCTTATTC-3′；P4：5′-ATGAATTCTGGCCCTGCTCCC-3′。

收集1.4中經(jīng)PCR鑒定為陽性的細(xì)胞懸液，反復(fù)凍融3次后，5 000 r/min 離心15 min，吸取離心上清液，利用病毒DNA抽提試劑盒抽提病毒基因組DNA，并以此為模板進(jìn)行PCR擴增。PCR擴增體系為：10×PCR Buffer 2.5 μL，rTaqDNA聚合酶0.25 μL，dNTP Mixture 0.75 μL，基因組DNA模板1 μL，P3 1 μL，P4 1 μL，補加ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性5 min，56.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 40 s，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR擴增結(jié)束后，取7 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。凝膠電泳后，對目的片段進(jìn)行切膠回收，將回收產(chǎn)物連接至pMD-18T載體，16 ℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)藍(lán)白斑篩選可能插入目的片段的白色菌落。挑選單個白色菌落，接種于含AMP＋的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，PCR、酶切鑒定篩選陽性質(zhì)粒菌種，送吉林省庫美生物公司進(jìn)行測序。

1.6 PCV2-JL/China/2015全基因序列分析

利用DNAstar和MEGA5.2等軟件對PCV2-JL/ China/2015毒株進(jìn)行全基因組序列的同源性比較和序列分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，分析其遺傳變異情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床及病理剖檢變化

病豬表現(xiàn)為呼吸困難，被毛蓬亂，皮膚表面可見有明顯的紅色丘疹（圖1A），腹瀉嚴(yán)重。

剖檢發(fā)現(xiàn)，病豬肺臟腫大，間質(zhì)增寬，呈現(xiàn)間質(zhì)性肺炎變化（圖1B）；腎臟水腫且表面散在有灰白色壞死灶；脾臟腫大，邊緣有嚴(yán)重的梗死，質(zhì)地較硬（圖1C）；胃腸黏膜充血，出血；腹股溝淋巴結(jié)腫大，外觀呈灰白色，切面外翻。其他組織器官無明顯病變。

圖1 疑似PCV-2感染仔豬臨床及病理剖檢變化（注：A. 皮膚表面可見紫紅色丘疹；B. 間質(zhì)性肺炎；C. 脾臟壞死）

2.2 病理組織學(xué)觀察結(jié)果

鏡檢，肺臟支氣管周圍可見有大量的淋巴細(xì)胞浸潤，呈現(xiàn)小葉性肺炎的變化（圖2A），肺間質(zhì)和血管腔內(nèi)充滿均質(zhì)淡粉紅色水腫液，并呈現(xiàn)間質(zhì)性肺炎變化（圖2B）。脾臟脾小體淋巴細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松，生發(fā)中心不明顯，副皮質(zhì)區(qū)增寬，動脈周圍淋巴鞘明顯增厚（圖2C）。淋巴小結(jié)內(nèi)有大量的單核細(xì)胞浸潤，呈現(xiàn)出漿液性淋巴結(jié)炎的病理變化（圖2D）。腦組織充血、淤血，小血管及膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)水腫變化（圖2E），并出現(xiàn)明顯的噬神經(jīng)現(xiàn)象（圖2F）。

圖2 采自疑似PCV-2感染仔豬臟器的病理組織學(xué)觀察（注：A. 支氣管肺炎；B. 肺水腫，間質(zhì)性肺炎；C. 脾臟動脈周圍淋巴鞘增厚；D. 漿液性淋巴結(jié)炎；E. 腦水腫；F. 噬神經(jīng)現(xiàn)象）

2.3 病毒分離

將病料處理上清液接種至長滿單層的PK-15細(xì)胞進(jìn)行病毒的分離，與正常細(xì)胞對照相比，接種病料上清液的細(xì)胞未見有細(xì)胞致病效應(yīng)（CPE）出現(xiàn)，繼續(xù)盲傳至第12代，選取第1、3、6、9、12代細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示，均擴增出與預(yù)期目的基因片段大小一致的條帶，約為494 bp（圖3）。

圖3 病料接種PK-15細(xì)胞中PCV2的PCR鑒定結(jié)果（M：DLMarker 2000；1～5：第1、3、6、9、12代細(xì)胞培養(yǎng)液的PCR擴增結(jié)果；6：陽性對照；7：陰性對照）

2.4 PCV2-JL/China/2015全基因組測序結(jié)果

利用P3和P4對2.3鑒定為陽性的細(xì)胞液進(jìn)行PCR擴增，結(jié)果顯示，擴增獲得與預(yù)期片段大小一致的目的條帶，長度約為1 767 bp（圖4）?；厥誔CR擴增產(chǎn)物回收后，與pMD18-T克隆載體連接，構(gòu)建pMD18-T-PCV2的重組質(zhì)粒并對其進(jìn)行測序，結(jié)果顯示PCV2-JL/China/2015分離株的大小為1 767 bp。

圖4 PCV2-JL/China/2015全基因組PCR擴增結(jié)果（M：DLMarker 2000；1～4：PCR擴增產(chǎn)物；5：陰性對照）

2.5 遺傳進(jìn)化樹分析

將所測定的PCV2-JL/China/2015分離株全基因組與GenBank中公布的來自中國、德國、英國、朝鮮等多個國家和地區(qū)共計12個PCV2毒株進(jìn)行序列比較，應(yīng)用DNAStar軟件包中MegAlign軟件的Clustal V方法計算遺傳距離，根據(jù)遺傳距離繪制核苷酸系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖5）。結(jié)果表明，PCV2-JL/China/2015分離株與我國的湖南長沙FJ594471-1C01毒株的親緣關(guān)系較近。

圖5 PCV2-JL/China/2015分離株全基因組的進(jìn)化樹分析

3 討論

近年來，豬圓環(huán)病毒在世界多個國家和地區(qū)廣泛流行，如法國、德國、西班牙、美國、丹麥等。此外，該病也先后在我國湖北、湖南、河北、吉林等十多個省份發(fā)生，并呈現(xiàn)出蔓延的趨勢，嚴(yán)重制約了我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[3-5]。豬圓環(huán)病毒（PCV）作為斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的主要病原，以侵害斷奶仔豬的免疫器官為主，如脾臟、體表淋巴結(jié)等，導(dǎo)致感染仔豬免疫力和抵抗力的下降，進(jìn)而誘發(fā)其他病原的繼發(fā)感染或混合感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[6-7]。

本試驗對2014年12月吉林省長春郊區(qū)一養(yǎng)豬戶飼養(yǎng)豬群發(fā)生疑似豬圓環(huán)病毒病疫情進(jìn)行探討分析，從病原學(xué)和病理學(xué)角度出發(fā)，利用大體病理剖檢、病理組織學(xué)觀察、病原分離、PCR等方法進(jìn)行檢測。一方面對送檢病死仔豬進(jìn)行了常規(guī)的病理剖檢，另一方面采集其心、肝、脾、肺、腎、腦以及腸等各組織臟器進(jìn)行病理學(xué)切片，從眼觀病理變化和鏡下病理組織學(xué)角度對其死亡病因進(jìn)行分析。病理組織學(xué)觀察結(jié)果表明，其肺臟、脾臟、淋巴結(jié)以及腦等組織臟器均發(fā)生病變，其中肺臟呈現(xiàn)間質(zhì)性肺炎、肺水腫、支氣管肺炎的變化。通常間質(zhì)性肺炎多發(fā)生于病毒感染的情況下，而且支氣管周圍有大量淋巴細(xì)胞浸潤，據(jù)此可以推測該病的發(fā)生原因很可能為病毒感染所致。發(fā)生間質(zhì)性肺炎時，由于肺間質(zhì)增寬，導(dǎo)致肺泡表面的活性物質(zhì)減少，肺的順應(yīng)性降低，呼吸膜增厚，因而引起肺換氣障礙，致使病豬在臨床上表現(xiàn)呼吸困難等癥狀。脾臟動脈周圍淋巴鞘增厚，富含大量的T淋巴細(xì)胞，表明該病原引起的免疫反應(yīng)以細(xì)胞免疫為主。腦表現(xiàn)出水腫、非化膿性腦炎的變化，致使病豬臨床上出現(xiàn)震顫等神經(jīng)癥狀。另一方面，利用PK-15細(xì)胞從脾臟、淋巴結(jié)等組織中進(jìn)行病毒的分離[8-9]，由于PCV2不引起CPE的產(chǎn)生，因此在PCV2分離過程中，對接種病料上清液后第1、3、6、9、12代細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示，均擴增出與預(yù)期目的基因片段大小一致長約494 bp的條帶，該結(jié)果表明本研究成功分離獲得1株病毒，并將該分離毒株命名為PCV2-JL/China/2015。為了進(jìn)一步明確該分離株的分子特性，利用PCR擴增獲得PCV2-JL/China/2015的全基因組序列，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹分析，結(jié)果顯示，該分離株與我國湖南長沙病毒株FJ594471-1C01分離株親緣關(guān)系較近，處于同一進(jìn)化分支上。本研究結(jié)果不僅為PCVD的臨床診斷、病理學(xué)研究提供理論依據(jù)，并為進(jìn)一步開展PCV2病原學(xué)、疫苗的研制以及防控措施的制定奠定基礎(chǔ)。

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Isolation and Identification of Porcine Circovirus 2（PCV2）Isolated from Jilin Province and Its Complete Genome Sequence Analysis

WANG Dong-yuan1,2, WANG Yu-shun2, GU Yu2, JIN Tian-ming3, GAO Feng1,CorrespondingAuthor
（1. College of Veterinary Medicine, Jilin University, Changchun 130062, China; 2. Beichen Breeding Industry Development Service Center, Tianjin 300400, China; 3. College of Animal Science and Veterinary, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

An suspected porcine circovirus disease was confirmed by necropsy, histopathology observation, virus isolation and PCR detection, which was caused by porcine circovirus 2（PCV2） infection. A porcine circovirus strain（PCV2-JL/China/2015）was successfully isolated fromspleens and lymph nodesby passaging in PK-15 cells. A pair of primers based on PCV2 was designed according to the published sequences in GenBank. The length of complete genome of PCV2-JL/China/2015 was 1 767 bp by sequencing analysis. The results of the phylogenetic tree analysis indicated that there was a close genetic relationship between PCV2-JL/China/2015 and FJ594471-1C01 isolate from Changsha city.

porcine circovirus 2; isolation and identification; complete genome sequence

S852.65

A

1008-5394（2016）04-0043-04

2016-07-18

國家重點研發(fā)計劃項目“豬重要疫病的診斷與檢測新技術(shù)研究（豬重要疫病混合感染鑒別診斷技術(shù)研究）”（2016YFD050 0707）；天津市優(yōu)秀科技特派員項目“規(guī)?；i場腹瀉病的監(jiān)測及凈化技術(shù)研究”（16JCTPJC45000）；天津市農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化與推廣項目“規(guī)模化豬場仔豬腹瀉病的監(jiān)測及防控技術(shù)推廣”（201601380）

王東源（1981-），男，天津市人，獸醫(yī)師，學(xué)士，主要從事臨床獸醫(yī)診斷工作。E-mail：xdtzxz@163.com。

高豐（1961-），男，吉林大安人，教授，博士，主要從事獸醫(yī)病理學(xué)的教學(xué)和科研工作。E-mail：gaofeng@jlu.edu.cn。