張占恒，高珂珂，李小慧，林 靜，洪瑩瑩，金天明，韓文瑜

（1. 吉林大學 動物醫(yī)學學院，長春 130062；2. 天津醫(yī)科大學 實驗動物科學部，天津300070；3. 天津農(nóng)學院 動物科學與動物醫(yī)學學院，天津 300384）

狨猴腹瀉重要病原菌的分離鑒定與藥敏試驗研究

張占恒1,2，高珂珂3，李小慧3，林 靜3，洪瑩瑩3，金天明3，韓文瑜1,通信作者

（1. 吉林大學 動物醫(yī)學學院，長春 130062；2. 天津醫(yī)科大學 實驗動物科學部，天津300070；3. 天津農(nóng)學院 動物科學與動物醫(yī)學學院，天津 300384）

狨猴腹瀉病是一種常見疾病，臨床癥狀主要表現(xiàn)為腹瀉、消瘦、精神不振等。對臨床發(fā)現(xiàn)的天津市某動物中心腹瀉狨猴，采集糞便進行細菌分離培養(yǎng)、顯微鏡鏡檢、生化試驗并進行16S rRNA片段擴增等，鑒定出導致該猴群腹瀉的病原菌主要是大腸桿菌和沙門菌。藥敏試驗顯示大腸桿菌對慶大霉素高度敏感，沙門菌對慶大霉素和氨芐西林高度敏感，為該病的治療提供了依據(jù)。

狨猴；腹瀉；病原菌；分離鑒定；藥敏試驗

狨猴是一種珍貴的小型靈長類動物，主要分布于南美洲地區(qū)。狨猴由于體型小，繁殖率高，與人類的疾病應急生理反應很相似，特別是在實驗研究過程中用藥量小，因此被廣泛用于動物學，生殖學，藥理學等研究[1-2]。腹瀉病作為一種常見疾病，可造成狨猴消瘦，營養(yǎng)不良，繁殖率下降甚至死亡。

本試驗采集天津市某動物中心腹瀉狨猴的糞便，進行細菌分離培養(yǎng)、顯微鏡鏡檢、生化試驗等實驗室診斷，分離出導致腹瀉的重要病原菌—大腸桿菌、沙門菌。對病原菌分離株進行藥敏試驗，結(jié)果顯示，大腸桿菌對氯霉素高度敏感，沙門菌對慶大霉素和氨芐西林高度敏感。本試驗結(jié)果對該動物中心腹瀉狨猴的合理用藥提供了科學依據(jù)，對預防和治療狨猴腹瀉病具有一定的臨床指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源

采集患病狨猴肛門附近的新鮮糞便，裝入無菌離心管中，4 ℃運輸，2 h內(nèi)送回實驗室，4 ℃保存，備用。

1.1.2 主要試劑與培養(yǎng)基

革蘭氏染液，購自南京建成科技有限公司；微量生化管，購自杭州天和微生物試劑有限公司；XLD培養(yǎng)基購自青島海博生物技術有限公司；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基等均按常規(guī)方法制備；基本生化試劑等均由實驗室提供。

1.1.3 引物設計與合成

根據(jù)已發(fā)表的細菌16S rRNA序列設計一對通用引物[3]，引物名稱與序列見表1。

表1 PCR引物名稱及序列

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離純化

無菌采取患病狨猴糞便，取適量生理鹽水稀釋10倍，再依次倍比稀釋至10-9，每個梯度分別接種于LB固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)16～20 h后，挑取單個菌落分別接種于麥康凱和XLD培養(yǎng)基，培養(yǎng)并觀察菌落形態(tài)，再挑取單個菌落進行分離培養(yǎng)。觀察并記錄病原菌菌落的生長狀況。

1.2.2 病原菌擴大培養(yǎng)

分別挑取單個菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)16～18 h，4 ℃保存，備用。

1.2.3 顯微鏡觀察

用移液槍無菌移取20 μL搖勻的菌液，置于干凈的載玻片上并攤勻，自然晾干后，進行革蘭氏染色，在油鏡下觀察記錄病原菌的菌體形態(tài)特征。

1.2.4 生化試驗

選取葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇等生化管，打開生化管后，用接種環(huán)每管分別加入分離出的病原菌，倒置生化管于37 ℃ 5％的CO2恒溫培養(yǎng)箱36 h，觀察記錄每個生化管中的現(xiàn)象。

1.2.5 病原菌16S rRNA基因的擴增與測序

以菌液為模板，XJTY-F和XJTY-R為上下游引物，對病原菌16S rRNA基因進行擴增。20 μL反應體系：2×Taq酶預混液10 μL，滅菌去離子水 8 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL。反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。取10 μL PCR產(chǎn)物于1％瓊脂糖凝膠進行電泳，于自動凝膠成像儀上觀測結(jié)果。剩余PCR產(chǎn)物-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR產(chǎn)物由上海生工生物股份有限公司測序，測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast分析。

1.2.6 藥敏試驗

取生理鹽水，調(diào)液體培養(yǎng)的菌液濃度至0.5麥氏單位，含菌量在1×108～2×108CFU/mL。取滅菌的棉簽拭子浸入純化好的菌懸液中，將多余的菌液在管壁擠出，涂布在培養(yǎng)基上，旋轉(zhuǎn)平皿60°，重復涂3次。室溫靜置3～5 min，無菌條件下將藥敏片放在固體培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)基上均勻放置6個藥敏片，于37 ℃ 5％的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，測量抑菌圈的直徑，并根據(jù)判斷標準[4]判定該細菌對各抗生素藥物的敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀

患病狨猴腹瀉，糞便呈黃色黏液狀、脫毛、精神沉郁、反應遲鈍、食欲下降、機體消瘦，個別呈現(xiàn)嘔吐、發(fā)熱等癥狀。

2.2 菌落特征和形態(tài)

分離出的病原菌Ⅰ在麥康凱培養(yǎng)基上呈現(xiàn)光滑、圓形、桃紅色的菌落（圖1），油鏡下可見細菌呈兩端鈍圓的短小桿狀，不呈長鏈狀排列，無芽孢，革蘭氏陰性菌（圖2），在LB上菌落黃色（圖3），有白色絮狀沉淀。

圖1 病原菌Ⅰ在麥康凱培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

圖2 油鏡下病原菌Ⅰ的革蘭染色形態(tài)

圖3 病原菌Ⅰ在LB培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

病原菌Ⅱ使XLD培養(yǎng)基變紅，菌落中央黑心（圖4），油鏡下可見細菌呈兩端鈍圓的桿狀，革蘭氏陰性菌（圖5）。

圖4 病原菌Ⅱ在XLD培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

圖5 在油鏡下病原菌Ⅱ的革蘭染色形態(tài)

2.3 生化試驗結(jié)果

將分離出的病原菌Ⅰ接種到生化管，37 ℃培養(yǎng)36 h，均可發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇、賴氨酸、鳥氨酸、靛基質(zhì)，不發(fā)酵硫化氫、尿素（表1-1），其他生化特性與大腸桿菌的特征相符合，初步確定為大腸桿菌。

將分離出的病原菌Ⅱ接種到生化管，37 ℃培養(yǎng)36 h，均可發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、賴氨酸、硫化氫，不發(fā)酵乳糖、蔗糖、鳥氨酸、靛基質(zhì)、尿素（表1-2），其他生化特性與沙門菌的特征相符合，初步確認為沙門菌。

表1-1 病原菌Ⅰ的生化試驗結(jié)果

表1-2 病原菌Ⅱ的生化試驗結(jié)果

2.4 分離菌株16S rRNA基因擴增結(jié)果

以提取的分離菌株基因組為模板，XJTY-F、XJTY-R為引物進行PCR擴增，結(jié)果擴增出約1 500 bp的特異性片段（圖6）。將PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術服務有限公司測序，結(jié)果與GenBank中已發(fā)表的大腸桿菌基因序列和沙門菌序列進行比對，同源性高達99.0％和99.5％。證明分離菌分別為大腸桿菌和沙門菌。

圖6 分離菌株16S rRNA基因PCR擴增結(jié)果（注：1～5：分離菌16S rRNA基因的擴增產(chǎn)物；M：DM 2000）

2.5 藥敏試驗結(jié)果

藥敏試驗結(jié)果顯示，分離株大腸桿菌對慶大霉素高度敏感，對環(huán)丙沙星和大觀霉素中度敏感；對卡那霉素、四環(huán)素和紅霉素不敏感；對氨芐霉素、氧氟沙星、氟哌酸和新霉素耐藥（如表2-1）。分離株沙門菌對慶大霉素和氨芐西林高度敏感；對卡那霉素、大觀霉素和環(huán)丙沙星中度敏感；對鏈霉素、四環(huán)素、氧氟沙星和紅霉素不敏感；對氟哌酸和新霉素耐藥（表2-2）。

表2-1 大腸桿菌的藥敏試驗結(jié)果

表2-2 沙門菌的藥敏試驗結(jié)果

3 結(jié)論與討論

狨猴作為一種實驗動物，其健康狀況關系到試驗結(jié)果的可靠性，而腹瀉病是狨猴的常見疾病，發(fā)病后應引起高度重視，及時找出傳染源和致病原因，并加強治療。感染細菌、真菌、病毒、寄生蟲以及應激、環(huán)境因素的改變都可能引起狨猴的腹瀉，細菌感染是其中常見的病因之一，既可能是感染單一細菌，也有可能是多種細菌混合感染。目前，沙門菌和大腸桿菌感染猴導致腹瀉比較普遍[5]，志賀氏菌感染也常見報道[6]。本試驗采集天津市某動物中心腹瀉狨猴的糞便，進行細菌分離培養(yǎng)、顯微鏡鏡檢、生化試驗等實驗室診斷，分離出導致猴群本次腹瀉的病原菌主要是大腸桿菌和沙門菌。

本試驗應用聚合酶鏈反應（PCR）法檢測細菌，具有準確和特異的優(yōu)點。生物細胞DNA分子的一級結(jié)構(gòu)中既具有保守的片段，又具有變化的堿基序列，保守的片段反映了生物物種間的親緣關系，而高變片段則能表明物種間的差異，那些保守的或高變的特征性核苷酸序列則是不同分類級別生物（如科、屬、種）鑒定的分子基礎[7]，所以可根據(jù)rDNA（核糖體DNA）序列設計用于某一種、屬、科甚至更大類群范圍的微生物檢測或鑒定的探針。目前，以16S rRNA為聚合酶鏈式反應（PCR）擴增靶分子的細菌快速分類鑒定的標準方法已經(jīng)成功建立[8-9]，該方法可以應用于細菌種、屬和科的鑒定及系統(tǒng)進化分析等。

在本試驗檢測的11種常用藥物中，不同的分離菌株對不同的抗生素產(chǎn)生耐藥性。這種現(xiàn)象可能是發(fā)生細菌病時未開展細菌藥敏試驗，盲目亂用抗生素導致的。致病菌的耐藥性增強的情況復雜，臨床用藥存在很大困難。致病性大腸桿菌的耐藥性現(xiàn)象已普遍存在，而且多為多重耐藥[10]，沙門菌和大腸桿菌類似，所以在抗菌藥物的選擇上要考慮準確的劑量和療程，采取適當?shù)穆?lián)合用藥、交叉用藥、輪換用藥的方式。一方面可以充分發(fā)揮抗菌藥物之間的協(xié)同作用，增加療效；另一方面可以避免病原菌長期與某一種藥物接觸，增加產(chǎn)生耐藥性機率。同時合理應用維生素、益生素等輔助藥物，恢復機體的生理機能，增強自身免疫能力，真正做到合理用藥和科學用藥，最大限度的降低耐藥性的產(chǎn)生。

本試驗結(jié)果對該動物中心腹瀉狨猴的合理用藥提供了科學依據(jù)，對預防和治療狨猴腹瀉病具有一定的指導意義。

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Study on Isolation and Identification of Marmoset Diarrhoea Pathogenic Bacteria Strain and Its Sensitivity Tests to Drug

ZHANG Zhan-heng1,2,GAO Ke-ke3, LI Xiao-hui3, LIN Jing3, HONG Ying-ying3, JIN Tian-ming3, HAN Wen-yu1,Corresponding Author
（1. College of Veterinary Medicine, Jilin University, Changchun 130062, China; 2. Department of Laboratory Animal, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China; 3. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China.）

Diarrhoea is a kind of marmoset disease which mainly caused diarrhea, weight loss and spirit depressed. In this paper, the stool samples were collected from marmoset in an animal center in Tianjin. Then the samples were used for a series of laboratory diagnosis, such as bacterial isolation and culture, microscopic examination, biochemical tests and PCR detection of 16s rRNA to identified the isolated strains. The results showed that the isolated strains wereEscherichia coliandSalmonella. Drug sensitive test was examined, and the results showed that the isolatedEscherichia colistrain is highly sensitive to gentamicin, the isolatedSalmonellastrain is highly sensitive to gentamicin and ampicillin.

marmoset; diarrhoea; isolation and identification; drugs sensitive test

S852.61

A

1008-5394（2016）04-0005-04

2016-08-10

天津市優(yōu)秀科研創(chuàng)新團隊資助項目“獸醫(yī)生物技術”（TD12-5019）；天津市優(yōu)秀科技特派員項目“規(guī)?；i場腹瀉病的監(jiān)測及凈化技術研究”（16JCTPJC45000）；天津市農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化與推廣項目“規(guī)?；i場仔豬腹瀉病的監(jiān)測及防控技術推廣”（201601380）

張占恒（1988-），男，天津市人，實驗師，碩士，主要從事病原微生物檢測與耐藥性的研究。E-mail：zhangzhanheng@tmu.edu.cn。

韓文瑜（1955-），男，河北阜城人，教授，博士，主要從事病原微生物檢測與耐藥性的研究。E-mail：hanwy@jlu.edu.cn。