王春仁　馮曉明　韓倩倩　中國食品藥品檢定研究院?。ū本?00050）

組織工程醫(yī)療產(chǎn)品質量控制的關鍵技術要求和標準

王春仁馮曉明韓倩倩中國食品藥品檢定研究院（北京100050）

內(nèi)容提要： 我國組織工程醫(yī)療產(chǎn)品的研發(fā)迅速，已逐漸從實驗室階段進入臨床研究階段，有的產(chǎn)品已經(jīng)實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，如何控制組織工程醫(yī)療產(chǎn)品的安全性和有效性是實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的關鍵。本文對組織工程醫(yī)療產(chǎn)品的種子細胞來源、細胞的質量控制、培養(yǎng)基、材料支架表征等質量控制的關鍵技術要求和標準進行了綜述。

組織工程 組織工程醫(yī)療產(chǎn)品安全性有效性評價標準

0.前言

組織工程醫(yī)療產(chǎn)品（tissue engineered medical products，TEMPs）是指用組織工程技術和工藝制備的，用于修復、改善、再生組織或器官結構與功能的醫(yī)用產(chǎn)品。組織工程醫(yī)療產(chǎn)品通常是復合產(chǎn)品，細胞及細胞類成分是TEMPs的重要組成部分，因此，細胞與TEMPs產(chǎn)品的質量和安全密切相關。我國TEMPs的研究發(fā)展迅速，已逐漸從實驗室階段開始進入臨床研究階段，因此，如何控制用于TEMPs產(chǎn)品生產(chǎn)的質量和安全，如何制定TEMPs的質量標準不僅對于保證TEMP產(chǎn)品的安全性具有重要意義，也可以促進我國TEMPs產(chǎn)品的健康發(fā)展，解決組織工程產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化的瓶頸問題。在國家科技項目的支持下，中國藥品生物制品檢定所組織我國組織工程方面的專家、管理人員和科研工作者起草了組織工程產(chǎn)品的質量和安全評價相關標準，其中12個標準已經(jīng)報國家食品藥品監(jiān)督管理局批準發(fā)布實施。對于組織工程醫(yī)療產(chǎn)品的研究、開發(fā)和產(chǎn)業(yè)發(fā)展起到了促進和指導作用。

1.種子細胞的質量控制

生產(chǎn)過程中所使用的各種組份應提供來源、質量標準及其所進行的檢測項目；應詳細說明生產(chǎn)過程中所用的各種試劑，是人源還是動物來源，豬源材料是否進行了豬細小病毒檢測，反芻動物來源是否在可能污染牛海綿狀腦炎病毒，所用試劑是否獲得了FDA的批準，如果所用試劑是研究級試劑，應提供其來源、安全性及性能資料。如無菌試驗、內(nèi)毒素、支原體，及外源因子檢測結果，進行功能性分析、純度檢測，有害殘留溶劑檢測結果。如果這些試劑已知有或潛在有毒性，則需對工藝進行驗證，確保在終產(chǎn)品中已無這些試劑殘留。

對同種異體或自體細胞應說明細胞來源的組織及細胞類型；是否進行過體內(nèi)動員及其所用的動員方法；細胞采集所用的具體方法；采集單位的名稱及地址，供體篩查的內(nèi)容、方法及結果以評價供體資質；對于自體供體，如果供體某種病原體檢測為陽性，或未進行篩查，則需有記錄可以說明在產(chǎn)品的生產(chǎn)過程中，組織培養(yǎng)方法是否會造成病毒或其他外源因子的增殖或傳播而危及到其他人。對于同種異體，應進行病毒篩查，如HIV-I/II，HBV、HCV、HTLV-I/II、CMV、EBV的檢測等，并記錄所用試劑及檢測方法。

如果在生產(chǎn)過程中使用了細胞系，則應記錄細胞系歷史、來源、分離、檢定及主細胞庫（MCB）和工作細胞庫（WCB）檢定頻率。主細胞包括：①外源因子污染的檢測，如無菌試驗、支原體檢測、體內(nèi)及體外法的外源病毒檢測；②特殊病原體的檢測，人源細胞應檢測CMV、HIV-I/ II，HBV、HCV、HTLV-I/II、EBV，牛和/或豬外源因子，應均為陰性；③細胞鑒別或均一性檢測，如細胞表型、基因型或其他標記；④細胞純度檢測；⑤細胞活性及細胞成熟性檢測；⑥記錄細胞培養(yǎng)條件，如所用培養(yǎng)基、試劑或組份及其檢測報告；⑦記錄細胞凍存、運輸、復蘇的內(nèi)容，如細胞密度、凍存支數(shù)、凍存溫度、細胞庫位置；⑧多次傳代后細胞遺傳及表型穩(wěn)定性及復蘇后細胞存活率。工作細胞庫包括：①細菌、真菌污染的檢測；②支原體檢測；③一定的鑒別試驗。

對生產(chǎn)工藝應描述自體或同種異體細胞采集、加工方法及細胞培養(yǎng)條件，包括細胞采集體積、物理或酶消化步驟、所用細胞篩選或分離儀器，培養(yǎng)系統(tǒng)、在線檢測；對于采用放射性照射的體細胞治療產(chǎn)品，應提供細胞照射后仍具有其特性但無復制能力的數(shù)據(jù)，放射源的校正；應詳細記錄從細胞收集到最終收獲間每一步的時間間隔，從細胞采集到最后收獲間細胞保存的時間及條件，保持細胞穩(wěn)定性的操作程序；應詳細描述細胞收獲的過程，細胞收獲方法、洗滌條件及洗滌介質，如果要凍存，應說明凍存的條件及保存時限；應提供終產(chǎn)品的配方，應說明在最終制劑中是否添加生長因子或人血清白蛋白，并注明其來源、供貨商、終濃度。提供終產(chǎn)品中細胞濃度、運輸條件等相關數(shù)據(jù)。

2.細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基的要求

培養(yǎng)基及其添加成份為細胞體外培養(yǎng)提供生長所需的營養(yǎng)成份，也是引入外源因子而造成細胞污染的來源之一，從而也是影響細胞安全性的一個因素，因此，控制培養(yǎng)基的質量是減少細胞污染提供產(chǎn)品安全性的一個重要措施。對培養(yǎng)基的要求分為兩個方面，即基礎培養(yǎng)基及其所添加的各種成份。細胞、組織及器官的生長、維持用的所有培養(yǎng)基及試劑應盡可能采用可用于臨床的培養(yǎng)基及試劑，至少應選擇具有良好資質供應商購買，而且，盡可能選擇非動物來源的或不含動物來源組份的培養(yǎng)基及試劑。

如果培養(yǎng)基中要添加人源成份，如各種細胞因子，應盡可能選擇已獲得國家批準的臨床用產(chǎn)品。如果無法獲得國家批準的臨床用產(chǎn)品，則盡可能從符合GMP要求的供應商購買，同時應建立其質量標準并對其進行檢測。人源材料還應檢測包括人乙型肝炎病毒（HBV），人丙型肝炎病毒（HCV），人免疫缺陷病毒I/II型（HIVI/II）及梅毒螺旋體等病原微生物可能造成的污染。

如果培養(yǎng)基中必須添加動物源性成份，如動物源性激素或細胞因子等，則至少應充分證明這些培養(yǎng)基或試劑的制備過程采用了病毒滅活工藝，而且病毒滅活工藝經(jīng)過了充分的驗證具有有效的的滅活效果。

如果在細胞培養(yǎng)過程中必須使用動物來源的細胞、組織及其衍生物等生物活性材料，如作為飼養(yǎng)細胞，則這些成份應從特定的動物飼養(yǎng)單位獲取。如從封閉的無病原體種群的動物獲取，而且應對原種進行監(jiān)測并定期進行病原微生物的檢測。

關于血清及抗生素的使用，各個國家的要求稍有所不同。但從血清安全性的角度考慮，培養(yǎng)基中應避免使用任何血清。但如果有些細胞在培養(yǎng)過程中必須添加血清激活或誘導，如牛血清，則必須對每批牛血清進行外源因子的檢測，應至少包括無菌、支原體及牛源性病毒檢測，而且應驗證生產(chǎn)過程不會造成牛源性病毒的擴增。而為保證細胞的穩(wěn)定性，特別是長期培養(yǎng)細胞的穩(wěn)定性，并能及時發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)環(huán)境及生產(chǎn)過程中可能造成的污染，用于生產(chǎn)的培養(yǎng)基中應盡可能不使用抗生素。

3.材料和支架的要求

為滿足組織工程產(chǎn)品預期設計的性能達到要求，在產(chǎn)品設計時應考慮以下要點：材料及支架的生物相容性應符合GB/T16886系列標準的要求；材料及支架的物理、力學和化學特性應根據(jù)預期用途的性能要求選擇合適的材料，并考慮制造、處理、滅菌和貯存對材料的影響。當藥物作為組織工程醫(yī)療產(chǎn)品的組成部分時，對其應按照藥品法規(guī)進行評價。作為組成部分的藥物的原有性能不應受組織工程醫(yī)療產(chǎn)品的影響，反之亦然。

組織工程醫(yī)療產(chǎn)品使用的材料，包括遺傳工程生產(chǎn)的生物材料，應在植入狀態(tài)時具有可接受的生物相容性。根據(jù)GB/T16886.1的原則進行評價或從在相似的臨床應用中已證實的合適材料中選擇。評價的主要指標有細胞毒性、致敏試驗、皮內(nèi)刺激試驗、全身毒性試驗、血液相容性試驗、遺傳毒性、植入試驗、致癌試驗、生殖與發(fā)育毒性和生物降解試驗。

應對支架材料的以下指標進行表征：降解特性；孔隙率和孔隙大??；形態(tài)結構；細胞粘附；化學成分；分子量；滅菌適宜性；力學特性；儲存條件和時間。

制造過程中如果使用其他輔助材料，應對加工過程中使用的其他輔助材料和設備的質量進行適宜性評價。

對動物或人體來源的材料可能的傳染性因子傳播帶來的危險性進行評價，包括非細菌和非病毒性因子。生物源性材料還應進行免疫源性評價。

用于組織工程的可降解生物醫(yī)用材料有兩大類：一類是來源于動物和植物組織的天然生物材料，主要有膠原蛋白、糖氨聚糖、殼聚糖、海藻酸鹽、纖維蛋白等。天然材料通常具有良好的生物相容性，并且具有一定的生物活性和細胞外基質的作用，適合細胞的生長和分化的要求。這些材料可以在生物體內(nèi)酶的作用下將其降解，其降解產(chǎn)物常是體內(nèi)存在的物質對人體沒有毒性，缺陷是天然材料的力學強度有時不能滿足要求。有的可能存在傳染性疾病的風險，有的還具有一定的免疫原性問題；另一類可降解材料是合成的生物材料，主要有聚α-羥基酸包括聚乳酸、聚羥基乙酸、聚ε-已內(nèi)酯聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸等。這些材料在含有水的人體內(nèi)環(huán)境中能被生物酶水解分解，高分子主鏈斷裂，分子量逐漸減少，最終成為單體或分解成水和二氧化碳。合成材料也有較好的生物相容性，但在支持細胞粘附和生長方面不及天然材料，合成材料沒有抗原性和傳染疾病的風險，其力學強度可以根據(jù)需要合成。

天然材料和合成材料各有優(yōu)缺點，因此在實際使用時常采用天然材料和合成材料的復合型材料，以滿足組織工程支架各個方面的要求。在組織工程中除考慮材料的化學性質和物理特性外，還應該考慮支架的結構，如空隙狀態(tài)、大小、連通性、空隙率、力學強度等。支架的這些要求對于細胞的粘附和生長，以及細胞所需營養(yǎng)物質的傳遞和代謝產(chǎn)物的交換是很重要的。一般要求組織工程支架的空隙率在80%以上，孔徑在100～500μm，空隙之間應有良好的貫通性。

4.組織工程醫(yī)療產(chǎn)品標準

已有12個組織工程相關的質量和安全評價標準經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局批準發(fā)布實施：（1）YY0606.3-2007組織工程醫(yī)療產(chǎn)品通用分類指南，標準規(guī)定了組織工程產(chǎn)品的各個方面，包括：組織工程的定義和范圍、產(chǎn)品分類、組成成分、產(chǎn)品表征、評價分析、微生物安全以及傳染性物質的要求以及檢測方法。（2）YY0606.4-2007組織工程皮膚產(chǎn)品分類指南，標準規(guī)定了用來治療皮膚損傷，替代恢復皮膚成分和功能的組織工程產(chǎn)品和材料的術語和分類標準。（3）YY0606.5-2007組織工程醫(yī)療產(chǎn)品用基質材料和支架表征和測試指南，標準規(guī)定了組織工程醫(yī)療產(chǎn)品用基質材料和支架的理化性能的技術要求。（4）YY0606.12-2007用于組織工程醫(yī)療產(chǎn)品的細胞、組織及器官加工處理指南，本標準主要規(guī)定了用于組織工程醫(yī)療產(chǎn)品的細胞、組織和器官的加工處理、檢定生產(chǎn)以及質量保證。（5）YY0606.9-2007組織工程醫(yī)療產(chǎn)品用透明質酸鈉，標準規(guī)定了組織工程產(chǎn)品的支架材料的原材料之一透明質酸鈉的質量標準。標準對材料的理化性能和生物性能作出了規(guī)定，達到醫(yī)用級水平，滿足組織工程產(chǎn)品生產(chǎn)的需要。（6）YY0606.8-2008組織工程醫(yī)療產(chǎn)品用海藻酸鈉，標準規(guī)定了組織工程產(chǎn)品的支架材料的原材料之一海藻酸鈉的質量標準。標準對材料的理化性能和生物性能作出了規(guī)定，達到醫(yī)用級水平，滿足組織工程產(chǎn)品生產(chǎn)的需要。（7）YY0606.10-2008骨誘導材料評價指南，標準規(guī)定脫鈣同種異體骨體內(nèi)誘導骨形成的試驗方法。（8）YY0606.13-2008細胞自動計數(shù)指南，標準規(guī)定組織工程用細胞的自動計數(shù)的方法。（9）YY/ T0606.14-2014組織工程醫(yī)療產(chǎn)品第14部分：評價基質及支架免疫反應的試驗方法-ELISA法。（10）YY/T0606.15-2014組織工程醫(yī)療產(chǎn)品第15部分：評價基質及支架免疫反應的試驗方法-淋巴細胞增殖試驗。（11）YY/T0606.20-2014組織工程醫(yī)療產(chǎn)品第20部分：評價基質及支架免疫反應的試驗方法-細胞遷移試驗。（12）YY/ T0606.25-2014組織工程醫(yī)療產(chǎn)品第25部分：動物源生物材料DNA殘留量測定法：熒光染色法。

風險管理也是醫(yī)療器械安全性保障的重要組成部分，企業(yè)應建立和保持與組織工程醫(yī)療產(chǎn)品有關的危害、識別和評價相關的風險，控制這些風險并監(jiān)視控制有效性的過程。這個過程應形成文件并包括下列要素：風險識別；風險分析；風險控制和生產(chǎn)后的信息。風險管理按照醫(yī)療器械行業(yè)標準《YY/T0316-2003（ISO14971：2000）醫(yī)療器械風險管理對醫(yī)療器械的應用》的規(guī)定進行。

［1］ FDA， Guidance for Reviewers ，Instructions and Template for Chemistry， Manufacturing，and Control（CMC） Reviewers of Human Somatic Cell Therapy Investigational new Drug Applications（INDs），2003.

［2］ USA， Federal Register ，Part II， 21 CFR Part 210， 211， 820， and 1271， Eligibility Determination for Donors of Human Cells， Tissues，and Cellular and Tissue-Based Products； Final Rule and Notice.

［3］ ASTM F2210-02 Standard guide for processing cells，tissues，and organs for use in tissue engineered medical products.

［4］ 王軍志:《生物技術藥物研究開發(fā)和質量控制》（第二版），科學出版社，2007.

［5］ European Pharmacopeia-Method 5.2.3-Cell substrates for the production of vaccines for human use.

［6］ WHO - Recommendations for the evaluation of animal cell cultures as substrates for the manufacture of biological medicinal products and for the characterization of cell banks 2010.

［7］ FDA Guidance for Industry-Characterization and Qualification of Cell Substrates and other Biological Materials Used in the Production of Viral Vaccines for Infectious Disease Indications 2010

［8］ FDA Guidance-Potency Tests for Cellular and Gene Therapy 2011.

［9］ FDA Guidance for Industry-Current Good Tissue Practice （CGTP） and Additional Requirements for Manufactures of Human Cells，Tissues， and Cellular and Tissue-Based Products （HCT/Ps）.

［10］ 國家衛(wèi)生計生委，食品藥品監(jiān)管總局: 干細胞制劑質量控制及臨床前研究指導原則（試行），2015

The Key Technical Requirement and Standard of Tissue Engineered Medical Products

WANG ChunrenFENG XiaomingHAN QianqianNational Institutes of Food and Drug Control（Beijing100050）

The progress has been made rapidly in the tissue engineering research and development in China. So the tissue engineered medical products （TEMPs） begin from the laboratory bench move into market since some products realize the commercialization. The most important point is how to control the safety and effectiveness of the TEMPs. In this paper we propose some principle for the quality control of TEMPs associated with seeding cell resource， cell quality control， culture medium， raw material and scaffold characterization and standard etc.

tissue engineering， tissue engineered medical products， safety， effectiveness， evaluation， standard

1006-6586（2016）10-0001-04

R318

A

2016-06-08

王春仁，醫(yī)學博士，研究員，中國食品藥品檢定研究院生物材料與組織工程室主任。從事生物材料、無菌醫(yī)療器械，外科敷料、介入器械、植入器械、人工臟器、體外診斷試劑和組織工程方面的研究和檢測工作。