基金項(xiàng)目:深圳市龍崗區(qū)科技創(chuàng)新局資助項(xiàng)目(深龍科2014-52號)。

?

血清中艱難梭菌毒素A&B檢測在腹瀉診斷中的應(yīng)用*

*基金項(xiàng)目:深圳市龍崗區(qū)科技創(chuàng)新局資助項(xiàng)目(深龍科2014-52號)。

陳日炳，李小峰△，胡琴，李志祥

(深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院，廣東深圳 517200)

摘要:目的調(diào)查深圳東部地區(qū)住院腹瀉患者艱難梭菌感染情況，并評價3種艱難梭菌檢測方法的靈敏度和特異度。方法收集深圳東部地區(qū)2014年1月至2015年4月住院腹瀉患者的糞便和血清標(biāo)本各253份，同時進(jìn)行糞便標(biāo)本培養(yǎng)鑒定，酶聯(lián)免疫熒光法檢測糞便和血清標(biāo)本中艱難梭菌毒素A&B水平，對鑒定及檢測結(jié)果結(jié)合臨床資料進(jìn)行分析。結(jié)果糞便培養(yǎng)(48 h)檢出艱難梭菌10例(3.95%)，糞便中檢測到艱難梭菌毒素A&B 15例(5.93%)；血清中檢測到艱難梭菌毒素A&B 14例(5.53%)。結(jié)論檢測血清中艱難梭菌毒素A&B對診治艱難梭菌感染腹瀉的患者有重要意義。

關(guān)鍵詞:艱難梭菌；糞便；血清；腹瀉

艱難梭菌是一種革蘭陽性專性厭氧芽孢桿菌，在正常情況下，該細(xì)菌受制于人體其他細(xì)菌，不會產(chǎn)生危害[1]。但過度應(yīng)用抗菌藥物、免疫抑制劑或化療藥物可使耐藥的艱難梭菌產(chǎn)毒株過度繁殖并釋放艱難梭菌毒素A&B導(dǎo)致艱難梭菌相關(guān)性腹瀉，這對兒童和老年人可能是致命的[2]。隨著艱難梭菌相關(guān)性腹瀉的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)不斷增加，甚至在北美地區(qū)多家醫(yī)院內(nèi)爆發(fā)流行，引起了世界范圍的關(guān)注，而預(yù)防艱難梭菌感染也成為醫(yī)院感染控制的新挑戰(zhàn)。細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定作為艱難梭菌感染的傳統(tǒng)方法，主要是將大便接種至艱難梭菌選擇性培養(yǎng)基，并在厭氧環(huán)境下培養(yǎng)48 h。對培養(yǎng)后可疑菌落再行鑒定。該方法雖然較為經(jīng)典但由于所需周期較長，易延誤治療。而酶聯(lián)免疫熒光法艱難梭菌毒素A&B檢測技術(shù)采用酶免夾心法與終點(diǎn)免疫熒光相結(jié)合，通常以糞便標(biāo)本檢測為主，可準(zhǔn)確預(yù)測患者體內(nèi)菌群致病性，但仍然存在標(biāo)本采集的局限性[3]，因此本文創(chuàng)新性地提出檢測血清中艱難梭菌毒素A&B的方法。為了解本地區(qū)住院腹瀉患者艱難梭菌感染情況，并評價3種艱難梭菌檢測方法靈敏度和特異度，對深圳東部地區(qū)三家大型醫(yī)院住院腹瀉患者的的糞便和血清進(jìn)行艱難梭菌毒素檢測，結(jié)合細(xì)菌培養(yǎng)鑒定結(jié)果進(jìn)行綜合分析，為臨床艱難梭菌感染的治療和控制提供參考，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料2014年1月至2015年4月入住深圳東部地區(qū)人民醫(yī)院、中心醫(yī)院、中醫(yī)院發(fā)生腹瀉的住院患者253例象，納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)原衛(wèi)生部《醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)》住院時間大于3 d，出現(xiàn)腹瀉癥狀1 d在3次以上；1個月內(nèi)使用過抗菌藥物，如氟喹諾酮類、頭孢菌素或B-內(nèi)酰胺類抗菌藥物等；長期使用胃酸抑制劑，如質(zhì)子泵抑制劑、H2受體阻滯劑等。無明顯抗菌藥物暴露史，但臨床高度懷疑艱難梭菌感染者。排除食物中毒、脂肪瀉、病毒性腹瀉、菌痢、沙門菌屬腹瀉及慢性腹瀉疾病患者[4]。研究對象來源及特征見表1。

1.2儀器與試劑法國梅里埃全自動細(xì)菌鑒定儀、螢光酶標(biāo)儀；荷蘭微需氧培養(yǎng)系統(tǒng)；日本SANYO-CO2培養(yǎng)箱。艱難梭菌產(chǎn)色培養(yǎng)基、厭氧袋和艱難梭菌毒素檢測試劑盒均為法國梅里埃產(chǎn)品。

1.3檢測方法

1.3.1標(biāo)本采集所有符合納入標(biāo)準(zhǔn)的研究對象，每人收集糞便5 mL，均分于2個干凈無防腐劑的大便標(biāo)本無菌杯中，立即送檢，同時用生化管采集患者外周全血5 mL，3 000 g離心5 min分離血清，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2糞便標(biāo)本艱難梭菌培養(yǎng)及鑒定一份糞便標(biāo)本及時接種于艱難梭菌產(chǎn)色培養(yǎng)基,立即置厭氧箱中厭氧環(huán)境培養(yǎng)24 h，觀察有無艱難梭菌典型菌落生長(黑色菌落)。若沒有典型菌落，可延遲放置48 h再觀察。取可疑菌落進(jìn)行鑒定。

1.3.3糞便標(biāo)本直接檢測艱難梭菌毒素A&B吸取200 μL充分混勻的液體糞便，加入到干凈離心管中，加入1 mL標(biāo)本稀釋液(R1),渦旋混勻，12 000 g離心5 min，取300 μL上清液待測。具體操作步驟及結(jié)果判斷嚴(yán)格按照試劑盒說明書

1.3.4血清標(biāo)本直接檢測艱難梭菌毒素A&B取200 μL待測血清，加入1 mL標(biāo)本稀釋液(R1),渦旋混勻，12 000 g離心5 min，取300 μL上清液待測。具體操作步驟及結(jié)果判斷嚴(yán)格按照試劑盒說明書。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1　　研究對象來源及特征(n)

2結(jié)果

糞便培養(yǎng)出艱難梭菌10例(3.95%)，糞便中檢測到艱難梭菌毒素A&B 15例(5.93%)；血清中檢測到艱難梭菌毒素A&B 14例(5.53%)。與糞便培養(yǎng)鑒定相比，糞便毒素檢測和血清毒素檢測陽性率明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而糞便毒素檢測和血清毒素檢測陽性率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。各種方法優(yōu)缺點(diǎn)見表3。

表2　　各種方法檢測陽性率比較

*：PZ<0.05，與糞便培養(yǎng)法比較。

表3　　各種方法優(yōu)缺點(diǎn)比較

3討論

近年來隨著抗菌藥物濫用加劇，加之免疫抑制劑和化療藥物應(yīng)用增多，國內(nèi)外耐藥性艱難梭菌感染的發(fā)生率呈明顯上升趨勢。僅在美國，每年艱難梭菌感染者就超過了40萬例，且感染的病死率高達(dá)10%[5]。上海市疾病預(yù)防控制中心(CDC)的調(diào)查表明，由上海市各大醫(yī)院艱難梭菌感染引起的腹瀉高達(dá)7.1%[6]，提示我國艱難梭菌感染形勢也很嚴(yán)峻，因此選用合適的檢測方法，及時準(zhǔn)確地對艱難梭菌感染進(jìn)行診斷，以及有針對性地用藥對該病預(yù)后尤為重要。因此本研究采用糞便培養(yǎng)鑒定、糞便中A&B毒素檢測和血清中A&B毒素檢測3種方法，在調(diào)查本地區(qū)住院腹瀉患者艱難梭菌感染情況的同時，比較3種方法的可行性。

本研究結(jié)果顯示，糞便培養(yǎng)鑒定法的陽性率較低(3.95%)，這可能與厭氧菌對標(biāo)本采集運(yùn)送條件嚴(yán)苛有關(guān)，糞便中優(yōu)勢菌群如腸桿菌等，也會抑制艱難梭菌的生長，進(jìn)而影響檢測結(jié)果[7]。同時培養(yǎng)法作為檢驗(yàn)艱難梭菌的傳統(tǒng)方法，培養(yǎng)條件苛刻，對實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求較高，檢測周期長，加之成本昂貴，無法確定與腹瀉的因果關(guān)系，因此該方法已不能滿足當(dāng)前臨床診治需要。與培養(yǎng)鑒定法相比，用糞便標(biāo)本檢測A&B毒素，陽性率明顯升高(5.93%)，選用商品化試劑盒，檢測快速，且結(jié)果穩(wěn)定性較好，易于標(biāo)準(zhǔn)化，目前被視為先進(jìn)方法[8]。但也存在糞便取樣受限，不能做到隨取隨做的缺點(diǎn)。因此本研究中嘗試用血清代替糞便進(jìn)行艱難梭菌毒素檢測，結(jié)果表明糞便毒素檢測和血清毒素檢測陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，且血樣抽取受限較少，在患者失去意識、消化系統(tǒng)手術(shù)后等無法順利收集糞便標(biāo)本的特殊情況下，該法具有明顯優(yōu)勢。但該方法能否廣泛應(yīng)用仍需大量樣本研究驗(yàn)證。

本文研究表明深圳東部地區(qū)住院腹瀉患者中檢出艱難梭菌A&B毒素的陽性率為5.93%，低于高燕婷等人的研究[9]，這可能與該地區(qū)醫(yī)療衛(wèi)生部門良好的抗菌藥物使用習(xí)慣有關(guān)；感染者多為老年人和兒童，可能與個體的抵抗力有關(guān)。

綜上所述，針對特定人群檢測血清中艱難梭菌毒素A&B，對艱難梭菌診治有重要意義。但做好院內(nèi)感染的防治，降低院內(nèi)感染的發(fā)生,同時嚴(yán)格規(guī)范抗菌藥物的使用[10]，保持環(huán)境衛(wèi)生及維持腸道內(nèi)微生抵穩(wěn)態(tài)才能從根本上降低艱難梭菌發(fā)病率和病死率。

參考文獻(xiàn)

[1]Cohen SH,Gerding DN,Johnson S,et al.Clinical practice guidelines for Clostridium difficile infection in adults: 2010 update by the society for healthcare epidemiology of America (SHEA) and the infectious diseases society of America (IDSA)[J]. Infect Control Hosp Epidemiol.2010,31(5):431-455.

[2]Ananthakrishnan AN.Clostridium difficile infection: epidemiology, risk factors and management[J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2011,8(1):17-26.

[3]龍海燕,楊菁玉,馮萍.艱難梭菌感染實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)及其研究進(jìn)展[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床. 2015(8):1143-1145.

[4]楊雪妹,吳允孚.艱難梭菌的生物學(xué)特性與實(shí)驗(yàn)室診斷[J].中國感染與化療雜志. 2013,13(3):232-234.

[5]Gasperino J,Garala M,Cohen HW,et al.Investigation of critical care unit utilization and mortality in patients infected with Clostridium difficile[J].J Crit Care，2010,25(2):282-286.

[6]Shetty N,Wren MW,Coen PG.The role of glutamate dehydrogenase for the detection of Clostridium difficile in faecal samples: a meta-analysis[J].J Hosp Infect，2011,77(1):1-6.

[7]Longtin Y,Trottier S,Brochu G,et al.Impact of the type of diagnostic assay on Clostridium difficile infection and complication rates in a mandatory reporting program[J]. Clin Infect Dis，2013,56(1):67-73.

[8]Deak E,Miller SA,Humphries RM.Comparison of Illumigene, Simplexa, and AmpliVue Clostridium difficile molecular assays for diagnosis of C. difficile infection[J].J Clin Microbiol，2014,52(3):960-963.

[9]高燕婷,章黎華,王粟，等.住院腹瀉患者艱難梭菌感染的臨床特點(diǎn)分析[J].上海交通大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2014,34(10):1481-1484.

[10]Barbut F,Surgers L,Eckert C,et al.Does a rapid diagnosis of Clostridium difficile infection impact on quality of patient management?[J].Clin Microbiol Infect， 2014,20(2):136-144.

·臨床研究·

收稿日期：(2015-08-18)

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2015.24.062A

文章編號：1673-4130(2015)24-3641-03

通訊作者△,E-mail:28904884@qq.com。