侯海燕

(淮安市疾病預(yù)防控制中心，江蘇淮安 223001)

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COXⅠ基因DNA條形碼技術(shù)在蜱類鑒別中的應(yīng)用

侯海燕

(淮安市疾病預(yù)防控制中心，江蘇淮安 223001)

摘要:目的探討細胞色素C氧化酶Ⅰ亞基(COXⅠ)條形碼在野外捕獲種類鑒定中的應(yīng)用。方法對捕獲的9個蜱類個體中COXⅠ基因進行測序，利用DNAstar軟件進行序列比對及同源性分析，利用phlip3.6軟件選擇最大似然法(ML)構(gòu)建進化樹。結(jié)果在系統(tǒng)進化樹中，標(biāo)本sh2011040702、ra2011042193及ra2011051168與血蜱屬分在一支，sh2011051404、sh2011051408及ra2011041177與革蜱屬聚集在一起，sh2011051837、sh2011041917及ra2011041175與璃眼蜱屬分在一支，均與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致。結(jié)論以COXⅠ基因序列作為蜱DNA條形碼對蜱種鑒別具有一定的可行性。

關(guān)鍵詞:細胞色素C氧化酶Ⅰ亞基；DNA條形碼；蜱類；鑒定

蜱是寄生在動物體表的吸血寄生蟲，具有從宿主獲得多種病原體的能力。對國內(nèi)外蜱傳播疾病的研究發(fā)現(xiàn)，蜱攜帶的病原體包括83 種病毒(如出血熱、新型布尼亞病毒、森林腦炎、)、14 種細菌(如布氏桿菌)、20 種立克次體(如蜱傳斑疹傷寒、Q 熱、)、18 種螺旋體(如萊姆病)、32 種原蟲(如巴貝斯蟲)、1 種支原體檢驗檢疫、1 種衣原體、1 種巴爾通體和2 種線蟲[1-2]。對蜱進行分類鑒定是醫(yī)學(xué)媒介生物調(diào)查和控制工作的基礎(chǔ)，是檢驗檢疫、疾病預(yù)防與控制領(lǐng)域的核心步驟。

2003年，加拿大科學(xué)家Hebert等[3]提出了DNA條碼概念，利用線粒體細胞色素C氧化酶Ⅰ亞基(COXⅠ)這一特定基因的特定區(qū)段作為DNA條碼。由于其操作簡便快速，已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于多個動物類群的鑒定與分類[4-7]。目前，已測定出一些蜱的mtDNA序列[8]。本研究通過對某地區(qū)監(jiān)測所捕獲的蜱，選擇其中9個線粒體COXⅠ基因序列進行比對分析，分析其種屬分類，驗證COXⅠ基因作為蜱DNA條形碼在蜱種鑒定中的有效性。

1材料與方法

1.1標(biāo)本采集本研究分別在某地區(qū)的6個地點即不同生態(tài)環(huán)境下進行蜱類的采集。在采樣點隨機抽取10～30只家畜采集體外寄生蜱，以每只家畜作為1個采集單位,同時在采樣點附近布鼠夾，從捕獲的嚙齒動物體表進行寄生蜱收集，將每個單位采集的蜱按單宿主裝入單只大號試管中，做好記錄，實驗室分類鑒定。

標(biāo)本的形態(tài)學(xué)鑒定用體視顯微鏡觀察蜱的盾板、假頭、假頭基形狀、口下板、生殖孔、肛溝、氣門等形態(tài)特征，根據(jù)蜱分類檢索表進行形態(tài)學(xué)分類鑒定。

1.2基因組DNA提取、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增及測序采集的蜱標(biāo)本，先用75%乙醇清洗1次，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次。蜱基因組總DNA的提取使用Qiagen公司的DNeasy Blood & Tissue Kit，參照試劑盒說明書提取總DNA。以提取的蜱DNA為模板，按照文獻中擴增COXⅠ基因的方法進行擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后由金斯瑞生物科技有限公司測序。

1.3COXⅠ序列分析方法利用DNAStar程序?qū)π蛄羞M行排序輔以手工校正，使用phlip3.60軟件進行序列比對并用最大似然法(ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。系統(tǒng)樹分支的置信度均采用自展法1 000次重復(fù)驗證。

2結(jié)果

2.1蜱的形態(tài)學(xué)鑒定在某地區(qū)6個地點采集蜱，利用體視顯微鏡觀察蜱的盾板、假頭、假頭基形狀、口下板、生殖孔、肛溝、氣門等形態(tài)特征，根據(jù)蜱分類檢索表進行形態(tài)學(xué)分類鑒定發(fā)現(xiàn)，羊群體表寄生蜱為亞東璃眼蜱(編號為sh2011051837、sh2011041917)、草原革蜱(編號為sh2011051404、sh2011051408)及草原血蜱(編號為sh2011040702)；鼠類體表寄生蜱為草原血蜱(編號為ra2011042193、ra2011051168)、草原革蜱(編號為ra2011041177)及亞東璃眼蜱(編號為ra2011041175)。

2.2不同蜱COXⅠ基因PCR擴增結(jié)果瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果顯示，COXⅠ的PCR產(chǎn)物約為650 bp的DNA片段，見圖1。與預(yù)期目的片段大小一致。

2.3蜱的核苷酸序列同源性比較從核苷酸同源比較表中可以看出標(biāo)本sh2011051837、sh2011041917及ra2011041175與3個已知屬的核苷酸相比較，與璃眼蜱屬的同源性為86.9%～99.1%，與血蜱屬的核苷酸同源性為81.6%～84.9%，與革蜱屬的核苷酸同源性為83.2%～83.6%。標(biāo)本sh2011051837、sh2011041917及ra2011041175之間的核苷酸同源性為99.9%；標(biāo)本sh2011051404、sh2011051408及ra2011041177與3個已知屬的核苷酸相比較，與璃眼蜱屬的同源性為80.4%～83.7%，與血蜱屬的核苷酸同源性為82.1%～86.1%，與革蜱屬的核苷酸同源性為99.0%～99.7%。標(biāo)本sh2011051404、sh2011051408及ra2011041177之間的核苷酸同源性為99.7%～99.9%；標(biāo)本sh2011040702、ra2011042193及ra2011051168與3個已知屬的核苷酸相比較，與璃眼蜱屬的同源性為79.5%～83.0%，與血蜱屬的核苷酸同源性為85.2%～99.0%，與革蜱屬的核苷酸同源性為81.4%～83.1%。樣本sh2011040702、ra2011042193及ra2011051168之間的核苷酸同源性為99.9%。

M:標(biāo)志物；1:sh2011041917；2:sh2011040702；3:sh2011051404；4:ra2011041175 5:ra2011051168。

圖1COXⅠ基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

圖2　　基于ML法的建立的蜱COXⅠ基因分子化樹

2.4蜱的系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建基于本研究的9個個體線粒體COXⅠ基因序列，以及從Genebank中所獲得的已知蜱的各屬(包括璃眼蜱屬、革蜱屬、血蜱屬)序列，ML法建系統(tǒng)發(fā)生樹，如圖2所示。sh2011051837、sh201104197及ra2011041175的系統(tǒng)發(fā)生樹與璃眼蜱屬的種分在一支，同時這3株聚集在一起，從羊群體表分離出的蜱與從鼠表分離到的蜱的進化關(guān)系較近，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的因宿主差異導(dǎo)致的蜱COXⅠ基因發(fā)生變異，同時與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致為亞東璃眼蜱；sh2011051404、sh2011051408及ra2011041177在系統(tǒng)發(fā)生樹中與革蜱屬聚集在一起，但與同一大支相比，這三株又獨立聚集在一起，且自展值為100，與形態(tài)學(xué)鑒定一致，為草原革蜱；標(biāo)本sh2011040702、ra2011042193及ra2011051168與血蜱屬的分在一支，與形態(tài)學(xué)鑒定一致。

3結(jié)論

本研究對某地區(qū)3種蜱的9個個體的COXⅠ序列進行擴增，得到650 bp基因片段，經(jīng)測序后進行分析，標(biāo)本sh2011051837、sh2011041917及ra2011041175與3個已知屬的核苷酸相比較，與璃眼蜱屬的同源性為最高，與形態(tài)學(xué)鑒定這3個為亞東璃眼蜱的結(jié)論一致；標(biāo)本sh2011051404、sh2011051408及ra2011041177與三個已知屬的核苷酸相比較，與革蜱屬的核苷酸同源性最高，與形態(tài)學(xué)鑒定這3個為草原革蜱的結(jié)論一致；標(biāo)本sh2011040702、ra2011042193及ra2011051168與3個已知屬的核苷酸相比較，與血蜱屬的核苷酸同源性最高，與形態(tài)學(xué)鑒定這3個為草原血蜱的結(jié)論一致。

對于物種的鑒定，一般采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法，但由于個體差異、環(huán)境影響等因素常常使得形態(tài)學(xué)鑒定也具有很大的局限性[9]，尤其是形態(tài)學(xué)特征很相似，標(biāo)本破壞，特定狀態(tài)下(如缺乏未成熟蜱的性狀描述或采集的標(biāo)本為飽血蜱)。DNA 條形碼技術(shù)是建立在物種相對保守的基因如12S rDNA、16rDNA、COXⅠ基因、Cytb基因、D-loop基因等基礎(chǔ)上的，通過獲得相對保守的基因序列，可以建立每種物種便于識別的特有便簽[10-11]。近年來，蜱傳疾病引起重大的公共衛(wèi)生安全，引起越來越多的重視，但是對于蜱本身的關(guān)注較少，尤其是在蜱攜帶病原體種類的鑒定。DNA條形碼技術(shù)的引入便可以更加快速、準(zhǔn)確地鑒定蜱，同時為依據(jù)分子標(biāo)記序列鑒定物種、種群研究及系統(tǒng)進化分析提供了有效途徑。

本研究結(jié)果表明，線粒體COXⅠ基因作為DNA條形碼用于蜱種類鑒別具有一定的可行性，利用DNA條形碼檢測技術(shù)是準(zhǔn)確鑒定物種的趨勢之一。

參考文獻

[1]馬廣鵬，孫傳范，趙娜，等．中國蜱傳病主要流行趨勢及防控科技對策[J]．中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報，2011，13(2)：105-109．

[2]江莉，龔勁聰，胡龍飛，等．DNA條形碼技術(shù)用于進口貨物中肩突硬蜱的鑒定[J]．中國國境衛(wèi)生檢疫雜志，2014，37(1)：33-36．

[3]Hebert PD,Cywinska A,Ball SL,et al.Biological identifications through DNA barcodes[J].Proc Biol Sci,2003,270(15):313-321.

[4]Herbert P,Ratnasingham S,De WJ.Barcoding animal Life:cytochrome coxidase subunit 1 divergences among closely related species[J].Proc R Soc Lond B Biol Sci,2003,270(15):96-99.

[5]劉勇，宋毓，李曉宇．基于線粒體COⅠ基因的DNA條形碼技術(shù)在昆蟲分子鑒定中的應(yīng)用[J]．植物檢疫，2010，2(2)：46-50．

[6]高玉時，屠云潔，童海兵，等．6個地方雞種線粒體COⅠ基因的DNA條形碼[J]．農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2007，15(6)：924-930．

[7]彭居俐，王緒禎，王丁，等．基于線粒體CO1基因序列的DNA條形碼在鯉科鲌屬魚類物種鑒定中的應(yīng)用[J]．水生生物學(xué)報，2009，33(2)：271-276．

[8]柳淑芳，陳亮亮，戴芳群，等．基于線粒體CO1基因的DNA條形碼在石首魚科(Sciaenidae)魚類系統(tǒng)分類中的應(yīng)用[J]．海洋與湖沼，2010，41(2)：223-232．

[9]覃新程，田俊華，王劍波，等．長角血蜱和微小扇頭蜱的形態(tài)與分子生物學(xué)鑒定[J]．中華流行病學(xué)雜志，2011，32(6)：608-612．

[10]焦明超，趙大顯，歐陽珊，等．DNA條形碼技術(shù)在生物分類學(xué)中的應(yīng)用前景[J]．湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50(5)：886-890．

[11]張穗生，陳英，陳小玲．微生物DNA條形碼技術(shù)的研究進展[J]．廣西科學(xué)，2015，22(1)：27-30．

·論著·

Application of DNA barcoding technique of COXⅠ gene in identification of ticks

HouHaiyan

(HuaianMunicipalCenterforDiseaseControlandPrevention,Huaian,Jiangsu223001,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the application of the cytochrome C oxidase subunit Ⅰ gene(COXⅠ) barcoding in the identification of wild-caught ticks.MethodsThe COXⅠ gene of 9 caught tick individuals with different species was sequenced,the DNAstar software was used to conduct the sequence comparison and homology analysis.Meanwhile the philp3.6 software was adopted to select the maximal likelihood(ML) method for constructing the evolutionary trees.ResultsIn the phylogenetic trees，the samples of sh2011040702,ra2011042193 and ra2011051168 with Haemaphysalis were in a branch,sh2011051404,sh2011051408 and ra2011041177 with dermacentor were clustered together,and sh2011051837,sh2011041917 and ra2011041175 with hyalomma were in a branch,which were consistent with the morphological identification results.ConclusionMaking the COXⅠ gene sequence as tick DNA barcoding has certain feasibility for identifying the tick species.

Key words:cytochrome C oxidase subunit Ⅰ gene;DNA barcoding;tick;identification

通訊作者：

作者簡介：張書鳳，女，主管檢驗師，主要從事臨床免疫與微生物學(xué)檢驗工作。△E-mail：dtjykhua@126.com 。

收稿日期：(2015-07-26)

文獻標(biāo)識碼：

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2015.24.026A

文章編號：1673-4130(2015)24-3570-02