王莉莉，楊　超，董全江，孫桂榮

(1.青島大學附屬醫(yī)院檢驗科，山東青島 266003；2.青島市市立醫(yī)院中心實驗室，山東青島 266011)

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青島地區(qū)幽門螺桿菌多重耐藥現(xiàn)狀和突變特征分析

王莉莉1,2，楊超2，董全江2，孫桂榮1△

(1.青島大學附屬醫(yī)院檢驗科，山東青島 266003；2.青島市市立醫(yī)院中心實驗室，山東青島 266011)

摘要:目的分析青島地區(qū)幽門螺桿菌(Hp)對常用抗菌藥物的單一耐藥和多重耐藥情況，并探討相關耐藥基因突變的特征。方法從胃竇黏膜標本分離培養(yǎng)Hp，應用瓊脂稀釋法藥敏試驗分別檢測Hp對克拉霉素、左氧氟沙星和甲硝唑的敏感性；采用聚合酶鏈式反應(PCR)方法擴增Hp克拉霉素耐藥基因23S rRNA、左氧氟沙星耐藥基因gyrA和甲硝唑耐藥基因rdxA；PCR產物測序后應用ClustalW2軟件進行序列比對分析。結果藥敏檢測發(fā)現(xiàn)，臨床分離的134株Hp菌株對克拉霉素、左氧氟沙星和甲硝唑3種抗菌藥物單一耐藥率分別為40.3%、34.3%和43.3%；僅17.9% Hp對3種抗菌藥物均敏感；多重耐藥率為29.9%，三重耐藥率為9.0%；左氧氟沙星+甲硝唑雙重耐藥率(3.0%)低于克拉霉素+左氧氟沙星(10.4%)，二者差異有統(tǒng)計學意義(χ2= 5.96，P=0.015)。耐藥基因序列分析表明青島地區(qū)23S rRNA 最常見突變位點為A2143G(77.8%)，gyrA基因突變最常見的突變方式為N87K(78.3%)，rdxA基因最常見的突變方式為第20、32位點核苷酸插入A，產生移碼突變，突變率為44.8%。結論青島地區(qū)Hp多重耐藥率高，應根據(jù)藥敏檢測結果選擇有效抗菌藥物。左氧氟沙星可作為本地區(qū)根除治療方案的一線用藥。

關鍵詞:幽門螺桿菌；克拉霉素；左氧氟沙星；甲硝唑；耐藥

幽門螺桿菌(Hp)是一種革蘭陰性、微需氧的螺旋狀桿菌，是引起慢性胃炎、胃十二指腸潰瘍、胃癌及MALT淋巴瘤的主要致病菌[1]。細菌耐藥是引起Hp根除治療失敗的主要原因，而多重抗菌藥物耐藥會顯著降低Hp根除率。研究發(fā)現(xiàn)，Hp耐藥性有明顯的地區(qū)差異[2-3]，經(jīng)文獻檢索，未見青島地區(qū)Hp多重耐藥的相關報道。本研究通過分析青島地區(qū)Hp對常用抗菌藥物的單一耐藥和多重耐藥情況，并探討相關的耐藥基因突變特征，旨在為本地區(qū)臨床提高Hp根除效率提供理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料選擇2011~2014年在青島市市立醫(yī)院經(jīng)胃鏡和病理檢查確診的慢性胃炎患者168例，男 95例，女73例，年齡30～72歲，平均(45.7±6.3)歲；胃癌患者90例，男53例，女37例，年齡41～79歲，平均(55.5±12.1)歲，所有患者均未接受過根除Hp治療。胃竇黏膜標本經(jīng)快速尿素酶實驗證實Hp陽性。胃竇黏膜組織置于1 mL腦心浸出液(BHI)液體培養(yǎng)基中，-80 ℃保存?zhèn)溆?。本研究方案通過本院倫理委員會審核，納入研究前所有患者均簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑細菌基因組DNA提取試劑盒和2×Taq PCRMasterMix購自天根生化科技有限公司；BHI培養(yǎng)基、Hp選擇性添加劑、細菌培養(yǎng)罐和微需氧產氣袋均購自英國Oxoid公司；革蘭染液購自濟南百博生物技術有限公司；恒溫箱購自美國Themo公司；普通PCR儀購自美國Labnet公司；凝膠分析儀購自美國Bio-rad公司；Hp標準菌株NCTC11637來自本實驗室保存。

1.3方法

1.3.1細菌培養(yǎng)及鑒定胃黏膜活檢標本接種于5%去纖維馬血BHI瓊脂固體培養(yǎng)基(含Hp選擇性添加劑)表面接種劃痕，置于37 ℃微需氧環(huán)境中(5% O2，10% CO2，85% N2)培養(yǎng)5～7 d。挑取透明樣針尖大小菌落進行尿素酶、過氧化氫酶、氧化酶及革蘭染色鑒定Hp并傳代，2 d后收集細菌置于磷酸鹽緩沖液(PBS)液中，-80 ℃保存，用于提取Hp基因組DNA。

1.3.2瓊脂稀釋法藥敏試驗分別制備含不同濃度抗菌藥物(克拉霉素、左氧氟沙星和甲硝唑)的平板,各在其上劃6個扇區(qū),每個扇區(qū)接種1株細菌(108cfu/ mL)。同時各菌株平行接種于無抗菌藥物的平板為對照。置37 ℃、微需氧條件下培養(yǎng)3 d觀察結果。以無細菌生長的抗菌藥物最高稀釋度作為最低抑菌濃度(MIC)。根據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)指南[4]，克拉霉素MIC≥1 μg/mL，左氧氟沙星MIC≥1 μg/mL，甲硝唑MIC≥8 μg/mL 定為耐藥菌株。藥敏質控采用Hp標準菌株NCTC11637與試驗同步進行。

1.3.3PCR擴增采用細菌基因組DNA提取試劑盒按照說明書步驟提取Hp基因組DNA。分別擴增Hp克拉霉素耐藥基因23S rRNA、左氧氟沙星耐藥基因gyrA 和甲硝唑耐藥基因rdxA。擴增引物由上海英濰捷基生物技術有限公司合成，序列詳見表1。PCR反應體系為：引物各5 μmoL，模板DNA 20 ng，2×Taq Mix 12.5 μL，補雙蒸水(ddH2O)至25 μL。反應條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min、52 ℃ 30 s(rdxA為50 ℃)、72 ℃ 1 min循環(huán)30 次，72 ℃ 10 min。PCR產物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因長度和完整性，見表1。

表1　　PCR擴增引物序列表

1.3.4基因測序及結果分析PCR產物切膠純化后采用Sanger測序法進行基因測序(AB 3730XL測序儀，美國)，由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。采用MEGA5.1分子生物學軟件分析耐藥基因的核苷酸和氨基酸序列,并與Hp敏感株26695 基因序列(GeneBank CP003904.1)進行ClustalW2 比對，分析突變方式和突變位點。

1.4統(tǒng)計學處理應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，選擇χ2檢驗對計數(shù)資料進行統(tǒng)計，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1Hp單一耐藥分析Hp陽性的活檢標本共分離出134株Hp。瓊脂稀釋法藥敏檢測發(fā)現(xiàn)僅17.9%(24株)Hp菌株對克拉霉素、左氧氟沙星和甲硝唑3種抗菌藥物均敏感，見表2，臨床分離的Hp菌株對克拉霉素、左氧氟沙星和甲硝唑3種抗菌藥物單重耐藥率分別為40.3%、34.3%和43.3%，雖然左氧氟沙星耐藥率低于克拉霉素和甲硝唑，但3種抗菌藥物之間耐藥差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2Hp多重耐藥分析134株Hp中，有29.9%(40株)同時對兩種或兩種以上抗菌藥物耐藥。由表2可見，雙重耐藥的Hp菌株中，克拉霉素+左氧氟沙星耐藥率為10.4%(14/134)，而左氧氟沙星+甲硝唑耐藥率最低，為3.0%(4/134)，二者差異有統(tǒng)計學意義(χ2= 5.96，P=0.015)。這提示青島地區(qū)Hp臨床分離株對左氧氟沙星+甲硝唑聯(lián)合用藥比克拉霉素+左氧氟沙星更敏感。Hp臨床分離株三重抗菌藥物耐藥比例為9.0%(12/134)，提示多重耐藥菌株將嚴重影響臨床根除Hp治療的效果，見表2。

表2　　Hp對3種抗菌藥物耐藥分析

2.3Hp耐藥基因突變特征分析Hp克拉霉素耐藥相關基因23S rRNA、左氧氟沙星耐藥相關基因gyrA和甲硝唑耐藥相關基因rdxA分別經(jīng)PCR法擴增全長序列，PCR產物直接測序。從GenBank中調取Hp26695的相對應序列，應用Clustal W2程序比對所有耐藥基因序列。結果發(fā)現(xiàn)：(1)54株克拉霉素耐藥Hp菌株的23S rRNA V區(qū)均有基因突變發(fā)生，突變位點A2143G最常見，突變率為77.8%，其他突變方式為A2174G(5.6%)、A2187G(3.7%)、A2223G(7.3%)等，見表3(見《國際檢驗醫(yī)學雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”)。(2)46株左氧氟沙星耐藥Hp菌株的gyrA基因突變最常見的突變方式為N87K(78.3%)，其次依次為D91Y(10.9%)、A88V(6.5%)等。(3)58株甲硝唑耐藥Hp菌株的rdxA基因突變以插入和缺失單核苷酸為主，最常見的突變方式為第20、32位點核苷酸插入A，產生移碼突變，導致第23氨基酸(aa)序列出現(xiàn)終止密碼子引起蛋白功能失活，突變率為44.8%。其他移碼突變發(fā)生位點散布于全基因序列。

3討論

目前國內推薦用于Hp根除治療的抗菌藥物包括：克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星、阿莫西林、呋喃唑酮和四環(huán)素[5]。本研究針對最常用的抗菌藥物包括克拉霉素、左氧氟沙星和甲硝唑進行藥敏檢測，結果發(fā)現(xiàn)青島地區(qū)僅17.9%的 Hp菌株對上述3種抗菌藥物均敏感，而多重耐藥菌株達29.9%，其中三重耐藥菌株達9.0%。這些結果提示無藥敏檢測指導的隨機選取抗菌藥物治療Hp感染的有效率會顯著下降。不同地區(qū)Hp多重耐藥率有所差異，浙江地區(qū)為23.6%[6]，上海地區(qū)高達37.8%[7]，可能與經(jīng)濟水平、地理分布、時間跨度及當?shù)蒯t(yī)生的用藥習慣有一定的相關性。依據(jù)Maastricht-Ⅳ共識，基于藥敏試驗結果選用抗菌藥物用于根除療法僅為三線方案[8]。由于本地區(qū)多重耐藥率高達近1/3而敏感菌株僅不到1/5，因此無藥敏檢測指導的一、二線治療方案的效果肯定將會顯著下降。據(jù)此本研究認為在多重耐藥率高的地區(qū)，應在藥敏檢測指導下選擇有效抗菌藥物進行根除治療方案，韓國的一項研究也支持本觀點[9]。無藥敏檢測指導的三聯(lián)或者四聯(lián)方案不但有效率低，而且可能進一步導致抗菌藥物耐藥的發(fā)生。

本研究臨床分離的Hp菌株雙重耐藥率由低到高依次為：左氧氟沙星+甲硝唑耐藥率(3.0%)、克拉霉素+甲硝唑(7.5%)和克拉霉素+左氧氟沙星(10.4%)。Maastricht-Ⅳ共識推薦在克拉霉素高耐藥(15%～20%)的地區(qū)，一線方案為鉍劑四聯(lián)療法，二線方案為左氧氟沙星三聯(lián)療法。本地區(qū)臨床分離的Hp菌株對克拉霉素耐藥率為41.8%，含克拉霉素雙重耐藥率為18%，屬于克拉霉素耐藥高的地區(qū)，因此基于克拉霉素的標準三聯(lián)方案不應為本地區(qū)的一線治療方案。本地區(qū)Hp對左氧氟沙星耐藥率低于克拉霉素和甲硝唑，尤其左氧氟沙星+甲硝唑雙重耐藥率也比較低。桂西地區(qū)的研究發(fā)現(xiàn)左氧氟沙星+甲硝唑雙重耐藥率僅1.7%，也支持這一結果[10]。因此本地區(qū)可選擇含左氧氟沙星的Hp根除治療為一線方案。

前期研究表明23S rRNA V區(qū)基因點突變導致Hp對大環(huán)內酯類抗菌藥物耐藥，常見突變位點為2142和2143[11]。 本研究發(fā)現(xiàn)A2143G突變率為77.8%，其他突變方式為A2174G(5.6%)、A2187G(3.7%)、A2223G(7.3%)等，未見2142位點突變，提示青島地區(qū)23S rRNA基因 A2143G為克拉霉素耐藥的主導因素。編碼DNA螺旋酶亞單位gyrA基因的喹諾酮類耐藥決定區(qū)(QRDR)基因突變可導致Hp對左氧氟沙星耐藥，常見耐藥位點為86～88、91[12]。本研究發(fā)現(xiàn)gyrA基因突變最常見的突變方式為N87K，與之前報道一致[13]。rdxA基因突變引起的酶活性喪失是Hp對甲硝唑耐藥的主要因素[14]。本研究發(fā)現(xiàn)耐甲硝唑Hp菌株的rdxA基因第20、32位點核苷酸插入A產生移碼突變，突變率為44.8%，為本地區(qū)Hp對甲硝唑耐藥的主導因素。

綜上所述，青島地區(qū)Hp多重耐藥率高，應根據(jù)藥敏檢測結果選擇有效抗菌藥物。左氧氟沙星可作為本地區(qū)根除治療方案的一線用藥，其臨床療效有待于進一步驗證。

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·論著·

Prevalence and genetic features of multi-drug resistant Helicobacter pylori strains from Qingdao

WangLili1,2,YangChao2,DongQuanjiang2,SunGuirong1△

(1.ClinicalLaboratory,AffiliatedHosptialofQingdaoUniversity,Qingdao,Shandong266003,China;

2.CentralLaboratory,QingdaoMunicipalHospital,Qingdao,Shandong266011,China)

Abstract:ObjectiveTo analyze the single resistance and multiple resistance situation of of Helicobacter pylori (Hp) in Qingdao area to commonly used antibacterial drugs and to investigate the mutation characteristics of drug-related resistant genes.Methods Hp was isolated from the mucosal samples of gastric antrum.The agar diffusion test was used to determine the susceptibility of Hp to clarithromycin,levofloxacin and metronidazole.The 23s rRNA of clarithromycin resistance gene,gyrA of levofloxacin resistance gene and rdxA of metronidazole resistance gene were amplified by using PCR,after the PCR products sequencing,the sequence comparative analysis was performed by the ClustalW2 software.ResultsThe drug susceptibility test results found that the single resistance rates of 134 strains of clinically isolated Hp to clarithromycin,levofloxacin and metronidazole were 40.3%,34.3% and 43.3%,respectively.Only 17.9% of Hp strains were susceptible to these 3 kinds of antibacterial drug;the multi-drug resistance rate was 29.9%,triple drug resistance rate was 9.0%;furthermore,the double resistance rate of levofloxacin plus metronidazole was significantly lower than that of clarithromycin plus levofloxacin,the difference was statistically significant(3.0% vs. 10.4%,χ2= 5.96，P=0.015).The drug resistance genes sequence analyses showed that the commonest mutation locus was A2143G (77.8%),the commonest mode of gyrA gene mutation was N87K(78.3%),and which of rdxA gene was nucleotide insertion into loci 20/32,generating the frameshift mutation with the mutation rate of 44.8%.ConclusionThe multi-drug resistance rate of Hp is high in Qingdao area.The effective antibacterial drugs should be selected according to the drug susceptibility test results.Levofloxacin could serve as the first line drug for the eradication therapy scheme in this area.

Key words:Helicobacter pylori;clarithromycin;levofloxacin;metronidazole;resistance

收稿日期：(2015-08-16)

文獻標識碼：

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2015.24.032A

文章編號：1673-4130(2015)24-3583-03