徐文錦，陳為升，劉惠芬（.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江寧波 35；.寧波市微循環(huán)與莨菪類藥研究所，寧波戒毒研究中心，浙江寧波 3500）

·綜述·

藥物成癮的表觀遺傳學(xué)機(jī)制研究進(jìn)展

徐文錦1，陳為升2，劉惠芬2
（1.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江寧波 315211；2.寧波市微循環(huán)與莨菪類藥研究所，寧波戒毒研究中心，浙江寧波 315010）

藥物成癮是一種慢性、復(fù)發(fā)性腦疾病，其特點(diǎn)主要表現(xiàn)為以不計(jì)后果的強(qiáng)迫性用藥和對藥物的持續(xù)渴求。藥物濫用會導(dǎo)致神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能可塑性的改變，造成分子、細(xì)胞和整體水平的適應(yīng)性改變，從而引起個體終身行為異常。目前研究發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳學(xué)改變導(dǎo)致的持續(xù)性基因表達(dá)改變是藥物成癮的重要機(jī)制。研究表明，重復(fù)暴露于濫用性藥物在大腦的獎賞區(qū)域會發(fā)生表觀遺傳學(xué)改變，主要有以下3種調(diào)控方式：組蛋白修飾（例如乙?；图谆?、DNA甲基化和非編碼RNA調(diào)控。藥物成癮的表觀遺傳學(xué)的研究將為藥物成癮的遺傳學(xué)和非遺傳學(xué)的分子調(diào)控機(jī)制的理解提供新視角，并為臨床藥物成癮的表觀遺傳學(xué)治療研究提供新方向和新思路。本文將對近年來藥物成癮的表觀遺傳學(xué)研究進(jìn)展作系統(tǒng)的綜述。

藥物成癮；表觀遺傳學(xué)；組蛋白修飾；DNA甲基化；非編碼RNA

藥物成癮是一種以強(qiáng)迫性覓藥和高復(fù)發(fā)性為特征的慢性疾病。長期使用成癮藥物出現(xiàn)強(qiáng)烈的軀體依賴和精神依賴，由此產(chǎn)生對再次用藥的強(qiáng)烈渴求，這種渴求是導(dǎo)致復(fù)吸率居高不下（戒斷1個月內(nèi)復(fù)吸率達(dá)95%）的主要原因。成癮患者表現(xiàn)為一系列行為異常，如強(qiáng)迫性覓藥和用藥行為，撤藥后病理性心境惡劣狀態(tài)等。各種伴藥線索、藥物引燃以及應(yīng)激反應(yīng)均能誘導(dǎo)復(fù)吸行為。不同刺激（線索、應(yīng)激和藥物）誘導(dǎo)的復(fù)吸行為涉及不同的神經(jīng)通路。中腦腹側(cè)被蓋（ventral tegmental area，VTA）到伏隔核（nucleus accumbens，NAc）腦區(qū)多巴胺能系統(tǒng)是目前公認(rèn)的藥物獎賞的主要通路，而內(nèi)側(cè)前額皮質(zhì)（medial prefrontal cortex，mPFC）-NAc谷氨酸能投射與藥物復(fù)吸密切相關(guān)。研究表明，藥物獎賞和復(fù)吸相關(guān)腦區(qū)在成癮過程中發(fā)生了長期的適應(yīng)性改變，如神經(jīng)和突觸可塑性改變，被認(rèn)為是導(dǎo)致上述行為異常和復(fù)吸的原因。但具體涉及的機(jī)制很復(fù)雜。國際上迄今尚缺乏行之有效的抗復(fù)吸藥物。

表觀遺傳學(xué)是指在生物體整個生物周期內(nèi)只有基因表達(dá)的改變，而不涉及DNA序列的改變，是通過基因修飾，包括組蛋白修飾、DNA甲基化和非編碼RNA調(diào)控等影響基因的表達(dá)和（或）轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控機(jī)體的生長、發(fā)育及病理過程［1］。一直以來，關(guān)于藥物成癮和復(fù)吸的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制仍不清楚。目前發(fā)現(xiàn)，cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cyclic-AMP response element binding protein，CREB）和Fos轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一△FosB等基因轉(zhuǎn)錄因子與成癮記憶密切相關(guān)，但仍無法完全解釋成癮行為及成癮記憶的長期性和頑固性。近幾年，越來越多研究證據(jù)顯示，表觀遺傳學(xué)機(jī)制在藥物成癮與復(fù)吸機(jī)制中發(fā)揮重要的作用［2-6］。與DNA序列改變不同的是，許多表觀遺傳的基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)是可逆的，這可能為許多疾病的治療開辟了廣闊的前景。因此，深入研究成癮藥物相關(guān)記憶形成和維持過程中的表觀遺傳學(xué)機(jī)制，將有助于臨床藥物成癮和復(fù)吸的預(yù)防與治療。本文就近年來藥物成癮相關(guān)的表觀遺傳學(xué)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1　組蛋白修飾在藥物成癮中的作用

組蛋白修飾在基因表達(dá)調(diào)控中具有重要作用。這些修飾包括甲基化、乙?；⒘姿峄头核鼗?，其中組蛋白氨基端上的賴氨酸和精氨酸是組蛋白共價修飾的主要靶點(diǎn)。一般來說，乙?；龠M(jìn)染色質(zhì)解聚并激活基因。組蛋白甲基化可抑制或激活基因，組蛋白磷酸化也和染色質(zhì)激活或抑制有關(guān)，而對組蛋白泛素化、類泛素化和ADP核糖基化的了解較少。越來越多的證據(jù)表明，長期暴露于濫用藥物，可通過組蛋白修飾改變穩(wěn)態(tài)的mRNA表達(dá)或使某些基因脫敏產(chǎn)生藥物成癮或戒斷后基因表達(dá)的改變［7］。多種修飾酶，包括組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferase，HAT）或組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）、組蛋白甲基化酶（histone methyltransferase，HMT）或組蛋白去甲基化酶（histone demethyltransferase，HDM）通過改變組蛋白結(jié)構(gòu)并與相鄰的DNA產(chǎn)生作用，在基因表達(dá)中發(fā)揮重要功能。

1.1組蛋白乙?；c藥物成癮

組蛋白乙?；瞧裨谒幬餅E用模型中研究最深入的染色質(zhì)修飾方式，其與基因轉(zhuǎn)錄激活密切相關(guān)。目前大多數(shù)研究工作集中在可卡因興奮劑這一濫用藥物方面［8-9］。有研究報(bào)道，運(yùn)用免疫印跡或免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，急慢性可卡因或其他興奮劑使用分別提高NAc腦區(qū)中組蛋白H3和組蛋白H4總的乙?；剑?0］。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在NAc腦區(qū)中組蛋白乙?；幚砟芨深A(yù)可卡因引起的行為反應(yīng)，系統(tǒng)或在NAc腦區(qū)注射HDAC抑制劑（增加乙?；虝r間提高乙酰化水平，促進(jìn)可卡因的行為反應(yīng)，長時間卻逆轉(zhuǎn)可卡因的作用［10-11］。2015年，Godino等［12］研究發(fā)現(xiàn)，暴露于苯丙胺和甲基苯丙胺的嚙齒動物用HDAC抑制劑處理可促進(jìn)行為反應(yīng)，HDAC調(diào)控組蛋白乙?；⒂绊懟虮磉_(dá)。還有研究觀察到抑制組蛋白乙?；臅r間依賴性調(diào)制方式［13］。文獻(xiàn)報(bào)道，CREB結(jié)合蛋白（CREB-binding protein，CBP）敲除小鼠可減輕可卡因暴露導(dǎo)致的運(yùn)動增加和獎賞反應(yīng)［14-15］；而HDAC敲除小鼠表現(xiàn)為高反應(yīng)性［16］，在NAc腦區(qū)過表達(dá)HDAC4或HDAC5減弱可卡因反應(yīng)［10-11，16］，NAc腦區(qū)選擇性地敲除HDAC1而不是HDAC2和HDAC3，同樣減輕可卡因行為反應(yīng)［13］。但在NAc腦區(qū)特異性地敲除HDAC3卻促進(jìn)可卡因位置偏愛行為的消退［17］。上述研究結(jié)果表明，組蛋白乙?；c可卡因等興奮劑成癮行為密切相關(guān)，但有必要在更多的行為模型上系統(tǒng)研究NAc腦區(qū)中各種HDAC的不同作用，尤其在藥物自身給藥和復(fù)吸模型上開展廣泛的研究，將為臨床開發(fā)HDAC類藥物用于藥物成癮的治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和新思路。

興奮劑處理能改變組蛋白乙?；?，而且這種乙?；淖兒突虮磉_(dá)相關(guān)。例如，慢性甲基苯丙胺暴露提高紋狀體腦區(qū)α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑丙酸（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid，AMPA）谷氨酸受體1（glutamate A1，GluA1）和GluA2啟動子組蛋白H4低乙酰化，并導(dǎo)致GluA1和GluA2表達(dá)的減少和受體功能的減弱［18］；急性可卡因處理提高c-Fos啟動子組蛋白H4乙?；L時期慢性可卡因暴露使c-Fos表達(dá)脫敏［10］；另外，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶5（cyclin-dependent kinase-5，CDK5）基因啟動子組蛋白H3乙酰化只發(fā)生在慢性可卡因處理后，且為長期慢性可卡因處理引起B(yǎng)DNF和CDK5基因表達(dá)增加一致［10.19-20］。還有研究發(fā)現(xiàn)，可卡因處理引起的鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱα（calmod?ulin dependent protein kinaseⅡalpha，CaMKⅡα）基因表達(dá)和該基因的組蛋白H3乙酰化改變呈正相關(guān)［11，21］。外源性地干預(yù)NAc腦區(qū)FosB基因組蛋白乙?；图谆茱@著改變可卡因覓藥行為［22］；Renthal等［23］利用CHIP-chip技術(shù)（采用啟動子芯片），運(yùn)用免疫共沉淀乙?；M蛋白H3和H4，從全基因組水平檢測了慢性可卡因處理后NAc腦區(qū)中更復(fù)雜的基因乙?；磉_(dá)譜的變化。例如，有些基因的組蛋白乙酰化變化和該基因的mRNA表達(dá)相一致，組蛋白高乙?；瘜?yīng)基因表達(dá)增加，組蛋白低乙?；瘜?yīng)基因表達(dá)抑制，但許多基因變化并非如此。乙?；閷?dǎo)的基因表達(dá)是非常復(fù)雜的，更重要的是，從全基因組水平重復(fù)測定不同個體許多組蛋白的每個位點(diǎn)的乙?；兓?，以更好地理解介導(dǎo)每個基因調(diào)控作用。同樣有必要研究其他藥物獎賞相關(guān)腦區(qū)乙酰化變化。已有研究證明，前額皮質(zhì)（prefrontal cortex，PFC）腦區(qū)在可卡因引起的乙?；閷?dǎo)BDNF等基因表達(dá)中的重要作用［24-25］。進(jìn)一步研究顯示，慢性可卡因處理能引起了2個sirtuin蛋白家族（一種NAD+依賴性的蛋白去乙?；福┘碨IRT1和SIRT2在NAc腦區(qū)中表達(dá)顯著改變［23］。這2個蛋白質(zhì)屬于Ⅲ類HDAC，利用新一代測序技術(shù)（CHIP-seq）發(fā)現(xiàn)，可卡因處理明顯提高SITR1和SITR2基因組蛋白乙?；降谋磉_(dá)，而在NAc腦區(qū)過表達(dá)或敲除SIRT酶或用藥理學(xué)方法改變SIRT酶活性，則改變可卡因自身給藥行為［23，26］，推測SIRT酶在可卡因成癮中可能扮演了重要角色。上述系列研究提示，可卡因等興奮劑誘導(dǎo)的組蛋白乙?；揎椄淖儗?dǎo)致的基因表達(dá)持久變化，可能是藥物成癮和復(fù)吸的基礎(chǔ)。但很多實(shí)驗(yàn)沒有檢測組蛋白發(fā)生乙酰化的具體賴氨酸位點(diǎn)。而且參與藥物成隱的多巴胺受體是間接還是直接地導(dǎo)致組蛋白乙?；吧鲜鲆阴；木唧w機(jī)制均不清楚。

目前，關(guān)于可卡因等興奮劑類以外的濫用藥物的乙?；芯扛枭钊?。有研究發(fā)現(xiàn)，在NAc腦區(qū)微注射HDAC抑制劑提高海洛因引起的條件性位置偏愛反應(yīng)（conditioned place preference，CPP），而PFC腦區(qū)微注射HDAC抑制劑促進(jìn)嗎啡戒斷后條件厭惡反應(yīng)的消退［27］。HDAC抑制劑處理引起阿片μ受體基因表達(dá)，而CREB介導(dǎo)的突觸后密度蛋白95（postsynaptic density protein-95，PSD-95）基因的乙?；{(diào)控在嗎啡條件性獎賞行為中發(fā)揮了重要作用［28］。上述研究均提示，組蛋白乙?；淖冊诎⑵愃幬镏幸舶l(fā)揮了重要的作用。另有關(guān)于慢性乙醇暴露引起的組蛋白乙酰化變化的文獻(xiàn)報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)，乙醇分別提高了PFC腦區(qū)H3和H4總的乙?；剑?9］；急性乙醇處理減少整個大腦HDAC酶活性，同時提高杏仁核腦區(qū)CBP基因表達(dá)和組蛋白H3和H4的乙?；剑?0］。而HDAC抑制劑（促進(jìn)乙?；p輕乙醇戒斷引起的焦慮樣癥狀［31］，增加杏仁核腦區(qū)的神經(jīng)肽（neuropeptide Y，NPY）等基因的組蛋白乙?；剑?1-32］；在NAc腦區(qū)組蛋白乙?；苷T導(dǎo)乙醇成癮行為和相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生變化［33-34］；Ghezzi等［35］利用ChIP-chip技術(shù)，發(fā)現(xiàn)乙醇和苯甲醇耐受的果蠅腦部中共有144個基因的H4組蛋白發(fā)生了顯著的改變。最新，Simon-O′Brien等［36-37］在大鼠乙醇成癮模型中發(fā)現(xiàn)，組蛋白酶抑制劑（例NaB、MS-275）可減少乙醇攝入量和覓藥動機(jī)，并抑制乙醇成癮的復(fù)發(fā)［36-37］。上述研究均表明，組蛋白乙?；步閷?dǎo)了乙醇成癮過程，并提示能通過組蛋白乙?；揎椷@種表觀遺傳調(diào)控方式干預(yù)海洛因和乙醇成癮與復(fù)發(fā)。

1.2組蛋白甲基化與藥物成癮

雖然組蛋白甲基化與其乙?；啾龋绕湓诔砂a模型上還沒有較詳細(xì)的研究，但組蛋白甲基化修飾同樣調(diào)控基因的表達(dá)［12］。最近有較多關(guān)于組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶G9a（一種具有經(jīng)典的SET結(jié)構(gòu)域的組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶）在一些濫用藥物中的作用報(bào)道。發(fā)現(xiàn)慢性長期的可卡因或阿片處理在NAc腦區(qū)G9a和GLP（G9a樣蛋白）蛋白下調(diào)，上述G9a 和GLP均屬于HMT，催化組蛋白第9位上賴氨酸二甲基化（H3K9Me2）；并且在自身給藥實(shí)驗(yàn)上得到了同樣的結(jié)果；運(yùn)用遺傳學(xué)或藥理學(xué)方法阻斷NAc腦中G9a表達(dá)則增強(qiáng)動物對可卡因和阿片藥物的行為反應(yīng)［38-39］。同樣，在皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)乙醇處理可下調(diào)G9a表達(dá)。而這種藥物導(dǎo)致的G9a和H3K9Me2下調(diào)還使動物對以后的慢性應(yīng)激更易敏感。下調(diào)G9a蛋白則提高NAc神經(jīng)元樹突分化并與突觸功能中許多蛋白表達(dá)增加相關(guān)，并確證G9a/H3K9Me2介導(dǎo)了藥物成癮的神經(jīng)可塑性改變［38］。目前已確認(rèn)G9a是表觀遺傳調(diào)控的關(guān)鍵性蛋白酶，其主要通過2種負(fù)反饋途徑發(fā)揮功能，它抑制藥物成癮重要的長時程轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子△FosB的表達(dá)［7］，同時△FosB反過來抑制G9a的表達(dá)［38-39］。同時，相關(guān)研究顯示，預(yù)先經(jīng)過可卡因暴露的動物，戒斷1個月后，再用可卡因激發(fā)會導(dǎo)致FosB基因表達(dá)的增加。上述這些FosB表達(dá)增加不是通過上游相關(guān)信號途徑，而是由組蛋白甲基化調(diào)控。在培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)，由于FosB基因啟動子區(qū)域的H3K9Me2的甲基化減少能引起FosB表達(dá)的增加，同時RNA聚合酶2的特異性磷酸化程度也加強(qiáng)［40］。推測這種組蛋白甲基化介導(dǎo)FosB表達(dá)，可能是表觀遺傳學(xué)作用的重要機(jī)制之一。另外，長期HDAC抑制劑處理能誘導(dǎo)NAc腦區(qū)中的G9a增高，也說明了HDAC抑制劑對可卡因行為反應(yīng)作用的復(fù)雜性［13］。有研究發(fā)現(xiàn)，γ-氨基丁酸A受體（γ-ami?nobutyric acid A receptor，GABAA）基因受上述反饋調(diào)節(jié)。也就是說，慢性可卡因處理后，長時期用HDAC抑制劑干預(yù)，NAc腦區(qū)GABAa亞型受體表達(dá)升高，從而提高抑制性突觸后電流。與上述不同的是，可卡因和HDAC抑制劑一起同時干預(yù)處理，NAc腦區(qū)中的G9a和H3K9Me2甲基化的升高，阻斷GABAa受體基因表達(dá)增加和抑制性突觸后電流加強(qiáng)。因此，可卡因和HDAC抑制劑同時干預(yù)可能導(dǎo)致機(jī)體過度的乙?；?，作為負(fù)反饋?zhàn)饔?，升高的G9a則阻遏乙?；黾右鸬霓D(zhuǎn)錄激活。利用ChIP-chip或ChIP-seq技術(shù)在全基因組水平獲得慢性可卡因或阿片處理后H3K9Me2抗體富集的基因表達(dá)變化譜，組蛋白H3K9Me2甲基化均和組蛋白乙酰化以及基因表達(dá)改變基本一致［25，39］。并且發(fā)現(xiàn)NAc腦區(qū)中H3K9Me2甲基化發(fā)生在基因非編碼區(qū)域［41］，可卡因減少這些基因位點(diǎn)的H3K9Me2甲基化，而慢性阿片處理后，NAc腦區(qū)H3K9Me2甲基化總水平不發(fā)生改變。上述研究表明，這些重復(fù)序列的非編碼基因位點(diǎn)可能在藥物成癮中發(fā)揮重要作用。Feng等［42］用新一代ChIP-Seq技術(shù)，得到了慢性可卡因處理后NAc腦區(qū)全基因組水平的6種H3組蛋白（H3K4me1，H3K4me3，H3K9me2，H3K9me3，H3K27me3和H3K36me3）甲基化水平的變化譜，進(jìn)一步研究表明上述甲基化改變主要涉及CREB信號通路、突觸長時程增強(qiáng)和WNT/β-聯(lián)蛋白信號通路等。更值得關(guān)注的是，與基因激活有關(guān)的H3K4me3甲基化顯著高于其余5種甲基化，推測H3K4me3甲基化可能在可卡因成癮中發(fā)揮更出色的作用。更有意義的是，2015年Koo等［43］研究發(fā)現(xiàn)，慢性嗎啡暴露抑制VTA腦區(qū)BDNF啟動區(qū)磷酸化CREB的結(jié)合，從而使啟動子區(qū)域組蛋白H3K27三甲基化，減少核受體相關(guān)蛋白-1（nuclear receptor related protein 1，NURR1）基因表達(dá)，繼而抑制BDNF基因表達(dá)，最終導(dǎo)致動物行為的神經(jīng)可塑性的改變。上述結(jié)果提示，組蛋白甲基化也受轉(zhuǎn)錄因子CREB的調(diào)控。由于ChIP-seq技術(shù)的迅速發(fā)展，該技術(shù)已運(yùn)用于藥物成癮模型中組蛋白甲基化其他位點(diǎn)的檢測，例如H3K4me1（與基因增強(qiáng)子功能相關(guān)），H3K4me3（與基因啟動子激活相關(guān)），H3K27me3（與基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)），H3K36me3（與轉(zhuǎn)錄延伸相關(guān)）以及H4K20me3（和基因抑制有關(guān)）。這些研究將有助于揭示藥物濫用的基因表達(dá)調(diào)控的組蛋白甲基化的詳細(xì)機(jī)制，并為臨床藥物成癮預(yù)防和治療提供相關(guān)生物標(biāo)志物和潛在藥物靶標(biāo)的可能。

1.3組蛋白其他修飾與藥物成癮

關(guān)于藥物成癮領(lǐng)域另一個重要研究方向，是組蛋白除乙?；图谆獾钠渌揎椩谒幬锍砂a中的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，慢性可卡因暴露改變組蛋白磷酸化［44］、組蛋白精氨酸甲基化［40］和聚ADP核糖化，還有編碼SWI/SNF家庭蛋白質(zhì)的brm/swiz相關(guān)基因1、溴區(qū)結(jié)構(gòu)域相鄰鋅指蛋白1（ATP-utilis?ing chromatin assembly and remodeling factor，ACF1）和威廉綜合征轉(zhuǎn)錄因子等特異性染色質(zhì)修飾蛋白的變化［45］；Krasnova等［46］利用大鼠自身給藥模型，發(fā)現(xiàn)CREB磷酸化調(diào)控甲基苯丙胺成癮相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。另有研究表明，嗎啡戒斷顯著提高NAc和側(cè)間隔腦區(qū)中H3組蛋白磷酸化［47］。上述結(jié)果提示，組蛋白基因的許多修飾可能介導(dǎo)了藥物成癮，是今后該領(lǐng)域研究的重要方向之一。

2　DNA甲基化在藥物成癮中的作用

DNA甲基化修飾也是表觀遺傳學(xué)重要機(jī)制之一。DNA甲基化主要發(fā)生在CPG島的胞嘧啶第5位碳原子上，胞嘧啶由此形成5-甲基胞嘧啶（5-methyl cytosine，5MC）。而新近發(fā)現(xiàn)的羥甲基化是由5-MC再氧化成5-羥甲基化胞嘧啶（5-hydroxy?methyl cytosine，5-HMC）或再成5-胞嘧啶甲酰和2-胞嘧啶羧基［48］，最終使甲基化轉(zhuǎn)變成去甲基化狀態(tài)。CPG島通常位于基因啟動子區(qū)域，在正常人基因組中處于非甲基狀態(tài)。一般DNA甲基化與基因沉默相關(guān)聯(lián)，低甲基化與基因活化相關(guān)聯(lián)；而去甲基化往往與沉默基因的重新激活相關(guān)聯(lián)。但實(shí)際上DNA甲基化是一個動態(tài)過程。

目前，關(guān)于藥物濫用的DNA甲基化表觀遺傳學(xué)機(jī)制仍不清楚。有研究報(bào)道，在許多慢性可卡因處理或在持久性的可卡因戒斷期間，NAc腦區(qū)中DNA（胞嘧啶5）甲基轉(zhuǎn)移酶3a〔DNA（cytosine-5）-methyl transferase 3a，DNMT3a〕的變化是不同的［49］；若在NAc腦區(qū)局部敲除DNMT3a或微注射DNMT抑制劑RG108則增加可卡因行為反應(yīng)，若在NAc腦區(qū)過表達(dá)DNMT3a，則減輕可卡因行為反應(yīng)，同時增加NAc神經(jīng)元樹突分化［49］。有趣的是越來越多的證據(jù)表明，甲基CpG結(jié)合蛋白2（methyl CpG binding protein 2，MeCP2）在各種藥物成癮的DNA甲基化中扮演了重要角色［50］。MeCP2蛋白是甲基化結(jié)合蛋白家族中的主要成員，多在腦內(nèi)表達(dá)，不僅與神經(jīng)元發(fā)育有關(guān)，而且與突觸的形成、分化有關(guān)。它通過與甲基化DNA的特異性結(jié)合，抑制其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，起到轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的作用，因此是重要的轉(zhuǎn)錄抑制因子［51］。Deng等［52］發(fā)現(xiàn)，NAc腦區(qū)敲除MeCP2蛋白增強(qiáng)苯丙胺獎賞；而杏仁核腦區(qū)過表達(dá)MeCP2蛋白抑制GluA1亞型受體蛋白表達(dá)，并減輕嗎啡戒斷大鼠覓藥行為的持續(xù)［53］。這些發(fā)現(xiàn)提示，DNMT3a和MeCP2與藥物成癮有重要的直接關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn)，與NAC腦區(qū)不同，慢性可卡因處理則提高動物背側(cè)紋狀體中MeCP2蛋白的表達(dá)，如在紋狀體局部敲除MeCP2則減弱可卡因自身給藥。上述結(jié)果提示，濫用藥物對DNMT3a 和MeCP2調(diào)控的復(fù)雜性，有可能存在腦區(qū)作用的特異性。2015年，Nestler實(shí)驗(yàn)室最新發(fā)現(xiàn)，可卡因引起的NAC腦區(qū)c-Fos蛋白表達(dá)的增加和c-Fos基因啟動子區(qū)CPG島甲基化減少有關(guān)，而甲基化藥物L(fēng)-甲硫氨酸能逆轉(zhuǎn)上述作用［54］；NAc腦區(qū)微注射DNA甲基化抑制劑（RG108）能顯著抑制可卡因成癮長期戒斷后線索誘導(dǎo)的覓藥行為重建。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，CDK5和雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）基因的甲基化介導(dǎo)了可卡因覓藥行為［55］。但是全基因水平上DNA甲基化變化至今還不能區(qū)分是DNA甲基化還是羥甲基化，這就使得研究結(jié)果不明確。基于真正意義上的全基因水平的DNA甲基化研究，即單堿基深度測序目前還過于昂貴。然而，這些研究有助于理解長期藥物暴露過程中特定基因位點(diǎn)上的DNA甲基化的動態(tài)調(diào)控作用，以及藥物成癮期間這種變化的可逆程度。另外，F(xiàn)eng等［56］研究發(fā)現(xiàn)，慢性可卡因處理減少NAc腦區(qū)中DNA羥化胞嘧啶成為羥化甲基化胞嘧啶的酶1（ten-eleven translocationmethylcytosine dioxygenase 1，TET1）表達(dá)，這與臨床上可卡因患者中見到的結(jié)果一致。這種TET1的下調(diào)增強(qiáng)可卡因行為反應(yīng)，進(jìn)一步檢測可卡因暴露后NAc腦區(qū)全基因組水平的5-HMC變化，發(fā)現(xiàn)5-HMC變化和基因表達(dá)增加相一致。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步提示，在藥物成癮模型上獲得全基因組水平的各種類型DNA甲基化圖譜的重要性。因此，DNA甲基化修飾在藥物成癮中的作用有待于進(jìn)一步深入。

3　非編碼RNA在藥物成癮中的作用

隨著哺乳動物基因組和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物測序的日益完善，發(fā)現(xiàn)大量轉(zhuǎn)錄的RNA不被翻譯成蛋白質(zhì)，但這些非編碼RNA在細(xì)胞功能中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用；并發(fā)現(xiàn)非編碼RNA在表觀遺傳調(diào)控中扮演了重要角色［57-58］。在表觀遺傳中起到調(diào)控作用的非編碼RNA主要有長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）、小干擾RNA（small interferine RNA，siRNA）分子以及阻遏細(xì)胞周期的核糖體RNA。許多研究發(fā)現(xiàn)，miRNA（20～25個核苷酸）通過結(jié)合靶mRNA從而抑制轉(zhuǎn)錄或誘導(dǎo)mRNA裂解。siRNA和miRNA長短和作用方式類似，區(qū)別在于siRNA可以體外合成獲得。最近發(fā)現(xiàn)，通常lncRNA（長度為＞200個核苷酸）是基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物，它們通過和轉(zhuǎn)錄因子或其他核蛋白相互作用調(diào)控染色質(zhì)修飾。

大量的研究表明，非編碼RNA在藥物成癮中具有重要作用。其調(diào)控與成癮相關(guān)基因的網(wǎng)絡(luò)，并與神經(jīng)可塑性、覓藥行為和藥物耐藥性相關(guān)。在上述非編碼RNA中較多的研究集中在miRNA與藥物成癮關(guān)系方面。藥物濫用后，各種miRNA表達(dá)發(fā)生上調(diào)或下調(diào)。例如，可卡因提高動物紋狀體中miR-181a水平，減少miR-124和let-7d表達(dá)［59-60］；外源性地提高miR-181a或減少miR-124和let-7d表達(dá)則增加可卡因獎賞［61］。越來越多的證據(jù)證明，miRNA改變則與相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)。例如，在慢性可卡因的CPP中，miR-124和let-7d過表達(dá)增加多巴胺受體，miR-181a則減少多巴胺受體，提示miRNA調(diào)節(jié)多巴胺受體［62］；后來，Hollander等［63］也發(fā)現(xiàn)可卡因自身給藥大鼠背側(cè)紋狀體中miR-212明顯增高，在紋狀體過表達(dá)miR-212則能阻斷可卡因攝入，并推測通過miR-212間接作用于CREB基因，從而抑制可卡因獎賞作用。在成癮的動物模型上研究表明，BDNF、MECP2、△FosB和多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體和GluR等基因參與了可卡因成癮引起的特異miRNA調(diào)控作用［61，64］。近來，利用新一代測序方法已在NAc和紋狀體突觸中檢測到數(shù)十種miRNA在可卡因暴露后發(fā)生顯著變化。因此，各種miRNA調(diào)節(jié)與多巴胺等成癮相關(guān)基因的表達(dá)，可能是可卡因獎賞和渴求的主要分子基礎(chǔ)。同時提示，特異改變miRNA表達(dá)可減輕可卡因覓藥行為。除了可卡因類興奮劑，在乙醇依賴研究中，Pietrzykowski等［65］報(bào)道，慢性乙醇處理引起紋狀體和下丘腦視叉區(qū)miR-9的升高，從而抑制鉀通道（BK通道）蛋白的表達(dá)，而高表達(dá)的miR-9更易產(chǎn)生乙醇依賴［65］。慢性乙醇依賴戒斷3 d后，與藥物獎賞相關(guān)的邊緣腦區(qū)中miR-124表達(dá)明顯減少，并抑制其靶基因重組細(xì)胞分裂周期42蛋白（recombinant cell division cycle 42）的表達(dá)［66］。另有研究報(bào)道，慢性乙醇暴露產(chǎn)生的神經(jīng)元凋亡與miR-497和miR-302b有關(guān)，提示乙醇濫用誘導(dǎo)的miRNA調(diào)節(jié)神經(jīng)元生長和凋亡［67］。Li等［68］發(fā)現(xiàn)，乙醇成癮大鼠伏隔核miR-382表達(dá)顯著降低，高表達(dá)miR-382顯著減少乙醇成癮大鼠的乙醇攝入量，并降低多巴胺D1受體和△-FosB表達(dá)。Lewohl等［69］在乙醇成癮者尸檢腦組織中發(fā)現(xiàn)患者的PFC腦區(qū)有35種miRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)。新近發(fā)現(xiàn)乙醇成癮后大鼠PFC 中miR-206表達(dá)增高；在大鼠乙醇自身給藥之前，高表達(dá)PFC中miR-206，大鼠乙醇攝入量有顯著增加；并發(fā)現(xiàn)miR-206通過抑制BDNF的表達(dá)發(fā)揮調(diào)控作用［70］。這些研究表明，慢性乙醇暴露改變大腦獎賞系統(tǒng)腦區(qū)miRNA的表達(dá)，因此，隨著miRNA調(diào)控的靶基因及神經(jīng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)功能的進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，將為臨床乙醇依賴治療提供新思路和方法。關(guān)于尼古丁濫用中miRNA調(diào)控研究不多，在尼古丁長期暴露后主要有miR-140*、miR-504和miR-296等發(fā)生顯著性改變。最近Taki等［71］發(fā)現(xiàn)，低等生物秀麗隱桿線蟲胚胎發(fā)育后期慢性接觸尼古丁顯著改變胚胎內(nèi)40個miRNA的表達(dá)，并預(yù)測了這些miRNA的調(diào)控靶基因，這將對后續(xù)尼古丁成癮的遺傳易感性研究提供了重要的理論基礎(chǔ)和研究思路。最后，關(guān)于海洛因等阿片類成癮中miRNA調(diào)控研究更少，尤其在藥物自身給藥和復(fù)吸模型上的相關(guān)研究。有研究人員在細(xì)胞水平上發(fā)現(xiàn)miRNA-23b和let-7可能通過調(diào)節(jié)μ阿片受體參與嗎啡成癮過程中細(xì)胞適應(yīng)性改變。Sanchez-Simon等［72］發(fā)現(xiàn)，擔(dān)尼魚（斑馬魚）胚胎經(jīng)嗎啡處理后，miR-133b表達(dá)下降，上調(diào)垂體同源盒家族因子3（Pitx3）表達(dá)，而Pitx3激活酪氨酸羥化酶和多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體，調(diào)控多巴胺能神經(jīng)元分化。提示嗎啡能通過miRNA這種表觀遺傳調(diào)控方式影響胚胎期多巴胺能神經(jīng)發(fā)育。較新的研究報(bào)道，在C57BL/6小鼠的嗎啡成癮中miR-154可通過調(diào)節(jié)Fxyd4，Grm3，Odf2l和Slc4a4基因的表達(dá)發(fā)揮重要作用［73］，但在阿片類藥物，尤其在海洛因成癮和復(fù)吸中miRNA的表達(dá)功能以及意義仍很不清楚。同樣，目前關(guān)于藥物成癮中l(wèi)ncRNA的調(diào)控作用研究尚不夠深入。Michelhaugh等［74］發(fā)現(xiàn)，lncRNA主要有心肌梗死相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（myocardial infarction-associated transcript，MIAT）、母系表達(dá)3 （maternally expressed 3，MEG3）、核富集常染色體轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1（nuclear-enriched abundant transcript 1，NEAT1）和NEAT2在海洛因成癮患者死后NAc腦區(qū)表達(dá)上調(diào)。隨后研究發(fā)現(xiàn)，可卡因成癮中NEAT2，MIAT，MEG3和EMX2反義非編碼IncRNA表達(dá)上調(diào)。Bu等［75］通過芯片技術(shù)在大鼠NAc腦區(qū)發(fā)現(xiàn)有764種mRNA和603個lncRNA表達(dá)異常，并確定410個來自相關(guān)等位基因的候選lncRNA，且有48個匹配的mRNA-lncRNA靶對。上述結(jié)果提示，可卡因誘導(dǎo)的NAc腦區(qū)mRNA表達(dá)變化可能與lncRNA表達(dá)密切相關(guān)。在乙醇成癮中也有類似的發(fā)現(xiàn)，Kryger等［76］尸檢乙醇成癮者的腦組織發(fā)現(xiàn)，肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1（metastasisassociatedlungadenocarcinoma transcrpit 1，MALAT-1）在小腦、海馬和腦干中表達(dá)增高，但在大鼠乙醇成癮中發(fā)現(xiàn)，乙醇成癮未戒斷的大鼠MALAT-1在腦海馬區(qū)表達(dá)有增高趨勢，但小腦中無改變。綜上可見，lncRNA也參與了許多濫用藥物成癮過程，但相關(guān)研究還處于最初始階段。隨著新一代測序技術(shù)及其他分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，關(guān)于lncRNA在藥物成癮中的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制可能成為未來研究的又一個熱點(diǎn)。

4　結(jié)語

綜上所述，表觀遺傳學(xué)機(jī)制在藥物成癮的發(fā)生和發(fā)展中起了關(guān)鍵的作用。藥物成癮的表觀遺傳學(xué)研究的最終目標(biāo)是要解釋成癮藥物反復(fù)暴露引起的神經(jīng)適應(yīng)性改變是如何引起成癮的持久性和頑固性。更重要的是闡明環(huán)境因素引起的生物體穩(wěn)定性變化如何影響未來或其子代對濫用藥物暴露的易感性。預(yù)期這些研究將發(fā)現(xiàn)藥物病理性成癮中發(fā)揮重要作用的一系列基因，并可作為干預(yù)藥物靶標(biāo)或成為臨床藥物成癮的有效標(biāo)志物。因此，表觀遺傳學(xué)研究將在藥物成癮新機(jī)制的闡述及臨床診斷和治療上開辟一個更新的領(lǐng)域。

然而，目前較多相關(guān)研究仍處于初級階段。許多表觀遺傳調(diào)控與藥物成癮導(dǎo)致的分子、細(xì)胞和整體水平的適應(yīng)性改變有關(guān)系。但不同種類藥物成癮如可卡因、乙醇和海洛因等，表觀遺傳發(fā)揮的作用不盡相同。至今，對表觀遺傳調(diào)控可卡因成癮的機(jī)制有了較多的了解，而對于它調(diào)控海洛因等藥物的作用知之甚少。還有在同一種藥物依賴、戒斷和復(fù)吸的不同階段中存在的主要表觀遺傳學(xué)調(diào)控方式可能也不盡相同；甚至推測在藥物成癮相關(guān)的不同腦區(qū)，包括NAc、VTA、PFC和杏仁核等腦區(qū)同樣存在表觀遺傳調(diào)控方式的特異性。因此，關(guān)于藥物成癮的表觀遺傳學(xué)研究許多方面有待于進(jìn)一步完善和深入：一是更需深入了解全基因組的表觀遺傳學(xué)是如何調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄過程。二是需要更好地理解不同形式的表觀遺傳調(diào)控是如何相互作用來影響基因表達(dá)以及主要涉及的信號通路。目前該領(lǐng)域研究的主要局限性，是很難把特定基因的表觀遺傳修飾和其功能聯(lián)系起來，且還有許多相關(guān)結(jié)果有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

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Progressinresearchofepigeneticmechanismsofdrugaddiction

XU Wen-jin1，CHEN Wei-sheng2，LIU Hui-fen2
（1.School of Medicine，Ningbo University，Ningbo 315211，China；2.Ningbo Institute of Microcirculation and Henbane，Ningbo Addiction Research and Treatment Center，Ningbo 315000，China）

Drug addiction is a chronic relapsing brain disease that is characterized by compulsive drug use and persistence of drug craving.Drug abuse can lead to changes in the neuron structure and function of plasticity，alterations in molecules and cells，and ultimately to individual abnormal behavior. Current studies have found that epigenetic changes leading to the sustainability of gene expression is an important mechanism of drug addiction.In this review，we will systematically summarize the latest advances in epigenetic mechanisms of drug addiction.This review is expected to provide robust evidence that repeated exposure to drugs of abuse induces changes within the brain′s reward regions in three major modes of epigenetic regulation-histone modifications such as acetylation and methylation，DNA methylation，and non-coding RNAs.It promises a new perspective from which to gain insights into the genetic and epigenetic mechanisms of drug addiction and a new area for epigenetic research on clinical drug addiction treatment.

drug addiction；epigenetics；histone modification；DNA methylation；noncoding RNA

TheprojectsupportedbyProvincialNaturalScienceFoundationofZhejiangProvince （LY14H310002）；Science and Technology Program of Ningbo City（2013C50033，2015C110026）；and National Basic Research Program of China（2015CB553504）

LIU Hui-fen，E-mail：lihufen@163.com，Tel：（0574）87349339

R964

A

1000-3002-（2016）03-0248-10

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.03.011

2015-08-02接受日期：2015-12-30）

（本文編輯：喬虹）

浙江省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（LY14H310002）；寧波市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013C50033，2015C110026）；國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（2015CB553504）

徐文錦（1990-），男，碩士研究生，從事藥物成癮機(jī)制與流行病學(xué)研究，E-mail：hnxuwenjin@163.com，Tel：（0574）87201592；劉惠芬（1965-），女，研究員，主要從事藥物成癮的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制研究。

劉惠芬，E-mail：lihufen@163.com；Tel：（0574）87349339