阮智通，　底婷婷，　王　燕，　趙京霞，　解欣然，　王明星，　謝湘江，　蒙玉嬌，　李　萍

(首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，銀屑病中醫(yī)臨床基礎研究北京市重點實驗室，北京市中醫(yī)研究所，北京 100010)

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養(yǎng)血解毒湯對咪喹莫特誘導的STAT3轉基因小鼠銀屑病樣皮損的干預作用*

阮智通，底婷婷，王燕，趙京霞，解欣然，王明星，謝湘江，蒙玉嬌，李萍△

(首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，銀屑病中醫(yī)臨床基礎研究北京市重點實驗室，北京市中醫(yī)研究所，北京 100010)

[摘要]目的： 觀察養(yǎng)血解毒湯對咪喹莫特誘導的STAT3轉基因小鼠銀屑病樣皮損的干預作用。方法:STAT3轉基因小鼠24只，隨機分為正常對照組、模型組、養(yǎng)血解毒湯組和甲氨蝶呤組，每組6只，采用外用咪喹莫特誘導皮膚銀屑病樣模型。分別觀察皮損面積和疾病嚴重程度(psoriasis area and severity index, PASI)，光鏡下觀察皮損組織形態(tài)學變化和表皮層厚度；采用皮膚水分油分測試筆檢測小鼠背部皮膚水分和油分含量；免疫組織化學法檢測皮損中增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)和T淋巴細胞表面標志CD3表達；采用實時熒光定量PCR技術檢測皮損Th17類細胞因子(IL-17A、IL-17C、IL-22和RORγt)mRNA表達；采用Western blot檢測皮損STAT3通路蛋白(STAT3、p-STAT3、JAK3、p-JAK3和SOCS3)的表達水平。結果: (1)養(yǎng)血解毒湯組PASI評分明顯低于模型組，HE染色觀察發(fā)現(xiàn)養(yǎng)血解毒湯組皮損表皮增生較模型組少，角化不全的細胞明顯減少，皮膚厚度降低(P<0.01)；(2)養(yǎng)血解毒湯組皮損油分和水分含量均明顯高于模型組(P<0.05)；(3)養(yǎng)血解毒湯組PCNA陽性表達遠低于模型組(P<0.01)；(4)養(yǎng)血解毒湯組脾臟重量低于模型組(P<0.05)；(5)養(yǎng)血解毒湯組Th17相關因子(IL-17A、IL-17C、IL-22和RORγt)表達水平均低于模型組，此外，p-STAT3和p-JAK3表達量亦低于模型組，而SOCS3的表達高于模型組。結論: 養(yǎng)血解毒湯可能通過抑制STAT3的磷酸化，減少Th17相關因子(IL-17A、IL-17C、IL-22和RORγt)的分泌，由此改善咪喹莫特誘導的STAT3轉基因小鼠銀屑病樣皮損改變。

[關鍵詞]銀屑病; 養(yǎng)血解毒湯; 咪喹莫特; STAT3信號轉導通路

銀屑病一種常見的慢性炎癥增生性皮膚病，易復發(fā)、難治愈，屬于自身免疫性疾病。輔助性T細胞17(T helper cell 17,Th17)的活化參與了其中的病理生理過程，而信號轉導和轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)信號通路的激活在這一過程中有重要的作用，是銀屑病發(fā)病過程中重要的信號轉導與轉錄激活因子[1]。養(yǎng)血解毒湯(Yangxue-Jiedu decoction, YXJD decoction)是北京中醫(yī)醫(yī)院在皮膚病名家趙炳南老先生治療銀屑病的經(jīng)驗方基礎上優(yōu)化而得，在隨機對照的臨床研究證實該方治療銀屑病血燥證有較好的療效，有效率為67.9%[2]，但其作用機制尚不明確。本實驗在STAT3轉基因小鼠上，經(jīng)咪喹莫特誘導銀屑病樣皮損，觀察養(yǎng)血解毒湯對Th17細胞活化及STAT3的干預作用，探究養(yǎng)血解毒湯的作用機制和藥物靶點，為其臨床應用提供依據(jù)，為藥物優(yōu)化和進一步開發(fā)提供理論支持。

材料和方法

1動物

C57BL/6J野生小鼠，體重18～20 g，由華阜康生物科技股份有限公司提供。在無特定病原體(specific pathogen free,SPF)三級動物室無菌飼料喂養(yǎng)。經(jīng)構建質(zhì)粒、純化表達載體、顯微注射后制備STAT3轉基因小鼠模型。離乳3周后剪尾檢測鑒定。選取STAT3轉基因小鼠24只(首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院北京市中醫(yī)研究所動物房制備)，雌雄各半，體重18～20 g。

2主要試劑

養(yǎng)血解毒湯所含土茯苓、雞血藤、當歸、丹參、玄參、板藍根、草河車、車前子、生地、麥冬等由首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供，制劑室負責質(zhì)量控制，按成人劑量換算為小鼠用量制備水煎劑。咪喹莫特乳膏(四川明欣藥業(yè)有限責任公司)；甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)片購自上海信誼藥廠有限公司，使用時溶于純凈水(1 mg/kg)；兔和鼠二步法檢測試劑盒、3% H2O2去離子水、DAB顯色液(中杉金橋生物技術有限公司)；增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)抗體、CD3單克隆抗體(Abcam)；TRIzol總RNA提取試劑(天根生化科技有限公司)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR? Premix Ex TaqTMII、ROX plus、DL2000 DNA Marker(TaKaRa)；白細胞介素17A(interleukin-17A,IL-17A)、IL-17C、IL-22、維甲酸相關孤兒受體γt(retinoid acid-related orphan receptor γt,RORγt)和β-actin引物合成(Invitrogen)；山羊抗兔、小鼠IgG(H+L)和GAPDH鼠單抗(天德悅)；蛋白抽提試劑和BCA蛋白定量試劑盒(賽諾博)；STAT3單克隆抗體、磷酸化STAT3(p-STAT3)單克隆抗體、Janus激酶3 (Janus kinase 3,JAK3)單克隆抗體、磷酸化JAK3(P-JAK3)單克隆抗體和細胞因子信號阻抑蛋白3 (suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)單克隆抗體(CST)。

3模型制備及分組

參考Leslie等模型制備方法。實驗前24只STAT3轉基因小鼠戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(80 mg/kg)，背部去毛后，隨機分為正常對照組、模型組、養(yǎng)血解毒湯組和甲氨蝶呤組(陽性藥物對照組)。各組小鼠每天拍照,進行銀屑病樣皮損面積和疾病嚴重程度(psoriasis area and severity index，PASI) 評分，除正常對照組外各組均在背部皮膚涂抹5%咪喹莫特乳膏42 mg，同時模型組每天口服純凈水0.2 mL，養(yǎng)血解毒湯組每天口服養(yǎng)血解毒湯水煎劑0.2 mL，甲氨蝶呤組每天口服甲氨蝶呤片水溶液0.2 mL，持續(xù)6 d。第7天檢測小鼠背部皮膚水分和油分含量，頸椎脫臼處死后取背部皮膚，三等分后分別用于病理組織檢測、Western blot法檢測和實時熒光定量PCR檢測；取脾臟稱重并記錄。

4檢測指標與方法

4.1皮損大體觀察以及PASI評分實驗期間每天對小鼠進行拍照和評分。評分參考人類PASI評分標準給予小鼠相應紅斑、鱗屑及浸潤增厚程度的積分，將三者積分相加得到總積分。

4.2皮損表皮屏障功能檢測采用皮膚水分油分測試筆，在第7天對小鼠背部皮膚水分和油分進行檢測評價。在溫度為20～25 ℃，空氣相對濕度為40%～60%環(huán)境下，皮膚與測量儀器緊密接觸，記錄測量結果。

4.3皮損病理改變采用蘇木精-伊紅(HE) 染色觀察小鼠皮膚經(jīng)4%甲醛固定、常規(guī)脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋，經(jīng)HE染色，觀察皮膚組織學改變，并在400倍鏡下測量表皮厚度。

4.4皮損角質(zhì)形成細胞的增殖細胞核抗原表達取各組小鼠背部皮膚，經(jīng)4%甲醛固定、常規(guī)脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋。5 μm厚連續(xù)切片，免疫組化染色觀察PCNA的表達。石蠟切片經(jīng)脫蠟水化、過氧化氫孵育，滴加PCNA抗鼠單克隆抗體，DAB顯色后封片。PCNA表達陽性者在表皮基底層見清晰棕黃色顆粒沉積為準。在400倍鏡下，每例標本隨機選取5個視野，觀察每例標本皮膚組織學改變，記錄5個不同區(qū)域PCNA陽性細胞表達的數(shù)據(jù)。

4.5小鼠脾臟的重量第7天觀察小鼠脾臟組織，電子天平稱取脾臟的重量，并記錄數(shù)據(jù)。

4.6皮損表皮與真皮中CD3的表達小鼠背部皮膚，經(jīng)4%甲醛固定、常規(guī)脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋。5 μm厚連續(xù)切片，免疫組化染色觀察CD3的表達。過程同上，采用CD3抗鼠單克隆抗體，DAB顯色后封片。CD3表達陽性者在表皮和真皮見清晰棕黃色顆粒沉積。在400倍鏡下，每例標本隨機選取5個視野，觀察每例標本皮膚組織學改變，記錄5個視野CD3陽性細胞表達的數(shù)據(jù)。

4.7皮損IL-17A、IL-17C、IL-22和RORγt mRNA的檢測取各組小鼠背部皮膚，采用TRIzol總RNA提取試劑進行樣本RNA提取，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser進行cDNA反轉錄，用ABI 7500型熒光定量PCR儀擴增，擴增條件為:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 40 s, 45個循環(huán)，采用2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)的相對定量分析。具體引物序列見表1。

4.8皮損STAT3相關通路蛋白(STAT3、p-STAT3、JAK3、p-JAK3和SOCS3)表達取小鼠背部皮膚，采用蛋白抽提試劑盒提取皮損組織蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。經(jīng)電泳、電轉、封閉、加入STAT3、p-STAT3、JAK3、p-JAK3、SOCS3和GAPDH單克隆抗體，反應信號經(jīng)Odssey遠紅外成像儀檢測，最后換算為灰度值表示。

F: forward; R: reverse.

5統(tǒng)計學處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1養(yǎng)血解毒湯對緩解咪喹莫特誘導的STAT3轉基因小鼠銀屑病樣皮損改變

觀察各組小鼠背部皮膚可見：與正常對照組相比，模型組皮膚出現(xiàn)紅斑、鱗屑和浸潤，產(chǎn)生類似銀屑病樣皮損。隨著藥物作用的持續(xù)，模型組皮損從第2～3天開始出現(xiàn)，隨著時間的推移，皮損日益嚴重，紅斑由淡粉色斑點變?yōu)榇竺娣e深紅色斑塊、鱗屑增多增厚、皮膚浸潤明顯。養(yǎng)血解毒湯組和甲氨蝶呤組皮損與模型組相比同期的皮損癥狀均明顯減輕，皮膚較光滑，鱗屑較少，紅斑色淺，浸潤增厚較輕，見圖1。

Figure 1.Gross observation of mice at day 7 of treatment (A) and PASI scores of mouse skin lesions induced by imiquimod (B). Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsmodel.

圖1各組小鼠第7天皮損大體表現(xiàn)和各組小鼠皮損PASI評分趨勢

HE染色顯示：正常對照組皮膚表皮層薄，僅2～3層，真皮炎癥細胞稀疏。模型組表皮增生明顯，表皮層達到8～10層，伴有角化不全，表皮棘細胞層增厚，基底細胞核有絲分裂旺盛，形成類似銀屑病樣的皮損。養(yǎng)血解毒湯組皮損中表皮層較模型組薄，約3～5層，角化不全的細胞明顯減少，表皮層厚度明顯低于模型組。MTX組的作用與養(yǎng)血解毒湯相似，見圖2。通過測量表皮層的垂直厚度發(fā)現(xiàn)：模型組表皮層增厚明顯，約為正常對照組小鼠表皮厚度的4～5倍，養(yǎng)血解毒湯組表皮增厚程度低，與模型組比較有顯著差異(P<0.01)，養(yǎng)血解毒湯組表皮增厚程度與甲氨蝶呤組相似，見表2。

Figure 2.Histological changes of skin lesions of mice at day 7 of treatment (HE staining,×400). △ indicates parakeratosis.

圖2各組小鼠第7天皮損組織學改變

表2各組小鼠第7天表皮層厚度比較

Table 2.Comparison of epidermis thickness in skin lesions at day 7 of treatment (μm. Mean±SD.n=6)

**P<0.01vsmodel.

2養(yǎng)血解毒湯可改善咪喹莫特誘導的STAT3轉基因小鼠銀屑病樣皮損表皮屏障功能異常

根據(jù)檢測結果發(fā)現(xiàn)模型組小鼠皮膚的水分與油分含量均明顯低于正常對照組，而養(yǎng)血解毒湯組小鼠皮損明顯改善，油分與水分含量均較模型組升高，差異有統(tǒng)計學意義。甲氨蝶呤組皮膚的油分與水分含量與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義，見表3。

3養(yǎng)血解毒湯顯著抑制咪喹莫特誘導的STAT3轉基因小鼠銀屑病樣皮損角質(zhì)形成細胞增殖分化異常

PCNA陽性表達位于表皮基底細胞。正常對照組小鼠皮膚僅基底層細胞增殖明顯，約1～2層，呈線狀排列；模型組陽性細胞層數(shù)明顯增多，達到5～6層，而養(yǎng)血解毒湯組著色細胞表達少于模型組，約有2～3層，接近甲氨蝶呤組，與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖3、表4。

表3各組小鼠皮膚第7天油份與水份含量比較

Table 3.Comparison of oil and water components in skin lesions at day 7 of treatment (%. Mean±SD.n=6)

*P<0.05,**P<0.01vsmodel.

4養(yǎng)血解毒湯可降低咪喹莫特誘導的STAT3轉基因小鼠脾的重量

結果發(fā)現(xiàn)模型組脾重高于空白組(P<0.01)，養(yǎng)血解毒湯組和甲氨蝶呤組小鼠脾的重量都低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表5。

Figure 3.PCNA expression of skin lesions at day 7 of treatment (immunohistochemical staining，×400).

圖3各組小鼠治療7 d 皮損PCNA 表達

表4各組小鼠第7天表皮皮損高倍鏡視野PCNA表達個數(shù)

Table 4.Comparison of the number of PCNA under high-power microscope (Mean±SD.n=6)

**P<0.01vsmodel.

5養(yǎng)血解毒湯顯著抑制咪喹莫特誘導的STAT3轉基因小鼠銀屑病樣皮損CD3+T細胞的表達

免疫組化染色顯示：正常對照組小鼠皮膚CD3+T細胞的表達水平低于模型組，二者有顯著性差異(P<0.01)，養(yǎng)血解毒湯組和甲氨蝶呤組小鼠皮膚CD3+T細胞的表達水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖4。

表5各組小鼠第7天脾的重量比較

Table 5.Comparison of the weight of spleen at day 7 of treatment (g. Mean±SD.n=6)

*P<0.05,**P<0.01vsmodel.

Figure 4.CD3 expression of skin lesions at day 7 of treatment (immunohistochemical staining，×400).Mean±SD.**P<0.01vsmodel. Arrow indicates positive expression.

圖4各組小鼠治療7 d皮損CD3表達

6養(yǎng)血解毒湯顯著抑制咪喹莫特誘導的STAT3轉基因小鼠銀屑病樣皮損中Th17類細胞因子的分泌

經(jīng)咪喹莫特誘導的STAT3轉基因陽性小鼠銀屑病樣皮損中IL-17A、IL-17C、IL-22和RORγt的相對表達量均高于正常對照組，而養(yǎng)血解毒湯組小鼠皮損中Th17相關細胞因子基因的相對表達量均有所降低，見圖5。

7養(yǎng)血解毒湯可顯著抑制咪喹莫特誘導的STAT3轉基因小鼠銀屑病樣皮損中STAT3通路相關蛋白表達

結果顯示模型組STAT3的表達量與正常對照組相似，但p-STAT3和JAK3的表達量均高于正常對照組；此外，SOCS3的表達水平也高于正常對照組。相對于模型組，養(yǎng)血解毒湯在p-STAT3、JAK3和p-JAK3的表達較少，STAT3的表達水平與模型組相似，SOCS3的表達水平高于模型組，見圖6。

討論

銀屑病是常見的慢性炎癥增生性皮膚病，易復發(fā)，可造成全身系統(tǒng)損害，其主要的組織病理學改變?yōu)榻琴|(zhì)形成細胞異常增生、角化不全、角化過度、血管生成和炎性細胞浸潤。銀屑病病因和發(fā)病機制尚未完全明確，目前仍無特效治療藥物和有效根治方法，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，是國內(nèi)外重點關注的皮膚疾病之一。

大量研究發(fā)現(xiàn)Th17細胞在銀屑病發(fā)病中起著重要作用，其分泌的細胞因子如IL-17、IL-22等，參與了銀屑病的免疫發(fā)病過程[3]。在銀屑病血熱證和血瘀證患者中IL-17、IL-22、IL-6的表達明顯升高[4]，患者外周血中IL-17水平也高于正常對照組[5]。IL-23誘導小鼠小鼠皮膚可引起IL-17高表達，產(chǎn)生類似人銀屑病的皮損癥狀[6]。此外臨床觀察發(fā)現(xiàn)使用拮抗IL-17受體的藥物能明顯改善斑塊型銀屑病的臨床癥狀[7]。STATs為胞質(zhì)蛋白家族, 參與將細胞外信號轉運至胞核內(nèi)[8]。研究發(fā)現(xiàn)銀屑病皮損中STAT3處于高表達狀態(tài)，高表達STAT3通路的K5. STAT3C轉基因小鼠可自發(fā)出現(xiàn)類似銀屑病樣皮損改變[9]，另外，STAT3通路可調(diào)控Th17細胞的分化，進而影響銀屑病的發(fā)病進程[10]，因此，我們認為在銀屑病發(fā)病過程中，Th17細胞及其細胞因子起到重要作用，而STAT3通路則參與Th17細胞的分化與分泌。

Figure 5.Comparison of the expression of IL-17A, IL-17C, IL-22 and RORγt mRNA in skin lesions at day 7 of treatment. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsmodel.

圖5各組小鼠第7天皮損IL-17A、IL-17C、IL-22和RORγt的相對表達量

Figure 6.The expression of STAT3, p-STAT3, JAK3, p-JAK3 and SOCS3 in skin lesions at day 7 of treatment. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsmodel.

圖6各組小鼠第7天皮損STAT3相關通路的蛋白表達量

咪喹莫特誘導小鼠銀屑病樣皮損模型是銀屑病的經(jīng)典動物模型之一。咪喹莫特是Toll樣受體激動劑，可激活小鼠體內(nèi)的Toll樣受體，啟動機體的炎癥免疫應答，產(chǎn)生類似銀屑病樣皮損的表現(xiàn)[11]。我們前期研究[12]發(fā)現(xiàn)咪喹莫特誘導的小鼠模型在前8 d的皮損癥狀和病理學特征以及細胞因子改變都與銀屑病相似，皮損處Th17細胞的活化參與了該模型皮損的產(chǎn)生。我們進一步轉入STAT3基因，觀察STAT3高表達小鼠在咪喹莫特誘導下銀屑病樣皮損改變，結果顯示該模型可產(chǎn)生更接近人類銀屑病的改變，例如表皮增殖導致的指狀下沿、角化不全和角化過度、微膿腫的增多、T淋巴細胞尤其是Th17細胞的炎癥浸潤和細胞因子的釋放，此外，該模型皮損中IFN、IL-6和IL-17都高于咪喹莫特誘導的野生型小鼠；同時IL-4低于誘導的野生型小鼠。這提示咪喹莫特誘導的STAT3轉基因小鼠銀屑病樣的皮損在分子水平、細胞水平和組織病理改變比單獨咪喹莫特誘導的小鼠皮損模型嚴重，且靶點明確。盡管該模型不能完全代表典型的血燥證模型，但是對于中藥的藥理作用環(huán)節(jié)也不失為一個合適的選擇。

養(yǎng)血解毒湯是由北京中醫(yī)醫(yī)院參考趙炳南老先生寶貴經(jīng)驗，聯(lián)合北京地區(qū)的多家醫(yī)院,在深入研究血燥證的基礎上，達成專家共識，形成銀屑病血燥證的優(yōu)化方案。臨床研究[13]發(fā)現(xiàn)應用臨床應用養(yǎng)血解毒湯治療血燥型銀屑病患者，總有效率達63.63%，臨床主要癥狀如鱗屑、瘙癢等均得到有效緩解；動物實驗[14]發(fā)現(xiàn)養(yǎng)血解毒湯能改善咪喹莫特誘導的BALB/c小鼠銀屑病樣皮損；這些都提示養(yǎng)血解毒湯治療銀屑病可靠有效。養(yǎng)血解毒湯以養(yǎng)血的雞血藤、解毒的土茯苓為君藥，佐以當歸、丹參養(yǎng)血潤膚，板藍根、草河車、玄參祛濕解毒，體現(xiàn)了養(yǎng)血活血、祛濕解毒的主要治則。養(yǎng)血解毒湯中雞血藤性溫，味苦、甘，具有養(yǎng)血活血通絡的功效?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)雞血藤中主要含有黃酮類、酚類、三萜及甾醇等類化合物[15]，雞血藤中有效成分黃酮有促進造血功能的作用[16]，同時對異常免疫功能具有雙向調(diào)節(jié)作用[17]，我們的研究還發(fā)現(xiàn)雞血藤黃酮有效部位SSCE具有抗腫瘤作用，與誘導腫瘤細胞發(fā)生線粒體細胞凋亡有關[18]，表明雞血藤具有多方面的作用；土茯苓味甘、淡,性平，具有解毒利濕、涼血解毒、祛風止痛的功效。其中主要成分有落新婦苷、異落新婦苷、胡蘿卜苷、花旗松素等[19]，我們的實驗發(fā)現(xiàn)土茯苓的有效成分落新婦苷可通過Jak/STAT3信號通路調(diào)控Th17細胞的分化，降低IL-17A、IL-10等炎癥因子的分泌，改善咪喹莫特誘導的BALB/c小鼠銀屑病樣皮損[20]；那么養(yǎng)血解毒湯治療銀屑病中的養(yǎng)血、解毒作用是否與中藥及其主要成分對血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用有關？

本實驗發(fā)現(xiàn)養(yǎng)血解毒湯可降低銀屑病樣皮損的PASI評分，說明養(yǎng)血解毒湯能改善咪喹莫特誘導的STAT3轉基因小鼠銀屑病樣皮損紅斑、鱗屑、浸潤等典型銀屑病改變。角質(zhì)形成細胞的異常增殖與活化是銀屑病皮損主要病理表現(xiàn)之一，研究中發(fā)現(xiàn)養(yǎng)血解毒湯可顯著降低表皮層厚度，PCNA所反映的增殖的細胞數(shù)減少也提示了養(yǎng)血解毒湯抑制角質(zhì)形成細胞異常增殖的作用。同時皮損處皮膚水分和油分含量趨向正常，提示養(yǎng)血解毒湯調(diào)節(jié)了角質(zhì)形成細胞異常分化，促進細胞角質(zhì)化進而維持表皮細胞的屏障功能。這可能與該方中養(yǎng)血中藥的作用有關。

目前研究認為，角質(zhì)形成細胞的異常改變主要是由于浸潤的T淋巴細胞及其分泌的細胞因子介導的[21]。實驗中模型組STAT3轉基因小鼠皮損中CD3+T細胞明顯高于正常，脾臟作為機體重要的外周免疫器官，在模型小鼠體內(nèi)顯著增大，提示該模型發(fā)生的全身系統(tǒng)免疫反應。養(yǎng)血解毒湯可減輕脾臟的重量，降低CD3的表達量，提示養(yǎng)血解毒湯可減輕STAT3轉基因小鼠全身免疫反應，降低皮損處的炎癥程度，由此提示養(yǎng)血解毒湯解毒功效可能與該方抑制機體，尤其是皮損部位的炎癥程度有關。Th17細胞分泌的細胞因子如IL-17、IL-22等在銀屑病發(fā)病中起到關鍵作用。實驗發(fā)現(xiàn)養(yǎng)血解毒湯可有效降低IL-17A、IL-17C和IL-22在皮損處的相對表達量，提示養(yǎng)血解毒湯的作用機制可能通過降低Th17類細胞因子的分泌有關。這也是我們今后將要深入研究的重點。

銀屑病發(fā)病過程中STAT3通路參與調(diào)控Th17類細胞因子的分泌，通過對STAT3通路相關蛋白表達的檢測發(fā)現(xiàn)養(yǎng)血解毒湯減少p-STAT3和p-JAK3蛋白表達，表明養(yǎng)血解毒湯可一定程度上抑制STAT3通路的異?；罨?；由于轉基因小鼠高表達STAT3基因，實驗組小鼠皮損中STAT3的表達量相似；SOCS3是STAT3通路的下游蛋白，可負調(diào)控STAT3通路的活化。實驗發(fā)現(xiàn)養(yǎng)血解毒湯組SOCS3的表達顯著高于模型組，提示養(yǎng)血解毒湯可能是通過促進SOCS3的分泌，抑制STAT3通路的磷酸化，降低Th17類細胞因子的分泌，從而達到治療銀屑病的目的。

綜上所述，養(yǎng)血解毒湯可抑制角質(zhì)形成細胞的過度增殖與分化，改善STAT3轉基因小鼠銀屑病樣皮損病理表現(xiàn)；減輕STAT3轉基因小鼠全身免疫反應，降低皮損處的炎癥浸潤程度；其作用機制可能是通過抑制STAT3通路的磷酸化，促進SOCS3的分泌，降低Th17類細胞因子如IL-17A、IL-17C和IL-22的分泌，從而達到治療銀屑病的目的。另外，養(yǎng)血解毒湯的養(yǎng)血作用可能與保持皮膚組織中水分和油分含量，改善銀屑病皮損屏障功能有關；解毒作用可能與抑制T淋巴細胞表達，降低IL-17A、IL-22和IL-17C的分泌有關。本研究為臨床使用養(yǎng)血解毒湯治療銀屑病提供理論依據(jù)，為今后進一步研究提供證據(jù)與方向。

[參考文獻]

[1]馮森玲, 危建安. 信號轉導和轉錄激活因子3信號通路在銀屑病發(fā)病及治療中的研究進展[J]. 醫(yī)學研究生學報, 2013, 26(4):416-420.

[2]陳維文, 周冬梅, 王萍, 等. “辨血為主，從血論治”規(guī)范化方藥辨證治療尋常型銀屑病研究[J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2015, 30(10):3614-3618.

[3]丁文媛, 烏日娜. 銀屑病中Th17相關細胞因子的研究進展[J]. 醫(yī)學綜述, 2015, 21(4):591-592.

[4]Bin Fan, Xin Li, Kan Ze, et al. Expression of T-helper 17 cells and signal transducers in patients with psoriasis vulgaris of blood-heat syndrome and blood-stasis syndrome[J]. Chin J Integr Med, 2014, 25(4):63-68.

[5]Kouris A, Pistiki A, Katoulis A, et al. Proinflammatory cytokine responses in patients with psoriasis[J]. Eur Cytokine Netw, 2015, 21(1):10-16.

[6]Kimiko Nakajima, Takashi Kanda, Mikiro Takaishi, et al. Distinct roles of IL-23 and IL-17 in the development of psoriasis-like lesions in a mouse model[J]. J Immunol, 2011, 186(7):4481-4489.

[7]Spuls PI, Hooft L. Brodalumab and ixekizumab, anti-interleukin-17-receptor antibodies for psoriasis:a critical appraisal[J]. Br J Dermatol, 2012, 167(4):710-715.

[8]Cai SQ, Chen LR, Wang HJ, et al. Effect of STAT3 phosphorylation and p53 expression on human epidermal non melanoma cutaneous tumors[J]. Zhejiang Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban, 2004, 33(4):331- 334.

[9]Sano S, Chan KS, Carbajal S, et al. Stat3 links activated kerati-nocytes and immunocytes required for development of psoriasis ina novel transgenic mouse model[J]. Nat Med, 2005, 11(1):43-49.

[10]Zheng XF, Sun YD, Liu XY. Correlation of expression of STAT3, VEGF and differentiation of Th17 cells in psoriasis vulgaris of guinea pig[J]. Asian Pac J Trop Med, 2014, 7(4):313-316.

[11]Valins W, Amini S, Berman B. The expression of Toll-like receptors in dermatological diseases and the therapeu-tic effect of current and newer topical Toll-like receptor modulators[J]. J Clin Aesthet Dermatol, 2010, 3(9):20-29.

[12]趙京霞, 底婷婷, 王燕, 等. IL-23/IL-17炎癥軸在咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病樣皮膚損害中的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2013, 29(6):1086-1094.

[13]桂潔. 從血辯證輪治銀屑病95例臨床觀察[D]. 北京: 北京中醫(yī)藥大學, 2013.

[14]底婷婷, 趙京霞, 阮智通, 等. 基于“血分蘊毒”理論的銀屑病優(yōu)化組方對咪喹莫特誘導小鼠皮損的干預作用[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 30(5):1733-1737.

[15]崔艷君, 劉屏, 陳若蕓. 雞血藤的化學成分研究[J]. 藥學學報, 2002, 37(10):784-787.

[16]鄧家剛, 梁寧, 林啟云. 雞血藤總黃酮對血虛模型小鼠造血功能的影響[J]. 中草藥, 2007, 38(7):1055-1056.

[17]熊曉玲, 李文. 部分扶正固本中藥對小鼠脾細胞IL-2產(chǎn)生的雙向調(diào)節(jié)作用[J]. 中國實驗臨床免疫學雜志, 1991, 3(4):37-40.

[18]王燕. 雞血藤抗腫瘤有效部位SSCE對A549細胞凋亡的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2010, 26(10):2011.

[19]吳博, 馬躍平, 袁久志, 等. 土茯苓化學成分的分離與鑒定[J]. 沈陽藥科大學學報, 2010, 27(2):116-118.

[20]Di TT, Ruan ZT, Zhao JX, et al. Astilbin inhibits Th17 cell differentiation and ameliorates imiquimod-induced psoriasis-like skin lesions in BALB/c mice via Jak3/Stat3 signaling pathway[J]. Int Imunnopharmacol, 2016, 32:32-38.

[21]于世榮. T細胞活化因子與銀屑病中國麻風皮膚病雜志[J]. 2008, 24(3):211-213.

(責任編輯： 林白霜， 羅森)

Effects of Yangxue-Jiedu decoction on imiquimod-induced psoriasis-like lesions in STAT3 transgenic mice

RUAN Zhi-tong, DI Ting-ting, WANG Yan, ZHAO Jing-xia, XIE Xin-ran, WANG Ming-xing, XIE Xiang-jiang, MENG Yu-jiao, LI Ping

(BeijingInstituteofTraditionalChineseMedicine,BeijingKeyLaboratoryofClinicandBasicResearchwithTraditionalChineseMedicineonPsoriasis,BeijingHospitalofTraditionalChineseMedicineAffiliatedtoCapitalMedicalUniversity,Beijing100010,China.E-mail:liping411@126.com)

[KEY WORDS]Psoriasis; Yangxue-Jiedu decoction; Imiquimod; STAT3 signaling pathway

[ABSTRACT]AIM: To observe the effects of Yangxue-Jiedu (YXJD) decoction on imiquimod-induced psoriasis-like lesions inSTAT3 transgenic mice.METHODS:STAT3 transgenic mice (n=24) were randomly divided into 4 groups: control group (using purified water for oral administration), model group (topical 5% imiquimod 42 mg and using purified water for oral administration), YXJD groups (topical 5% imiquimod 42 mg and using YXJD decoction for oral administration), and methotrexate (MTX) group (1 mg/kg MTX solution for oral administration, with the same topical imiquimod as model group). On day 7, the skin lesions were collected for examination. The lesions were evaluated according to the psoriasis area and severity index (PASI). The skin barrier function was evaluated by assessing oil and water components in the skin. The inflammation of psoriasis-like lesions was assessed by histological method. The expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and CD3 was assessed by immunohistochemical staining. The mRNA expression of IL-17A, IL-17C, IL-22 and RORγt was detected by real-time PCR. The levels of JAK/STAT3 pathway-related proteins in isolated T cells were determined by Western blot.RESULTS: Administration of YXJD decoction inhibited imiquimod-induced keratinocyte proliferation and infiltration of CD3+T cells in psoriatic lesions, and ameliorated the epidermal barrier by up-regulation of the oil and water components in psoriatic lesions. Meanwhile, administration of YXJD decoction improved the systemic immune responses by reducing the weight of the spleen. The inflammatory cytokines IL-17A, IL-17C, IL-22 and RoRγt, and the levels of JAK/STAT3 pathway-related proteins STAT3, p-STAT3, JAK3 and p-JAK3 were decreased by administration of YXJD decoction.CONCLUSION: YXJD decoction likely alleviates imiquimod-induced psoriasis-like lesions in theSTAT3 transgenic mice by inhibiting the phosphorylation of STAT3, and reducing the expression of IL-17A, IL-17C, IL-22 and RORγt.

[文章編號]1000- 4718(2016)06- 1091- 08

[收稿日期]2016- 01- 22[修回日期] 2016- 04- 29

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No. 81573974)；北京市科委十病十藥資助項目(No. Z141100002214015)

通訊作者△Tel: 010-52176679; E-mail: liping411@126.com

[中圖分類號]R275; R363

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.022