吳云婷，　劉　巖，　劉　夢(mèng)，　楊夢(mèng)如，　莫碧瑤，　潘云峰

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，廣東 廣州 510630)

?

PTEN在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞中的表達(dá)及意義*

吳云婷，劉巖，劉夢(mèng)，楊夢(mèng)如，莫碧瑤，潘云峰△

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，廣東 廣州 510630)

[摘要]目的： 探討第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)在人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)成纖維樣滑膜細(xì)胞(FLS)中的表達(dá)水平及意義。方法: 利用組織塊法獲得并體外培養(yǎng)人RA-FLS、骨關(guān)節(jié)炎(OA)-FLS及關(guān)節(jié)創(chuàng)傷-FLS；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組FLS中PTEN mRNA表達(dá)水平的差異；采用Western blotting法檢測(cè)各組FLS的PTEN蛋白表達(dá)水平以及Akt Thr308位點(diǎn)磷酸化水平的差異。結(jié)果: (1) RA-FLS中的PTEN mRNA表達(dá)水平顯著低于OA-FLS及關(guān)節(jié)創(chuàng)傷-FLS(P<0.01)，而OA-FLS與關(guān)節(jié)創(chuàng)傷-FLS之間的PTEN mRNA表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(2) RA-FLS的PTEN 蛋白表達(dá)水平顯著低于OA-FLS及關(guān)節(jié)創(chuàng)傷-FLS(P<0.05)，而OA-FLS與關(guān)節(jié)創(chuàng)傷-FLS之間的PTEN蛋白表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(3) RA-FLS中的Akt蛋白Thr308位點(diǎn)磷酸化水平顯著高于OA-FLS及關(guān)節(jié)創(chuàng)傷-FLS(P<0.01)，且OA-FLS中該位點(diǎn)的磷酸化水平顯著低于關(guān)節(jié)創(chuàng)傷-FLS(P<0.01)。(4)RA-FLS中的PTEN蛋白水平與Akt Thr308位點(diǎn)磷酸化水平呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。結(jié)論: RA-FLS中PTEN基因呈低水平表達(dá)，可能與Akt Thr308位點(diǎn)磷酸化水平異常增高相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]PTEN； Akt； 關(guān)節(jié)炎， 類風(fēng)濕； 成纖維樣滑膜細(xì)胞

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 (rheumatoid arthritis, RA)是一種病因未明的慢性全身性炎癥性疾病。RA主要累及關(guān)節(jié)滑膜，滑膜炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)以及襯里層增生是其典型病理表現(xiàn)。RA成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes, FLS)是滑膜襯里層中特殊的細(xì)胞群，它發(fā)生了類腫瘤樣改變，與RA滑膜的持續(xù)性的慢性炎癥、關(guān)節(jié)破壞和滑膜增生都有密切的關(guān)系[1]。而目前有關(guān)其生物學(xué)特性及變化機(jī)制尚未清楚。

第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)為一抑癌基因。PTEN蛋白具有雙特異磷酸酯酶活性，廣泛地參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞遷移、維持染色體穩(wěn)定性等生命活動(dòng)。PTEN對(duì)磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B (phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B, PI3K/Akt)信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)控作用在多種細(xì)胞得到證實(shí)[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，RA患者滑膜襯里層的PTEN mRNA低表達(dá)；相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)亦提示RA-FLS中PTEN mRNA低表達(dá)[3]。本文將比較RA-FLS與其它關(guān)節(jié)疾病FLS之間的PTEN表達(dá)和Akt Thr308位點(diǎn)磷酸化水平的差異，研究PTEN在RA-FLS中的異常表達(dá)狀態(tài)及其對(duì)PI3K/Akt通路的影響。

材料和方法

1標(biāo)本采集

關(guān)節(jié)滑膜組織取自中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院2014年3月至2015年9月期間行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)或膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)鏡手術(shù)的患者。RA患者4名，平均年齡48歲(33～58歲)，3名為女性；骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)患者5名，平均年齡72.3歲(64～79歲)，均為女性；創(chuàng)傷患者4名，平均年齡29.7歲(18～45歲)，均為男性。所有RA患者均符合1987年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎分類標(biāo)準(zhǔn)；所有OA患者均符合1995年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)膝骨關(guān)節(jié)炎分類標(biāo)準(zhǔn)；所有創(chuàng)傷患者均排除了RA、OA及其它系統(tǒng)性結(jié)締組織病診斷。

2主要試劑

胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)及高糖DMEM無(wú)血清培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco；RNAiso Plus(Total RNA提取試劑)、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)和SYBR? Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)均購(gòu)自TaKaRa；蛋白提取用Lysis Buffer購(gòu)自南京凱基生物科技有限公司；cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets和PhosStop Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets購(gòu)自Roche；PTEN Rabbit mAb、Phospho-Akt(Thr308) Rabbit mAb和Akt (pan) Rabbit mAb均購(gòu)自CST；兔抗GAPDH多克隆IgG抗體購(gòu)自杭州賢至生物科技有限公司；HRP標(biāo)記羊抗兔IgG抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

3主要方法

3.1FLS的培養(yǎng)與鑒定滑膜組織經(jīng)10% PBS緩沖液清洗后，用眼科剪反復(fù)剪切成1 mm×1 mm×1 mm的小塊。將組織塊移入培養(yǎng)瓶鋪置均勻，加入適量含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)直立4h后放倒培養(yǎng)。視細(xì)胞生長(zhǎng)情況及培養(yǎng)液性狀每3～4d換液1次。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到覆蓋瓶底約80%即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)，經(jīng)多次傳代后可獲得純度較高的FLS。通過2種方法進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞的鑒定：于光學(xué)相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)以及通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞的CD55陽(yáng)性率。本實(shí)驗(yàn)使用的是第3～5代FLS。

3.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)PTEN mRNA的表達(dá)收集細(xì)胞，用RNAiso Plus裂解細(xì)胞，經(jīng)過氯仿等有機(jī)溶劑抽提RNA，再經(jīng)過沉淀、洗滌，最后溶于適量的RNase-free水中。用分光光度計(jì)進(jìn)行RNA的純度分析，A260/A280在1.8～2.0的范圍內(nèi)表示RNA純度較好。按PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，條件如下：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。依照SYBR? Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。引物序列見表1。反應(yīng)體系體積20 μL，使用ABI 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s,循環(huán)40次;95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。反應(yīng)結(jié)束后分析各孔Ct值，并計(jì)算各樣本的2-ΔΔCt值。

3.3Western blotting法檢測(cè)PTEN蛋白表達(dá)以及Akt Thr308位點(diǎn)磷酸化水平提取細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，用Western blotting法檢測(cè)各組FLS的PTEN蛋白表達(dá)及Akt(Thr308)磷酸化水平。配制不連續(xù)SDS-聚丙烯酰胺凝膠，分離膠濃度為10%，各樣品取20 μg總蛋白進(jìn)行凝膠電泳。經(jīng)凝膠電泳分離蛋白質(zhì)后，通過電轉(zhuǎn)印法將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5% BSA封閉PVDF膜上的非特異性蛋白結(jié)合位點(diǎn)，再用相應(yīng)的Ⅰ抗稀釋液(稀釋比1∶1 000)4 ℃搖床孵育過夜。使用HRP標(biāo)記的Ⅱ抗稀釋液(稀釋比1∶2 000)室溫孵育1～2 h后，浸泡ECL發(fā)光液并進(jìn)行曝光。通過Image-Pro Plus軟件分析曝光圖像，讀取各條帶的積分吸光度(integral absorbance，IA)值，計(jì)算各樣本的目的蛋白與內(nèi)參照GAPDH的IA比值進(jìn)行目的蛋白的相對(duì)定量。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni法，P<0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1FLS的鑒定

光學(xué)顯微鏡下觀察可見細(xì)胞呈細(xì)長(zhǎng)紡錘形；胞核居中，卵圓形，邊界清楚，核仁明顯，與成纖維細(xì)胞相似，鑒定細(xì)胞形態(tài)與FLS相符，見圖1。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)第3代細(xì)胞的CD55表達(dá)陽(yáng)性率達(dá)92.8%，提示實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞的FLS純度較高，見圖2。

Figure 1.Morphology of the third generation of RA-FLS observed under optical microscope (×100).

圖1光鏡下第3代RA-FLS形態(tài)

Figure 2.CD55 expression in the third generation of RA-FLS detected by flow cytometry.

圖2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)第3代RA-FLS表面CD55陽(yáng)性率

2FLS的PTEN mRNA表達(dá)差異

用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)PTEN mRNA的表達(dá)，Ct值經(jīng)GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化后，以關(guān)節(jié)創(chuàng)傷-FLS為對(duì)照計(jì)算2-ΔΔCt值進(jìn)行分析。RA-FLS的PTEN mRNA表達(dá)水平顯著低于OA-FLS及關(guān)節(jié)創(chuàng)傷-FLS(P<0.01)，而OA-FLS與關(guān)節(jié)創(chuàng)傷-FLS之間的PTEN mRNA表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見圖3。

3FLS的PTEN蛋白表達(dá)差異

用Western blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞的PTEN蛋白表達(dá)水平，IA值經(jīng)GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化后分析得，RA-FLS的PTEN 蛋白表達(dá)水平顯著低于OA-FLS及關(guān)節(jié)創(chuàng)傷-FLS(P<0.05)，而OA-FLS與關(guān)節(jié)創(chuàng)傷-FLS之間的PTEN蛋白表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見圖4。

Figure 3.PTEN mRNA expression in FLS. Compared with other groups, the expression of PTEN mRNA was significantly decreased in RA-FLS. Mean±SD.n=3～4.**P<0.01vsRA-FLS.

圖3各組FLS的PTEN mRNA表達(dá)水平

Figure 4.PTEN protein expression in FLS. Compared with other groups, the expression of PTEN was significantly decreased in RA-FLS. Mean±SD.n=4.*P<0.05vsRA-FLS.

圖4各組FLS的PTEN 蛋白表達(dá)水平

4FLS的Akt(Thr308)磷酸化程度差異

用Western blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞的p-Akt(Thr308)蛋白及Akt總蛋白表達(dá)水平，Akt總蛋白IA值經(jīng)GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化，以p-Akt(Thr308)蛋白與Akt總蛋白的IA比值表示Akt蛋白Thr308位點(diǎn)的磷酸化水平。分析得，RA-FLS、OA-FLS及關(guān)節(jié)創(chuàng)傷-FLS之間的Akt總蛋白表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；RA-FLS的Akt蛋白Thr308位點(diǎn)的磷酸化水平顯著高于OA-FLS及關(guān)節(jié)創(chuàng)傷-FLS(P<0.01)，且OA-FLS該位點(diǎn)的磷酸化水平顯著低于關(guān)節(jié)創(chuàng)傷-FLS(P<0.01)，見圖5。

5RA-FLS中的PTEN蛋白水平與Akt(Thr308)磷酸化水平的聯(lián)系

對(duì)RA-FLS中的PTEN蛋白水平與Akt(Thr308)磷酸化水平進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，我們發(fā)現(xiàn)兩者之間呈顯著負(fù)相關(guān)，Pearson積矩相關(guān)系數(shù)為-0.994 5(P<0.01)，見圖6。

討論

RA的基本病理改變?yōu)榛ぱ?。RA-FLS在RA的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用，具有一定的類腫瘤性，表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：(1)增殖能力增強(qiáng)，凋亡減少。在體外培養(yǎng)細(xì)胞及人源化RA動(dòng)物模型的研究中發(fā)現(xiàn)，RA-FLS 在體外或脫離體內(nèi)免疫系統(tǒng)環(huán)境的情況下仍具有增殖的特性[1]。(2)遷移侵襲能力增強(qiáng)。

Figure 5.Phosphorylation level of Akt(Thr308) in FLS. Compared with other groups, the phosphorylation level of Akt(Thr308) was significantly increased in RA-FLS, while the phosphorylation level of Akt(Thr308) in OA-FLS was the lowest. Mean±SD.n=4.**P<0.01vsRA-FLS;##P<0.01vstrauma-FLS.

圖5各組FLS的Akt(Thr308)磷酸化水平

Figure 6.Pearson correlation between the phosphorylation level of Akt(Thr308) and PTEN protein expression in RA-FLS, showing a significant negative correlation.

圖6RA-FLS中Akt Thr308位點(diǎn)磷酸化水平與PTEN蛋白水平的關(guān)聯(lián)性分析

在沒有外來刺激的情況下，人源化RA動(dòng)物模型中的RA-FLS能夠通過外周血液循環(huán)遷移至遠(yuǎn)處的關(guān)節(jié)軟骨，并對(duì)軟骨發(fā)生侵襲作用，且這種遷移和侵襲作用不能被TNF-α拮抗劑所抑制，提示RA-FLS可在關(guān)節(jié)腔內(nèi)遷移、侵襲同時(shí)，還可跨內(nèi)皮的長(zhǎng)距離遷移和侵襲[4]。(3)分泌功能紊亂。RA-FLS通過分泌蛋白酶、細(xì)胞因子、小分子炎癥介質(zhì)等成分，產(chǎn)生促侵蝕、趨化炎性細(xì)胞、促炎等作用[1]。

在本研究中設(shè)有2個(gè)對(duì)照組，分別為OA-FLS以及關(guān)節(jié)創(chuàng)傷-FLS。OA是一種常見于老年人的關(guān)節(jié)退行性疾病，其主要特征為關(guān)節(jié)軟骨的侵蝕、邊緣骨增生，軟骨下硬化等改變，在滑膜組織中，也存在低水平的滑膜炎癥。與RA相比，OA滑膜炎較弱且較局限[5]。另一對(duì)照的理想來源為健康人的滑膜組織，但因取材困難，最終選擇半月板損傷等輕型關(guān)節(jié)創(chuàng)傷患者的滑膜組織培養(yǎng)得FLS。

PTEN是人類10號(hào)染色體上的一個(gè)抑癌基因[6]，其編碼的PTEN蛋白主要分布于胞質(zhì)中，蛋白氨基端(N端)是其主要結(jié)構(gòu)功能區(qū)，含有使PTEN蛋白具有腫瘤抑制活性的磷酸酶殘基序列及與細(xì)胞張力蛋白(tensin)、輔組蛋白(auxilin)同源的序列，是PTEN蛋白發(fā)揮蛋白磷酸酶活性和脂質(zhì)磷酸酶活性所必需的。PTEN可通過去磷酸化方式參與細(xì)胞調(diào)控，且主要通過脂質(zhì)磷酸酶活性完成，這在已知的抑癌基因中十分少見。目前已知PTEN抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用主要通過3條途徑完成：(1)通過對(duì)3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate, PIP3)去磷酸化抑制PI3K/Akt通路；(2)通過對(duì)灶性黏連激酶(focal adhesion kinase, FAK)去磷酸化下調(diào)p130Crk聯(lián)系底物(p130Crk-associated substrate, p130Cas)，抑制細(xì)胞浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移，同時(shí)FAK去磷酸化還可抑制PI3K活性從而抑制PI3K/Akt通路；(3)選擇性抑制絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路中的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)。其中研究得最多的是其對(duì)PI3K/Akt通路的抑制作用[7]。在正常組織和細(xì)胞當(dāng)中，PTEN基因及蛋白表達(dá)水平較高，半衰期較長(zhǎng)。然而在某些疾病尤其在腫瘤中，PTEN基因會(huì)出現(xiàn)不同程度的缺失和突變，PTEN蛋白也相應(yīng)出現(xiàn)下調(diào)和異常[8]。有報(bào)道稱，對(duì)RA患者滑膜組織的免疫組化實(shí)驗(yàn)未檢測(cè)到襯里層(FLS聚集區(qū))的PTENmRNA表達(dá)，而襯里下層的表達(dá)水平較高；通過將RA患者的滑膜細(xì)胞及人類軟骨移植入SCID小鼠構(gòu)建人源化動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)，侵蝕軟骨的RA滑膜細(xì)胞幾乎檢測(cè)不到PTEN mRNA的表達(dá),提示PTEN的低表達(dá)與RA FLS的侵襲能力有一定的聯(lián)系[3]。

Akt為絲/蘇氨酸蛋白激酶，其中央激酶結(jié)構(gòu)域中的308位點(diǎn)含Akt部分活化所必需的蘇氨酸，羧基末端的調(diào)節(jié)區(qū)中的473位點(diǎn)包含Akt完全活化所必需的絲氨酸[9]。目前認(rèn)為Akt蛋白激酶的完全激活需要其自身這2個(gè)磷酸化位點(diǎn)的磷酸化。經(jīng)磷酸化激活后的Akt可以通過磷酸化作用激活或抑制其下游一系列靶蛋白，經(jīng)多種途徑促進(jìn)細(xì)胞存活，是重要的抗凋亡調(diào)節(jié)因子[10]。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，MK-2206(可抑制Akt的Thr308位點(diǎn)和Ser473位點(diǎn)的自身磷酸化作用)抑制Akt磷酸化可明顯抑制RA-FLS細(xì)胞活性，且該抑制作用呈時(shí)間和劑量依賴性，提示Akt的磷酸化參與了RA-FLS增殖及活化。另有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)Akt的異常激活還參與了RA的軟骨破壞、免疫異常等活動(dòng)，在RA的致病機(jī)制中發(fā)揮了重要作用。

與腫瘤細(xì)胞類似，RA-FLS內(nèi)存在多條信號(hào)通路的異常，課題組前期研究就發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物2(mTOCR2)/Akt通路在RA-FLS中存在異常活化[11]。而Akt上游的另一通路， PI3K/Akt通路，是細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，廣泛存在于細(xì)胞中，參與細(xì)胞增殖、凋亡及分化等功能的調(diào)控作用，在多種腫瘤細(xì)胞中激活。PI3K被激活后，可催化4,5-二磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 4,5-biphosphate, PIP2)生成PIP3，PIP3將Akt和磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(phosphoinositide-dependent kinase 1, PDK-1)募集到細(xì)胞膜，在PDK1的輔助下，使Akt Thr308位點(diǎn)磷酸化，同時(shí)，在mTORC2、磷酸肌醇依賴性蛋白激酶2(phosphoinositide-dependent kinase 2, PDK-2)或整合素連接的激酶(integrin- linked kinase，ILK)等作用下，Ser473位點(diǎn)也發(fā)生磷酸化后，Akt成為有活性的激酶[12-13]。PTEN蛋白具有脂質(zhì)磷酸酶活性，可使其底物PIP3去磷酸化而失活，與PI3K作用相反，從而抑制Akt Thr308位點(diǎn)的磷酸化，抑制了PI3K活化信號(hào)向Akt傳導(dǎo)，對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路起著負(fù)調(diào)控作用[2]?？梢夾kt和PTEN分別是PI3K/Akt信號(hào)通路中的效應(yīng)因子和負(fù)性調(diào)節(jié)因子。

本課題使用的是體外培養(yǎng)的FLS細(xì)胞，細(xì)胞純度較高，細(xì)胞類型更有針對(duì)性；另外，相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也可在一定程度上反映某些分子水平的異常是否會(huì)因?yàn)榧?xì)胞脫離體內(nèi)炎癥環(huán)境以及細(xì)胞傳代而發(fā)生改變。通過Western blotting及熒光定量PCR，我們發(fā)現(xiàn)無(wú)論是在mRNA水平還是蛋白水平，RA-FLS中的PTEN均呈低表達(dá)，與相關(guān)研究結(jié)果一致。結(jié)合滑膜組織的PTEN mRNA免疫組化結(jié)果及相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說明RA-FLS中PTEN的低表達(dá)是持續(xù)存在的。為了探索PTEN在RA-FLS中是否影響PI3K/Akt通路，在前期發(fā)現(xiàn)RA-FLS存在Akt Ser473位點(diǎn)磷酸化水平增高的基礎(chǔ)上，我們通過Western blotting研究Akt(Thr308)位點(diǎn)的磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)RA-FLS中Akt(Thr308)位點(diǎn)的磷酸化水平同樣存在異常增高，且Akt(Thr308)位點(diǎn)的磷酸化水平與PTEN蛋白水平呈負(fù)相關(guān)，提示RA-FLS中PI3K/Akt通路激活可能與PTEN低表達(dá)相關(guān)。有趣的是，OA-FLS與關(guān)節(jié)創(chuàng)傷-FLS的PTEN表達(dá)水平無(wú)顯著差別，但OA-FLS的Akt(Thr308)磷酸化水平顯著低于關(guān)節(jié)創(chuàng)傷-FLS?？赡艿脑蛴校篜I3K/Akt通路有多種調(diào)控分子，在OA-FLS中，可能還有其它分子參與了Akt(Thr308)磷酸化過程的調(diào)節(jié)；而創(chuàng)傷關(guān)節(jié)內(nèi)亦存在一定炎癥反應(yīng)，可能會(huì)促進(jìn)Akt的活化；另外，關(guān)節(jié)創(chuàng)傷組患者年齡明顯低于OA組患者，發(fā)生創(chuàng)傷后組織的自我修復(fù)能力較強(qiáng)，在細(xì)胞增殖等修復(fù)過程中可能存在PI3K/Akt通路的激活。

PTEN的調(diào)控細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞遷移侵襲等功能已被普遍認(rèn)識(shí)，尤其是在腫瘤領(lǐng)域。本研究證明了RA-FLS中的PTEN呈低表達(dá)，且可能造成下游Akt(Thr308)磷酸化水平上升?？紤]到PTEN及p-Akt的作用，我們有理由推測(cè)PTEN的低表達(dá)可致RA-FLS類腫瘤化，而增加PTEN表達(dá)可逆轉(zhuǎn)該過程。這一設(shè)想已在動(dòng)物模型中得到驗(yàn)證：將表達(dá)人PTEN基因的腺病毒載體注入CIA大鼠的關(guān)節(jié)腔內(nèi)，可引起大鼠RA FLS中的Akt磷酸化水平下降，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)產(chǎn)生減少，且FLS凋亡增加[14]。由此，增加局部PTEN表達(dá)可為干預(yù)RA進(jìn)展提供新思路。

總之，本研究證明PTEN在RA-FLS中呈持續(xù)性低水平表達(dá)，在細(xì)胞脫離體內(nèi)炎癥環(huán)境以及細(xì)胞傳代后依然存在，而這可能與Akt Thr308位點(diǎn)磷酸化水平異常增高相關(guān)。至于PTEN在RA-FLS持續(xù)低表達(dá)的原因，仍值得進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Bottini N, Firestein GS. Duality of fibroblast-like synoviocytes in RA: passive responders and imprinted aggressors[J]. Nat Rev Rheumatol, 2013, 9(1): 24-33.

[2]Correia NC, Girio A, Antunes I, et al. The multiple layers of non-genetic regulation of PTEN tumour suppressor activity[J]. Eur J Cancer, 2014, 50(1): 216-225.

[3]Pap T, Franz JK, Hummel KM, et al. Activation of synovial fibroblasts in rheumatoid arthritis: lack of expression of the tumour suppressor PTEN at sites of invasive growth and destruction[J]. Arthritis Res, 2000, 2(1): 59-64.

[4]Lefevre S, Knedla A, Tennie C, et al. Synovial fibroblasts spread rheumatoid arthritis to unaffected joints[J]. Nat Med, 2009, 15(12): 1414-1420.

[5]Scanzello CR, Goldring SR. The role of synovitis in osteoarthritis pathogenesis[J]. Bone, 2012, 51(2): 249-257.

[6]Pulido R, Baker SJ, Barata JT, et al. A unified nomenclature and amino acid numbering for human PTEN[J]. Sci Signal, 2014, 7(332): pe15.

[7]王利, 呂安林, 趙曉梅, 等. 心血管系統(tǒng)中PTEN基因的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2010, 27(7): 1428-1432.

[8]Song MS, Salmena L, Pandolfi PP. The functions and regulation of the PTEN tumour suppressor[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2012, 13(5): 283-296.

[9]Hers I, Vincent EE, Tavaré JM. Akt signalling in health and disease[J]. Cell Signal, 2011, 23(10): 1515-1527.

[10]Bhutani J, Sheikh A, Niazi AK. Akt inhibitors: mechanism of action and implications for anticancer therapeutics[J]. Infect Agent Cancer, 2013, 8(1): 49.

[11]郭欣, 胡愛玲, 方霖楷, 等. RICTOR對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞活力的影響[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2013, 29(3): 526-530.

[12]Foster JG, Blunt MD, Carter E, et al. Inhibition of PI3K signaling spurs new therapeutic opportunities in inflammatory/autoimmune diseases and hematological malignancies[J]. Pharmacol Rev, 2012, 64(4): 1027-1054.

[13]Oak JS, Fruman DA. Role of phosphoinositide 3-kinase signaling in autoimmunity[J]. Autoimmunity, 2007, 40(6): 433-441.

[14]Wang CR, Shiau AL, Chen SY, et al. Amelioration of collagen-induced arthritis in rats by adenovirus-mediatedPTENgene transfer[J]. Arthritis Rheum, 2008, 58(6): 1650-1656.

(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

Expression and function of PTEN in fibroblast-like synoviocytes of rheumatoid arthritis

WU Yun-ting, LIU Yan, LIU Meng, YANG Meng-ru, MO Bi-yao, PAN Yun-feng

(DepartmentofRheumatology,TheThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:panyunfeng@medmail.com.cn)

[KEY WORDS]PTEN; Akt; Arthritis, rheumatoid; Fibroblast-like synoviocytes

[ABSTRACT]AIM: investigate the expression ofPTENgene in fibroblast-like synoviocytes (FLS) of rheumatoid arthritis (RA).METHODS: FLS were isolated from synovial tissue obtained from the patients with RA, osteoarthritis (OA) or joint trauma. The mRNA expression of PTEN was detected by RT-qPCR. The protein levels of PTEN, p-Akt (Thr308) and total Akt were determined by Western blotting. The phosphorylation status of Akt was analyzed by the protein ratio of p-Akt (Thr308)/total Akt.RESULTS: The mRNA expression of PTEN was significantly lower in RA-FLS than that in OA-FLS and joint trauma-FLS (P<0.01), while no statistically significant difference was observed between that in OA-FLS and joint trauma-FLS (P<0.05). Similarly, the protein expression of PTEN in the RA-FLS was much lower than that in the OA-FLS and joint trauma-FLS (P<0.05), and there was no difference between the latter 2 groups. Moreover, the phosphorylation level of Akt (Thr308) in the RA-FLS was significantly higher than that in the other 2 control groups (P<0.01), and that in OA-FLS was much lower than that in the joint trauma-FLS (P<0.01). Finally, Pearson correlation analysis between the phosphorylation level of Akt (Thr308) and PTEN protein expression in the RA-FLSs showed a significant negative correlation (r=-0.994 5,P<0.01).CONCLUSION: The mRNA and protein expression of PTEN are both decreased in the RA-FLS, which may contribute to the increased phosphorylation level of Akt (Thr308).

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)06- 0978- 06

[收稿日期]2015- 12- 21[修回日期] 2016- 04- 05

*[基金項(xiàng)目]廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 2014A030313080)

通訊作者△Tel: 020-82179589; E-mail： panyunfeng@medmail.com.cn

[中圖分類號(hào)]R593.22; R363

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.003