張 亮，姜 垠，邱進(jìn)杰，曾 渝（.重慶市六九原種豬場(chǎng)有限公司，重慶 409000；2.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460）

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豬精液冷凍保存影響因素研究進(jìn)展

張 亮1，姜 垠1，邱進(jìn)杰2*，曾 渝1
（1.重慶市六九原種豬場(chǎng)有限公司，重慶 409000；2.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460）

摘 要：由于豬凍精在經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)中具有重要意義，其關(guān)鍵技術(shù)——豬精液冷凍保存技術(shù)已成為研究的熱點(diǎn)。本文對(duì)豬精液冷凍原理及冷凍損傷進(jìn)行了說明，并對(duì)精液稀釋前處理、稀釋液及添加劑、冷凍保護(hù)劑、冷凍程序與解凍、冷凍劑型等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

關(guān)鍵詞：豬；精液；冷凍保存；影響因素

豬人工授精技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)，所用精液多為鮮精，與凍精相比，用鮮精配種存在精液保存時(shí)間短，活力受運(yùn)輸環(huán)境影響大、浪費(fèi)嚴(yán)重和易交叉感染等問題，使人們的視線逐漸轉(zhuǎn)移到冷凍精液上[1]。豬精液冷凍技術(shù)始于20世紀(jì)50年代，是指利用干冰、液氮、液氦等作冷源，將豬精液經(jīng)特殊處理后冷凍，保存在超低溫狀態(tài)下，以達(dá)到長(zhǎng)期保存的目的。冷凍保存打破了豬精液使用的時(shí)空界限，必將加快養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，對(duì)畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展和繁榮具有重要作用。豬精子本身對(duì)冷應(yīng)激特別敏感，在冷凍過程中極易損傷，從而造成與配母豬的受胎率低、窩產(chǎn)仔數(shù)少等問題，嚴(yán)重制約豬冷凍精液的應(yīng)用與推廣。因此，深入系統(tǒng)地研究豬精液冷凍保存關(guān)鍵技術(shù)，探討影響豬冷凍精液保存影響因素，進(jìn)一步提高豬冷凍精液質(zhì)量，已成為國(guó)內(nèi)外養(yǎng)豬生產(chǎn)中急待解決的問題。本文將就豬精液冷凍保存影響因素研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1　?豬精液冷凍原理及冷凍損傷

豬精液冷凍技術(shù)是指利用干冰(-79℃)、液氮(-196℃)、液氦(-269℃)等作為冷源，將精液進(jìn)行特殊處理后冷凍，然后保存于超低溫狀態(tài)，使精子細(xì)胞的代謝接近完全停止，使精子在生命靜止?fàn)顟B(tài)下保存下來，達(dá)到長(zhǎng)期保存的目的，當(dāng)溫度升高后又能恢復(fù)活性，且具備受精的能力。

在冷凍過程中，精子細(xì)胞會(huì)受到冰晶化導(dǎo)致的溶液效應(yīng)所致?lián)p傷(化學(xué)性損傷)和冰晶對(duì)細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)產(chǎn)生機(jī)械性損害(物理性損傷)[2]。損傷的程度一般由“冷凍—解凍”速率和“冷凍—解凍”溫度決定。然而，細(xì)胞內(nèi)形成冰晶是不可避免的，控制所形成冰晶的大小和數(shù)量，減少或不形成能夠?qū)釉斐晌锢硇該p傷的大冰晶，而僅維持在微晶狀態(tài)，就會(huì)減少對(duì)精子的損傷。為減少對(duì)精子細(xì)胞的損傷，學(xué)者們進(jìn)行了大量的研究，并取得了重大的進(jìn)展。

2　?豬精液冷凍保存的影響因素

2.1稀釋前處理

公豬精子在迅速冷卻時(shí)會(huì)失去活力，這種現(xiàn)象發(fā)生在精液采集后迅速冷卻至15℃、5℃或0℃時(shí)，稱之為“冷休克”[3]。在所有家畜中，公豬的精子對(duì)冷休克最敏感，但精子在室溫下用低的稀釋倍數(shù)稀釋，然后緩慢降溫或孵育l～5 h后能增強(qiáng)抗凍能力，故大部分精液冷凍程序均包括一個(gè)15℃或15℃以上的數(shù)小時(shí)的冷凍平衡時(shí)間。此外，在去除精清的操作上，Carvajal等[4]研究發(fā)現(xiàn)高轉(zhuǎn)速短時(shí)間離心不會(huì)影響精子的恢復(fù)和頂體的完整率，因此建議利用高轉(zhuǎn)速短時(shí)間離心去除精清。李玉芳等[5]研究結(jié)果顯示，精清不能完全去除，精清保留量為0 mL/10 mL時(shí)解凍精子的存活率和活力要顯著低于0.5 mL/10 mL和1 mL/10mL。

2.2稀釋液及添加劑

在溫度變化過程中，精液對(duì)精子的保護(hù)能力是有限的。為此，進(jìn)行精液冷凍保存就要配合使用專用的溶液先將精液進(jìn)行稀釋。對(duì)稀釋液的基本要求包括pH、緩沖性、滲透壓和低溫保護(hù)性能。一般的稀釋劑都由糖類、蛋白質(zhì)、脂類及其他添加物組成。

徐振軍等[6]進(jìn)行了不同組合的糖類對(duì)精子冷凍保存的影響試驗(yàn)，研究結(jié)果顯示，以葡萄糖-乳糖為基礎(chǔ)液組的精子存活率極顯著高于以葡萄糖-蔗糖-檸檬酸鈉組和葡萄糖-乳糖-檸檬酸鈉組，且解凍后精子頂體完整率顯著高于另外2組。金一等[7]發(fā)現(xiàn)海藻糖對(duì)精子冷凍保存是有益的，且能抑制精子內(nèi)活性氧的發(fā)生。胡建宏等[8]發(fā)現(xiàn)添加25%的海藻糖可以明顯抑制精子獲能，且海藻糖只有與甘油共同作用時(shí)才能在“冷凍—解凍”過程更加有效地保護(hù)精子。此外，有研究表明，在稀釋液中添加10 mg/L維生素C 、0.05%可溶性N-乙?；?D-葡糖胺、類透明質(zhì)酸、安鈉咖、海膽色素、2-丙羥基-β-環(huán)式糊精等可提高解凍后精子頂體完整率和質(zhì)膜完整性，保護(hù)精子活力。

為提高豬精液的冷凍效果，許多學(xué)者對(duì)豬精液的冷凍稀釋液及其添加劑進(jìn)行了大量的探索實(shí)驗(yàn)，但是效果一直都不是很理想，還沒有找到一個(gè)穩(wěn)定可靠的稀釋液及其添加劑配方，有待進(jìn)一步研究。

2.3冷凍保護(hù)劑

冷凍保護(hù)劑是指在溶液中可同水分子結(jié)合，發(fā)生水合作用，弱化水的結(jié)晶過程，使溶液的黏性增加，從而減少冰晶的形成；同時(shí)冷凍保護(hù)劑可以通過在細(xì)胞內(nèi)外維持一定的摩爾濃度，降低細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，使細(xì)胞免受溶質(zhì)的損傷[9]。在精液冷凍保存過程中，冷凍保護(hù)劑對(duì)精子的冷凍效果及解凍后精子質(zhì)量至關(guān)重要。

甘油是目前應(yīng)用較廣泛的一種冷凍保護(hù)劑，對(duì)精子既有保護(hù)作用，又有毒害作用。針對(duì)添加不同終濃度的甘油對(duì)精子活力影響的研究較多，大多結(jié)果顯示在添加2%～4%時(shí)，其解凍后精子活力和頂體完整率較高[10]。但也有研究顯示，添加14%的甘油后液氮冷凍，39℃水浴解凍后，豬精子活力仍能達(dá)到48%[11]。目前國(guó)內(nèi)外研究者多數(shù)使用的是低濃度甘油( < 4% )，而3%甘油是最常用的濃度標(biāo)準(zhǔn)。劉宏等[12]研究比較了不同平衡時(shí)間和不同DMF添加量對(duì)豬精液冷凍保護(hù)效果的影響，研究結(jié)果表明，DMF能完全替代甘油，獲得較好的冷凍保護(hù)效果。此外，針對(duì)乙二醇、丙二醇、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基亞砜(DMSO)等冷凍保護(hù)劑的研究也較多[13]。

2.4冷凍程序與解凍

豬精液冷凍的冷源主要以液氮為主，從精液的采集至最終保存，其溫度變化范圍在230℃左右，在冷凍過程中，溫度的變化對(duì)精子的影響比較大，主要表現(xiàn)為，解凍后精子活力喪失，精子膜的選擇通透性降低、頂體膜損傷等。精液“冷凍—解凍”時(shí)，使精子快速越過－5～-25℃這一高危險(xiǎn)溫區(qū)是提高精子冷凍后存活率和品質(zhì)的一個(gè)重要手段[14]。

冷凍速率對(duì)豬精液的冷凍至關(guān)重要，在冷凍精液制作過程中必須提高冷凍速度，溫度須持續(xù)下降，不能出現(xiàn)回升現(xiàn)象。精液在冷凍過程中應(yīng)快速通過危險(xiǎn)溫區(qū)(0～－60℃)，這樣才能提高凍精解凍后的活率。以15℃為分界線，先將精液在室溫(22℃)下等溫稀釋并在1 h內(nèi)降溫至15℃，維持3～4h后再利用l h時(shí)間從15℃緩慢降溫至5℃并平衡2 h，然后用含冷凍保護(hù)劑的第二液等溫稀釋并分裝冷凍，這樣可將精子的冷休克損傷降為最低。

解凍同冷凍一樣重要，目前常用的解凍液有Glucose-EDTA解凍液與DPBS-BSA解凍液。同時(shí)，適當(dāng)?shù)慕鈨鰷囟饶苁估鋬鼍涌焖僭竭^危險(xiǎn)溫區(qū)，使玻璃化快速越過結(jié)晶態(tài)直接變?yōu)橐簯B(tài)，降低對(duì)精子的傷害。Watson[15]認(rèn)為精液解凍溫度與動(dòng)物品種及精子對(duì)“冷凍—解凍”溫度驟變的敏感性有關(guān)，但多數(shù)學(xué)者傾向于采用37℃解凍。鄭筱峰等[16]研究表明，37℃水浴30s解凍法優(yōu)于室溫20 s后再于37℃水浴10s解凍法，前者的精子運(yùn)動(dòng)度、質(zhì)膜完整率、頂體完整率和體外受精胚胎發(fā)育率均顯著高于后者，且前者在體外授精胚胎發(fā)育率方面與新鮮精液對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Marta等[17]研究結(jié)果顯示，甘油濃度和解凍速率均顯著影響解凍后精子的所測(cè)質(zhì)量參數(shù)(P< 0.05)；3%的甘油或者解凍速率為l 800℃/min時(shí)解凍后的精子質(zhì)量最高(P < 0.05)，經(jīng)2×2因子設(shè)計(jì)分析結(jié)果表明，二者的組合效應(yīng)所得的解凍后精子質(zhì)量亦最高。

目前研究證明，經(jīng)37℃、30s水浴解凍方法更適合0.25mL細(xì)管豬凍精的解凍；而顆粒凍精解凍適用干解法：40～45℃、8～10s即可使精子的平均活率達(dá)到最高。

2.5冷凍劑型

精液冷凍保存的形式有主要有：安瓿、顆粒、鋁箔(塑料)袋和細(xì)(麥)管法。細(xì)管法是新近發(fā)展出來的冷凍方法，采用細(xì)管法便于保存，也有助于提高精液的利用率，包括5 mL大管、0.5 mL細(xì)管和0.25 mL細(xì)管。所有這些保存類型既有其優(yōu)點(diǎn)，亦有其缺點(diǎn)。

顆粒和0.25 mL、0.5 mL小型細(xì)管擁有較大的表面積容量比使其更適合低溫冷凍保存，然而顆粒法的冷凍精液在來源及頭份的區(qū)別上存在困難，不易解凍且容易造成交叉污染；細(xì)管法冷凍的豬精液解凍后精子存活率略低于顆粒法，受胎率卻比顆粒法高，但是1頭份一般需要解凍10～20根小型細(xì)管或2～3根扁平細(xì)管，這成為推廣應(yīng)用的主要障礙；5 mL的大型細(xì)管具有1頭份的精子數(shù)量，但其表面積容量比小，難以實(shí)現(xiàn)理想的冷凍和解凍過程[18]。塑料袋包裝的試驗(yàn)結(jié)果表明，它可以均勻地冷凍和解凍，解凍后精子存活率也高，并含有l(wèi)頭份精子數(shù)量，單個(gè)扁平袋子和多重扁平袋子(分別為54%和49% )中冷凍的精子質(zhì)膜完整率顯著地高于0.5 mL塑料細(xì)管(38% )中冷凍的精子(P< 0.05)，解凍后多重扁平袋子比0.5 mL塑料細(xì)管每劑量中存在更多活精子，但其面積太大，不適合放置在液氮罐里保存，因此尚未應(yīng)用于商業(yè)生產(chǎn)[19]。

由于公豬射精液量較大，一般0.25 mL、0.5 mL麥管很難滿足要求。通過努力，近年來5 mL大管冷凍豬精液也獲得成功，為進(jìn)一步進(jìn)行豬冷凍精液應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。塑料細(xì)管的大小和質(zhì)地對(duì)精液的保存也十分重要，要求管徑細(xì)、壁薄，便于傳熱，適于快速冷凍。容量最好是一次授精的劑量，精子密度大可用容量小些的細(xì)管。

3　存在的問題及展望

半個(gè)世紀(jì)以來，研究人員對(duì)豬精液冷凍技術(shù)進(jìn)行了大量研究，包括稀釋前的處理、稀釋液的組成和添加劑、冷凍保護(hù)劑及濃度、降溫速率和降溫條件、解凍液組成及解凍程序等。盡管隨著冷凍稀釋液及保護(hù)劑配方的改進(jìn)和研發(fā)，豬冷凍精液在各方面的質(zhì)量都有所提高，但其實(shí)際使用效果與鮮精仍有很大的差距，主要表現(xiàn)在以凍精進(jìn)行人工授精得不到與液態(tài)鮮精相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)仔數(shù)而難以推廣應(yīng)用。究其原因，主要有：在理論上，豬精液冷凍過程中的“冷凍—解凍”機(jī)理、精子損傷機(jī)理、在“冷凍—解凍”過程中外部環(huán)境變化對(duì)精子的影響、精子內(nèi)部組成物質(zhì)的變化規(guī)律及分子機(jī)制等諸多方面尚不完全清楚；在實(shí)際操作中，“冷凍—解凍”程序和稀釋液、解凍液的組成不一致，甚至差別較大；在生產(chǎn)上，存在著輸精劑量和方法不同、操作程序相對(duì)復(fù)雜等原因[1]。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，從分子生物學(xué)層面探索冷凍損傷的原理以及溫度、滲透壓、氧化應(yīng)激反應(yīng)等對(duì)精子頂體、質(zhì)膜及DNA損傷的機(jī)制，探究精液冷凍過程中各個(gè)階段精子細(xì)胞內(nèi)外的變化成為了可能。相信不久的將來，隨著對(duì)影響精子冷凍相關(guān)因素的深入研究，一定能夠攻克豬精液冷凍保存中存在的技術(shù)難題。

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(收稿日期：2015-08-31)

*通訊作者：邱進(jìn)杰，E-mail：429482286@qq.com

作者簡(jiǎn)介：張亮（1990-），男，重慶開縣人，碩士，E-mail：zhangliang215@163.com