梁　心，桂雙英,2,3，王舉濤，彭代銀，陳培勝，金傳山,2

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥　230012；2.安徽省中藥制劑工程技術(shù)研究中心，安徽 合肥　230012；

3.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院藥物制劑研究所，安徽 合肥　230012；4.安徽濟人藥業(yè)有限公司，安徽 亳州　236800)

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超高液相色譜法測定桔梗飲片和桔梗配方顆粒中桔梗皂苷D含量

梁心1，桂雙英1,2,3，王舉濤1，彭代銀1，陳培勝4，金傳山1,2

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥230012；2.安徽省中藥制劑工程技術(shù)研究中心，安徽 合肥230012；

3.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院藥物制劑研究所，安徽 合肥230012；4.安徽濟人藥業(yè)有限公司，安徽 亳州236800)

[摘要]目的采用超高效液相色譜法建立桔梗飲片及桔梗配方顆粒中桔梗皂苷D的含量測量方法，為桔梗配方顆粒的質(zhì)量控制提供實驗依據(jù)。方法采用Waters Acquity UPLC HSS T3柱(2.1 mm×50 mm,1.8 μm)，以乙腈和水為流動相，梯度洗脫，流速 0.25 mL/min，檢測波長210 nm，柱溫29 ℃。結(jié)果桔梗皂苷D進樣量在0.504~2.520 μg范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好，平均加樣回收率為99.89%，RSD為1.64%；桔梗飲片和桔梗配方顆粒中桔梗皂苷D的含量具有差異。結(jié)論本實驗所建立的測定方法簡便、準確、可靠，可用于桔梗飲片和桔梗配方顆粒中桔梗皂苷D含量的檢測。

[關(guān)鍵詞]桔梗飲片；桔梗配方顆粒；桔梗皂苷D；超高效液相色譜法

桔梗為桔?？浦参锝酃latycodongrandiflorum(Jacq.)A.DC.的干燥根[1]，具有宣肺、利咽、祛痰、排膿之功效。桔梗主產(chǎn)于安徽、山東及內(nèi)蒙古等地，安徽省作為桔梗的主產(chǎn)區(qū)，桔梗栽培面積較大，產(chǎn)量頗豐[2]。桔梗的主要活性成分為三萜皂苷，目前已分離得到45個三萜皂苷類化學(xué)成分，其中桔梗皂苷D是含量相對較高的一種皂苷，藥理學(xué)實驗表明，桔梗皂苷D具有祛痰鎮(zhèn)咳、降脂降糖以及抗癌作用[3-5]。臨床配方有桔梗飲片和桔梗配方顆粒兩種使用形式。桔梗飲片由桔梗藥材炮制而成；桔梗配方顆粒是以桔梗飲片為原料，經(jīng)提取、濃縮、干燥、制粒而成。為有效控制桔梗飲片和配方顆粒質(zhì)量，本研究選取10批安徽產(chǎn)桔梗藥材，分別制成桔梗飲片和配方顆粒，首次采用超高效液相色譜法測定桔梗飲片及桔梗配方顆粒中桔梗皂苷D的含量，并對二者相關(guān)性進行分析。

1儀器與材料

1.1儀器Waters Acquity超高效液相色譜儀H-class色譜系統(tǒng)，包括四元超高壓溶劑系統(tǒng)、自動進樣恒溫樣品管理器、PDA檢測器、柱溫箱及Empower 2色譜工作站：美國Waters公司；AG285型十萬分之一電子分析天平：德國賽多利斯公司；KQ2200型超聲儀：江蘇昆山超聲儀器有限公司；HFB-200型中藥粉碎機：湖南吉首市中州市中藥機械廠；DZF-6050型真空干燥箱：上海博訊醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2材料10批桔梗藥材分別于2013年10月至2014年1月收集于安徽不同地區(qū)，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)金傳山教授鑒定均為桔?？浦参锝酃latycodongrandiflorum(Jacq.)A. DC.干燥根，并委托安徽濟人藥業(yè)有限公司由同批藥材制得桔梗飲片、配方顆粒各10批(批號及藥材具體來源見表1)，桔梗飲片炮制方法按照《中華人民共和國藥典》(2010年版)炮制方法，桔梗配方顆粒以桔梗飲片為原料，經(jīng)水提取、濃縮、噴霧干燥制成的顆粒；桔梗皂苷D對照品(批號 13082211，購自成都曼思特生物科技有限公司，純度99.6%)；乙腈、甲醇為色譜純；其余試劑均為分析純；屈臣氏蒸餾水；硅膠G板(青島海洋化工廠分廠)。

表1　桔梗藥材來源及飲片、配方顆粒批號

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件Waters Acquity 超高效液相色譜儀HSS T3柱(2.1 mm×50 mm,1.8 μm)，流動相為乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫順序為：(0~2 min，20% A；2~5 min，20% A；5~6 min，40% A；6~9 min，40% A；9~10 min，20% A)，流速：0.25 mL/min，檢測波長210 nm，柱溫29 ℃，進樣量：1 μL。色譜圖見圖1。

2.2對照品溶液的制備精密稱定桔梗皂苷D對照品5.0 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容到刻度，即得。

2.3供試品溶液的制備分別取干燥桔梗飲片粉末和桔梗配方顆粒(過2號篩)約2.0 g，精密稱定，精密加入50%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，置水浴上蒸干，殘渣加水20 mL，微熱使溶解，加水飽和正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨試液50 mL洗滌，棄去氨液，再用正丁醇飽和的水50 mL洗滌，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過(0.22 μm)，即得。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1線性關(guān)系考察精密吸取桔梗皂苷D對照品溶液(0.504 mg/mL)1、2、3、4、5 μL，注入超高效液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件測定桔梗皂苷D峰面積，以色譜峰峰面積(y)為縱坐標，以濃度(x)為橫坐標，繪制標準曲線。回歸方程：y=316 535.6x-45 859.6，r=0.999 95，表明桔梗皂苷D在0.504～2.520 μg范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。

2.4.2精密度試驗精密吸取桔梗皂苷D對照品溶液(0.504 mg/mL)1 μL，按“2.1”項下色譜條件，連續(xù)進樣6次，測定峰面積。結(jié)果顯示，桔梗皂苷D峰面積值的RSD為1.10%，結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.4.3穩(wěn)定性試驗取同一批次供試品溶液(批號 1310048-1)，分別于0、2、4、8、12、24 h，按“2.1”項下色譜條件進樣，測定峰面積。結(jié)果顯示，桔梗皂苷D峰面積的RSD值為1.11%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)較為穩(wěn)定。

2.4.4重復(fù)性試驗取同一批次桔梗飲片(批號 1310048-1)，按照“2.3”項下方法制備6份樣品溶液，依照“2.1”項下色譜條件進樣，測定峰面積并計算桔梗皂苷D含量。結(jié)果表明，批號 1310048-1的桔梗飲片中桔梗皂苷D的平均含量為2.434 mg/g，RSD為1.15%，說明本法重復(fù)性良好。

2.4.5加樣回收率實驗精密稱取已知含量同一批次的桔梗飲片(批號 1310048-1)粉末0.50 g，共6份，精密移取桔梗皂苷D對照品溶液(0.575 mg/L)2.0 mL加入到飲片粉末中，按“2.3”項下方法制備加樣回收供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，每次1 μL，測定色譜峰面積并計算回收率，結(jié)果見表2。

表2　桔梗皂苷D加樣回收率試驗結(jié)果

2.4.6樣品含量測定結(jié)果分別取10批桔梗飲片和配方顆粒，按照“2.3”項下方法制成供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件依法測定，記錄峰面積，計算桔梗皂苷含量，結(jié)果見表3和表4。

表3　各批次飲片中桔梗皂苷D含量

表4　各批次配方顆粒中桔梗皂苷D含量

根據(jù)《中華人民共和國藥典》(2010年版)一部“桔?！表椣乱螅酃ｏ嬈薪酃Ｔ碥誅含量不得低于0.10%。因此，本次實驗采用的10批桔梗飲片含量均符合藥典標準。同時，根據(jù)對10批桔梗飲片及配方顆粒的樣品含量測定結(jié)果進行對比，同批飲片和配方顆粒的桔梗皂苷D含量，大部分批次樣品損失率在17%左右，少數(shù)批次可達到30%，桔梗配方顆粒能較好地保留飲片中有效成分桔梗皂苷D。此外，根據(jù)10批桔梗配方顆粒中桔梗皂苷D的含量實際測得值在1.076～2.114 mg/g，因此，桔梗配方顆粒每克含桔梗以桔梗皂苷D計，應(yīng)不少于0.86 mg。

3討論

3.1供試品溶液制備方法實驗中供試品溶液制備時，曾嘗試采用超聲提取法制備樣品溶液，但得到的樣品溶液中雜質(zhì)較多，特征峰難以分離；然后參考《中華人民共和國藥典》(2010年版)“桔?！表椣鲁曁崛?、正丁醇萃取、硅膠柱分離的方法，結(jié)果樣品雜質(zhì)較少，但桔梗皂苷D損失較大。本課題組在實驗中比較了直接萃取和萃取與硅膠柱分離結(jié)合兩種純化方式，結(jié)果表明，在本實驗采用的色譜條件下，直接萃取桔梗皂苷D的色譜峰能夠很好的分離，且可避免柱分離過程中桔梗皂苷D損失，因此采用超聲提取、正丁醇萃取的制備方法。

3.2色譜條件目前文獻已報道的對桔梗藥材中桔梗皂苷D的測定方法有高效液相色譜-紫外檢測器法[6-8]和高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器法[9-10]。超高效液相色譜法是一種基于小顆粒填料的液相色譜技術(shù)，其理論基礎(chǔ)為范德米特方程，通過降低顆粒度提高柱效和速度，可彌補傳統(tǒng)高效液相系統(tǒng)的不足[11]。本實驗采取的超高效液相色譜法進行含量測定，其譜峰的保留時間均在10 min以內(nèi)，極大地縮短了分析時間，同時超高效液相色譜法的流速僅為0.25 μL/min，進樣體積為1 μL，而高效液相色譜法流速多在0.7 mL/min，進樣量在10 μL或以上，因此采取超高效液相色譜法進行測定可大大降低分析成本。經(jīng)方法學(xué)驗證，其還具有靈敏度高、重復(fù)性好、快速、準確的優(yōu)點。

在流動相考察中，曾試用純乙腈、乙腈-水(75∶25)、純甲醇、甲醇-水(70∶30)，但分離效果均不理想，出現(xiàn)洗脫較快、特征峰無法有效分離等問題，故采取梯度洗脫法進行分析，桔梗皂苷D分離效果良好。

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Determination of Platycodin-D inPlatycodongrandiflorumDecoction Piece and Its Formula Granule by Ultra-Performance Liquid Chromatography

LIANGXin1,GUIShuang-ying1,2,3,WANGJu-tao1,PENGDai-yin1,CHENPei-sheng4,JINChuan-shan1,2

(1.SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China; 2.AnhuiEngineeringResearchCenterforChineseMedicinePreparation,AnhuiHefei230012,China; 3.InstituteofPharmaceutics,AnhuiAcademyofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China; 4.AnhuiJirenPharmaceuticalCo.,Ltd.,AnhuiBozhou236800,China)

[Abstract]ObjectiveTo develop a method for determination of the content of platycodin-D in Platycodon grandiflorum Decoction Piece and its Formula Granule by ultra-performance liquid chromatography (UPLC), and to provide experimental evidence for the quality control of Platycodon grandiflorum Formula Granule. MethodsThe Waters Acquity UPLC HSS T3 column (2.1 mm × 50 mm, 1.8 μm) was used with a mobile phase of acetonitrile and water. The elution was performed in a gradient mode at a flow rate of 0.25 mL/min. The detection wavelength was 210 nm and the column temperature was 29 ℃. ResultsA good linear relationship with peak area was achieved when the amount of injected platycodin-D ranged between 0.504 and 2.520 μg. The recovery of the sample averaged 99.89% and the relative standard deviation was 1.64%. The content of platycodin-D varied between Platycodon grandiflorum Decoction Piece and its Formula Granule. ConclusionThis study establishes an easy, accurate, and reliable approach for determination of the content of platycodin-D in Platycodon grandiflorum and its Formula Granule.

[Key words]Platycodon grandiflorum Decoction Piece; Platycodon grandiflorum Formula Granule; platycodin-D; ultra-performance liquid chromatography

收稿日期：(2015-04-13；編輯：張倩)

通信作者：桂雙英，guishy0520@126.com

作者簡介：梁心(1990-)，女，碩士研究生

基金項目：科技部十二五科技支撐計劃項目(2011BAI04B06)；安徽省科技攻關(guān)項目(12010402084)

[中圖分類號]R927.2[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.06.025