方向明，朱佳琪，鄔錫琴

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥　230038；2.合肥工業(yè)大學(xué)，安徽 合肥　230009)

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平喘寧對哮喘大鼠肺組織MEK1、MEK2、Ras mRNA表達(dá)的影響

方向明1，朱佳琪1，鄔錫琴2

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥230038；2.合肥工業(yè)大學(xué)，安徽 合肥230009)

[摘要]目的觀察平喘寧對寒性哮喘大鼠氣道形態(tài)學(xué)及肺組織中絲裂原活化蛋白激酶的激酶(mitogen-activated protein kinase kinase，MEK)1 mRNA、MEK2 mRNA及Ras mRNA表達(dá)水平的影響。方法將105只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常組，模型組，桂龍咳喘寧組，地塞米松組，平喘寧高、中、低劑量組，每組15只。以卵蛋白致敏及寒冷刺激復(fù)制大鼠哮喘模型，模型復(fù)制21 d后，分別給予地塞米松組，桂龍咳喘寧組，平喘寧高、中、低劑量組大鼠相應(yīng)藥物灌胃，給予正常組和模型組大鼠等容量蒸餾水灌胃。4周后取出肺組織，采用蘇木精-伊紅染色行病理形態(tài)學(xué)觀察，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)半定量檢測MEK1 mRNA、MEK2 mRNA及Ras mRNA表達(dá)水平。結(jié)果與正常組比較，模型組發(fā)生明顯炎性細(xì)胞浸潤，氣道平滑肌增厚；MEK1 mRNA、MEK2 mRNA以及Ras mRNA表達(dá)水平顯著増高(P<0.05)。與模型組比較，地塞米松組、桂龍咳喘寧組、平喘寧組大鼠肺組織病理改變減輕；各治療組MEK1 mRNA、MEK2 mRNA以及Ras mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。結(jié)論平喘寧可明顯減輕哮喘大鼠的氣道炎性反應(yīng)，抑制哮喘大鼠肺組織中MEK1 mRNA、MEK2 mRNA以及Ras mRNA的表達(dá)，延緩氣道重塑而治療哮喘。

[關(guān)鍵詞]哮喘；平喘寧；MEK1；MEK2；Ras

支氣管哮喘是一種多種炎性細(xì)胞和細(xì)胞因子參與調(diào)節(jié)的復(fù)雜慢性炎癥過程，進(jìn)而造成了氣道的高反應(yīng)性和炎性阻塞病變[1]。氣道重塑是哮喘的重要病理特征，其與氣道高反應(yīng)性是互相促進(jìn)的，共同誘導(dǎo)哮喘的發(fā)病和加重。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinase，ERK)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)家族中的一個亞族，廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生理病理過程，作為一個重要的第二信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響氣道平滑肌細(xì)胞(airway smooth muscle cells， ASMCs)的增殖。平喘寧是具有溫肺化痰、止咳平喘主要功效的臨床驗方。本實驗通過采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)，測定平喘寧干預(yù)前后哮喘大鼠肺臟ERK信號通路中絲裂原活化蛋白激酶的激酶(mitogen-activated protein kinase kinase，MEK)1、MEK2和Ras mRNA的表達(dá)水平，探討平喘寧治療寒性哮喘的分子機(jī)制。

1材料

1.1動物雄性SD大鼠105只，體質(zhì)量180~220 g，清潔級，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物管理中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(皖)2011-002。

1.2藥物及試劑平喘寧方藥組成：麻黃、蘇子、杏仁、半夏等，方藥購于安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，將中藥飲片加水煎煮，制成高劑量(4.2 g/mL)、中劑量(2.1 g/mL)、低劑量(1.05 g/mL)的平喘寧煎劑；桂龍咳喘寧顆粒劑(批號 Z20103119)：山西桂龍醫(yī)藥有限公司產(chǎn)品；地塞米松片(批號 030402)：上海信誼藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。卵蛋白(ovalbumin，OVA)(批號 20140228)：美國Sigma公司；Trizol試劑(批號 14105)：美國Invitrogen公司；目的基因和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)引物(批號 20140721)：上海捷瑞生物技術(shù)有限公司；PCR試劑和Taq DNA聚合酶(批號 00255866)：美國Fermentas公司；瓊脂糖凝膠(批號 111860)：北京索萊寶科技有限公司；焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)(批號 20130119215)：美國Sigma公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號 00145205)：Fermentas公司；DNA Marker(批號 B7301A)：寶生物公司。

1.3主要儀器9700型PCR儀：美國ABI公司；TGL-18R冷凍離心機(jī)：江蘇捷達(dá)公司；Eagle EyeⅡ凝膠成像儀：AGENE公司；FA3204B型電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司天平儀器廠；402A型超聲霧化器：江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司；CX31型光學(xué)顯微鏡：日本奧林巴斯公司；GSG-2000病理圖像分析系統(tǒng)：珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司。

2方法

2.1動物分組與模型制備取健康SD大鼠105只，常規(guī)飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分組為7組，每組15只，即正常組，模型組，平喘寧高、中、低劑量組，地塞米松組，桂龍咳喘寧組。參照文獻(xiàn)[2-4]復(fù)制寒哮模型。正常組參照上述方法，但致敏與激發(fā)時均以生理鹽水代替OVA，不用寒冷刺激。以大鼠出現(xiàn)畏寒肢冷、呼吸急促、腹肌抽搐、口唇發(fā)紺代表模型復(fù)制成功。模型復(fù)制成功后，繼續(xù)霧化激發(fā)與寒冷刺激4周。

2.2給藥方法模型復(fù)制第21天后開始給藥。給予正常組、模型組大鼠灌胃等容積的蒸餾水；對于桂龍咳喘寧組大鼠，將桂龍咳喘寧膠囊內(nèi)藥粉倒出用蒸餾水溶解后灌服(每日10 g/kg)；對于地塞米松組大鼠，將地塞米松藥片研碎后用蒸餾水溶解后灌服(每日0.4 mg/kg)；對于平喘寧高、中、低劑量組大鼠，分別給予平喘寧灌服(每日19.6、9.8、4.9 g/kg)，每日1次，連續(xù)給藥4周。末次激發(fā)后1~2 h，用3%戊巴比妥鈉作腹腔注射麻醉，取大鼠左右肺分別置于10%甲醛液中固定及―80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3觀察指標(biāo)及檢測方法

2.3.1肺組織的蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色取左上肺，修剪組織，最大限度地暴露較多的支氣管切面，切片，常規(guī)HE染色，OLYMPUS顯微鏡下觀察并攝片，光鏡下觀察HE染色切片的肺組織形態(tài)學(xué)改變。

2.3.2MEK1 mRNA、MEK2 mRNA及Ras mRNA的測定引物由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計合成。MEK1擴(kuò)增產(chǎn)物長度：295 bP；其正向引物：5′-TCGGATTGGCTCGGGCTCCT-3′，其反向引物：5′-TCTGGGGCCATCCACAGCAC-3′。MEK2擴(kuò)增產(chǎn)物長度：680 bP；其正向引物：5′-TGGTGGACCGCAACAACGCAAT-3′；其反向引物：5′-TGGGGGTCAGCAGCCGGTTAGG-3′。Ras擴(kuò)增產(chǎn)物長度：442 bP；其正向引物：5′-TCGGATTGGCTCGGGCTCCT-3′；其反向引物：5′-ACGCTCCAAGCGGTAGGTTGA-3′。GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物長度：150 bP；其正向引物：5′-CTTGCAGGCAGGTCGGTGGGT-3′；其反向引物：5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′。

(1)RNA的提取取100 mg肺組織放于勻漿管內(nèi)，冰上操作，參照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行RNA的提取，將提取的總RNA保存于-80 ℃超低溫冰箱中。取8 μL總RNA點樣于0.8%瓊脂糖凝膠電泳，Eagle EyeⅡ凝膠成像儀觀察電泳條帶，并用DU640紫外分光光度計測算RNA的OD260/OD280。結(jié)果顯示各組總RNA的平均OD260/OD280值為1.8～2.0，表明總RNA基本無蛋白質(zhì)污染與降解，RNA純度較好。

(2)RT反應(yīng)在0.2 mL EP管中，加入總RNA 8 μL、10 μmol/L Oligo(dT)1 μL和DEPC水4 μL，輕輕混勻，點動離心。PCR儀上65 ℃加熱5 min，冰浴3 min，在上述管中加入莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(moloney murine leukemia virus reverse transcription，MMLVRT)1.0 μL、10 mmol/L dNTPs 2.0 μL、胸腺嘧啶組成的核苷酸鏈(Oligo(dt)primer )1.0 μL、5倍反應(yīng)緩沖液1.0 μL、RNA酶抑制劑1 μL、RNA 2 μL、水、無核酸酶水9 μL，混勻后點動離心，在PCR儀器上進(jìn)行下述操作：42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min，取出上述反應(yīng)液，即為cDNA，-20 ℃保存。PCR反應(yīng)：吸取上述反應(yīng)液5 μL作為模板，加入到PCR反應(yīng)管中。反應(yīng)條件：MEK1變性30 s，95 ℃；退火51 ℃，30 s；72 ℃延伸，1 min；共進(jìn)行30個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min，擴(kuò)增長度片段296 bP。Ras變性30 s，95 ℃；退火51 ℃，30 s；72 ℃延伸，1 min；共進(jìn)行35個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min，擴(kuò)增長度片段442 bP。MEK2變性30 s，95 ℃；退火50 ℃，30 s；72 ℃延伸，1 min；共進(jìn)行35個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min，擴(kuò)增長度片段680 bP。內(nèi)參GAPDH變性30 s，94 ℃；退火53 ℃，30 s；72 ℃延伸1 min；共進(jìn)行30個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min，擴(kuò)增長度片段150 bP。

(3)PCR產(chǎn)物電泳分析分別取5 μL PCR產(chǎn)物與1 μL DNA加樣緩沖液混勻，以1%瓊脂糖凝膠電泳，同時加150 bp Marker作對照標(biāo)記，其結(jié)果用Eagle EyeⅡ凝膠成像儀進(jìn)行產(chǎn)物位置、光密度值掃描(密度代表基因表達(dá)豐度)分析。

3結(jié)果

3.1各組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)比較正常組大鼠支氣管、肺組織結(jié)構(gòu)正常，無炎性細(xì)胞浸潤，氣道平滑肌無增厚。模型組支氣管明顯炎性細(xì)胞浸潤，上皮細(xì)胞脫落，各級支氣管管壁及平滑肌層和基膜增厚，管道變窄，尤以細(xì)支氣管顯著。各治療組相對于模型組氣管周圍炎性細(xì)胞浸潤減少，氣道上皮細(xì)胞脫落減少，氣道平滑肌增厚減輕。其中平喘寧高劑量組炎性細(xì)胞浸潤、平滑肌增厚等病理改善最為明顯。見圖1。

3.2各組大鼠肺組織MEK1、MEK2和Ras mRNA相對表達(dá)水平比較與正常組比較，模型組MEK1、MEK2和Ras mRNA相對表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)。與模型組相比，平喘寧低、中、高劑量組MEK1、MEK2和Ras mRNA相對表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)，呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，以平喘寧高劑量組MEK1、MEK2和Ras mRNA相對表達(dá)水平為最低。平喘寧高、中、低劑量組MEK1、MEK2和Ras mRNA相對表達(dá)水平顯著低于地塞米松組和桂龍咳喘寧組(P<0.05)。見表1、圖2。

表1　各組大鼠肺組織MEK1、MEK2和Ras mRNA相對表達(dá)水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與地塞米松組比較，△P<0.05；與桂龍咳喘寧組比較，◇P<0.05。

注：M. Marker；A.正常組；B.模型組；C.桂龍咳喘寧組；D.地塞米松組；E.平喘寧高劑量組；F.平喘寧中劑量組；G.平喘寧低劑量組。

4討論

支氣管哮喘是一種世界范圍內(nèi)高發(fā)的呼吸道慢性炎癥，氣道重塑是哮喘的重要病理特征。氣道重塑組織形態(tài)學(xué)特征包括淋巴細(xì)胞的浸潤，上皮下纖維化等[1]。嗜酸性粒細(xì)胞﹑肥大細(xì)胞等炎性細(xì)胞的大量浸潤是造成哮喘慢性炎癥的關(guān)鍵。近年來，細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在哮喘慢性氣道炎癥發(fā)生的作用日益被重視。

MAPK是參與哮喘發(fā)病的一條重要受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[5]，尤其是氣道平滑肌增殖中發(fā)揮重要作用，其中Ras-Raf-MEK-ERK途徑是迄今研究比較清楚的MAPKs家族成員之一。Ras是小G蛋白，作為信號開關(guān)分子調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和分化，可以激活在哮喘氣道重塑中作為啟動基因異二聚體蛋白AP-1[6]。MEK是ERK通路的關(guān)鍵蛋白，存在MEK1和MEK2兩種亞型，表示為MEK1/2。MEK1和MEK2在激酶功能域中有80%氨基酸組成相似，共同維持下游ERK1/2的活化﹑調(diào)控細(xì)胞周期[2]，在哮喘的氣道重塑形成中起著關(guān)鍵性作用。在哮喘的發(fā)生發(fā)展中，ASMCs的大量增殖是不可避免的，而其增殖依賴于ERK通路的活化。因此抑制ERK通路的激活，是治療哮喘的新型視角。

本研究的模型復(fù)制方法在前期實驗中已多次被應(yīng)用，并檢測過肺功能指標(biāo)，證實此種方法可以復(fù)制哮喘模型。此實驗是前期系列研究的延續(xù)，有關(guān)平喘指標(biāo)在前期已有觀察，因此，此實驗不再觀察。平喘寧由經(jīng)方射干麻黃湯與三子養(yǎng)親湯化裁而成，是筆者長期治療寒哮的驗方，主要由麻黃、蘇子、杏仁、半夏等中藥組成，功效溫肺散寒、止咳平喘。研究表明，氣道內(nèi)炎性細(xì)胞和炎性遞質(zhì)的凋亡是減輕慢性氣道炎癥的一個關(guān)鍵機(jī)制，炎性細(xì)胞的凋亡對炎癥的消退以及阻止哮喘的發(fā)展起著推動作用[7]。平喘寧具有一定抗炎作用，可以減輕炎性反應(yīng)，抑制氣道重塑，從根本防治哮喘。

本實驗顯示，平喘寧可以通過調(diào)節(jié)ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制MEK1 mRNA、MEK2 mRNA以及Ras mRNA表達(dá)，從而抑制哮喘大鼠氣道炎性細(xì)胞浸潤，延緩抑制氣道重塑而治療哮喘，此實驗表明ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在中醫(yī)藥治療哮喘中起重要作用，下一步將深入探討平喘寧調(diào)節(jié)ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路治療哮喘的路徑與機(jī)制。

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·實驗研究·

Effect of Pingchuanning on mRNA Expression of MEK1, MEK2, and Ras in Lung Tissues from Asthmatic Rats

FANGXiang-ming1,ZHUJia-qi1,WUXi-qin2

(1.AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China; 2.HefeiUniversityofTechnology,AnhuiHefei230009,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of Pingchuanning on airway morphology and the mRNA expression of mitogen-activated protein kinase kinase 1 (MEK1), mitogen-activated protein kinase kinase 2 (MEK2), and Ras in the lung tissues of rats with cold-type asthma. MethodsOne hundred and five male Sprague-Dawley rats were randomized into normal group, model group, Guilongkechuanning group, dexamethasone group, and high-, medium-, and low-dose Pingchuanning groups, with 15 rats in each group. A rat model of asthma was established through ovalbumin sensitization and cold stimulation; 21 days later, the rats in the dexamethasone group, the Guilongkechuanning group, and the high-, medium-, and low-dose Pingchuanning groups were given respective drugs by gavage, and those in the normal group and the model group were given an equal volume of distilled water by gavage. The lung tissues were collected 4 weeks later, and hematoxylin and eosin staining was applied to observe the pathomorphological changes. Reverse transcription-polymerase chain reaction was applied for semiquantitative determination of mRNA expression levels of MEK1, MEK2, and Ras. ResultsCompared with the normal group, the model group had obvious inflammatory cell infiltration and airway smooth muscle thickening and significantly higher mRNA expression levels of MEK1, MEK2, and Ras (P<0.05). Compared with the model group, the dexamethasone group, the Guilongkechuanning group, and the Pingchuanning groups had fewer histopathological changes in lung tissues; each treatment group had significantly reduced mRNA expression levels of MEK1, MEK2, and Ras after treatment (P<0.05). ConclusionPingchuanning can alleviate the airway inflammatory response, inhibit the mRNA expression of MEK1, MEK2, and Ras, delay airway remodeling, and thus reach the purpose of treating asthma.

[Key words]asthma; Pingchuanning; MEK1; MEK2;Ras

收稿日期：(2015-06-26；編輯：曹健)

作者簡介：方向明(1968-)，男，博士，教授

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(81173187)

[中圖分類號]R562.2[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.06.019