何雪梅　鄭良棟　張　婷　劉夢楠　馮　濤

(重慶醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，重慶400000)

·基礎免疫學·

H9與HepG-2體外共培養(yǎng)上清對HepG-2增殖遷移及凋亡的影響①

何雪梅鄭良棟張婷劉夢楠馮濤

(重慶醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，重慶400000)

[摘要]目的：研究胚胎干細胞H9與肝癌細胞株HepG-2共培養(yǎng)上清對肝癌細胞HepG-2增殖、遷移及凋亡的影響，并探討其可能機制。方法：體外共培養(yǎng)H9與HepG-2，于不同時間即12、24、36、48 h取得上清，并把不同濃度上清即20%、40%、60%、80%作用于HepG-2細胞，于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞的生長情況和形態(tài)變化；用MTS法檢測不同濃度上清分別作用HepG-2細胞24、48 h后細胞的增殖情況；應用流式細胞術檢測細胞的凋亡情況；用Hochest33258染色檢測細胞的凋亡情況；Transwell小室法檢測上清對細胞侵襲遷移的影響。結果：不同濃度的共培養(yǎng)上清液均對HepG-2細胞的增殖有一定的抑制作用，并且40%濃度及以上的濃度能明顯促進肝癌細胞的凋亡，主要是早期和晚期凋亡，小室法也看出，上清對肝癌細胞的侵襲和遷移也具有明顯的抑制作用,同時，上清對正常的肝細胞L02無明顯的作用。結論：胚胎干細胞與肝癌細胞HepG-2共培養(yǎng)上清能夠在體外明顯抑制肝癌細胞HepG-2的增殖、遷移和侵襲，并且促進其凋亡，并且具有濃度依賴性，共培養(yǎng)時間越長，抑制效果越好。說明此上清具有一定的抗腫瘤效應。

[關鍵詞]共培養(yǎng)上清;肝癌細胞HepG-2;胚胎干細胞H9;細胞增殖;細胞凋亡

原發(fā)性肝癌(Primary carcinoma of liver)，以下簡稱肝癌，是我國常見的惡性腫瘤之一。腫瘤的發(fā)生，一是由基因決定，二是取決于機體的免疫功能，免疫力下降或者免疫功能失調會導致腫瘤的發(fā)生[1，2]。從發(fā)生學角度來看，腫瘤細胞和胚胎干細胞在細胞的增殖、生長和分化等方面都有許多共同特點，尤其是它們都具有驚人的分裂和受原癌基因調控的能力，同時在腫瘤侵襲與胚胎著床過程中也有著近似的侵入方式及相關酶解蛋白分子的參與[3-6]，最早在2004年，Lightfoot等[7]報道鼠胚胎干細胞可以在體外抑制胰腺癌細胞的生長,國內董偉等[8]證明，在小鼠Lewis肺癌模型中接種胚胎干細胞能顯著緩解機體的免疫抑制狀態(tài)，誘導抗腫瘤免疫的產生，對實體腫瘤的生長和發(fā)展具有顯著的抑制作用[9]。張弘等[10]報道人胚胎干細胞對卵巢癌生長的抑制作用，研究發(fā)現(xiàn)人胚胎干細胞對卵巢癌細胞的體內外生長有抑制作用。后曉南等[11]應用胚胎干細胞與腫瘤細胞在體外共培養(yǎng)體系，觀察小鼠囊胚與腫瘤細胞共培養(yǎng)時生長行為，人肺癌細胞株A549對囊胚體外脫帶、貼附及擴展的能力無顯著性影響。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展還與周圍微環(huán)境密切相關，腫瘤細胞向周圍微環(huán)境中分泌或接受微環(huán)境的分子信號，直接影響腫瘤細胞的分化、生長和侵襲，因而微環(huán)境也是腫瘤治療的重要因素。盡管腫瘤的微環(huán)境一直被認為是阻礙腫瘤治療的因素，但也不能否認特定的環(huán)境因素也有可能具有潛在的治療腫瘤的作用[12]，近來有關胚胎干細胞影響腫瘤細胞的生物學行為的研究為治療腫瘤提供了一種新的思路。本課題在總結前人研究工作的基礎上，研究HepG-2肝癌細胞在體外刺激胚胎干細胞時，胚胎干細胞做出的一定的抗腫瘤作用，在細胞和分子水平探索其抗腫瘤作用的具體機制。通過建立胚胎干細胞-HepG-2肝癌細胞體外接觸式共培養(yǎng)體系，觀察和檢測胚胎干細胞與HepG-2肝癌細胞之間的相互作用，及胚胎干細胞對HepG-2肝癌細胞的直接抑制作用?；谝陨涎芯课覀兿Ｍㄟ^胚胎干細胞與癌細胞株共培養(yǎng)來研究其抗癌效應，并且進一步探究其抗癌效應的機制，為腫瘤的治療找到一種新的生物治療方法。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑高糖DMEM培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基(無丙酮酸鈉)，胎牛血清(FBS)購自Gibco公司，胰蛋白酶購于美國Hyclone公司，磷酸鹽緩沖液(PBS)、 二甲基亞砜(DMSO)由重慶醫(yī)科大學基礎研究所提供。MTS購于重慶榮達生物技術有限公司；引物由上海生工生物工程技術有限公司合成；Hochest33258購于碧云天生物技術公司： PSeasy培養(yǎng)基，干細胞傳代工作液EDTA、Matrial膠，購于北京賽貝生物試劑公司。其他試劑均為國產或進口分析純試劑。

1.1.2主要儀器培養(yǎng)箱，熒光倒置顯微鏡：Olympus，日本。超凈工作臺：SW-GY-IC標準型，蘇州凈化設備廠。CO2培養(yǎng)箱：SNA-320D型，日本。酶標儀：Bio-rad。

1.1.3細胞株及培養(yǎng)HepG-2、L02為貼壁細胞，為本實驗室留種(購于中科院上海細胞庫)，用貼壁細胞的培養(yǎng)方法。培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的DMEM，常規(guī)培養(yǎng)、消化、傳代。實驗均用對數(shù)期細胞。胚胎干細胞為H9人干細胞系，購于北京賽貝生物公司，H9是James Thomson實驗室在1998年建立的第一批人ESC[13]，廣泛用于全球實驗室各類干細胞研究，是被國際公認的標準細胞系，H9來自雌性胚胎，為貼壁細胞培養(yǎng)方式，培養(yǎng)基為無血清的E8培養(yǎng)基，用六孔板培養(yǎng)，Matril基質膠鋪板，每天換液一次，待細胞邊界融合80%左右開始傳代，消化液用EDTA消化，輕輕吹打，凍存用90%E8培養(yǎng)基10%DMSO凍存液。

1.2方法

1.2.1共培養(yǎng)上清的提取[14，15]將培養(yǎng)好的HepG-2按2×104/孔提前種于24孔板內，于37℃、5%CO2飽和濕度的環(huán)境中貼壁生長12 h，待貼壁后吸掉培養(yǎng)基，將hEGCs用EDTA在37℃消化5 min，機械分割hEGCs克隆為大小相似的小細胞團，把HepG-2細胞接種到已鋪有hEGCs細胞的培養(yǎng)孔中(10個細胞團/孔)做為實驗組，用僅HepG-2和hESC的孔作為空白對照組，L02與胚胎干細胞組作為條件對照組，于12、24、36、48 h后收集上清液。

1.2.2上清對HepG-2形態(tài)的影響將處于對數(shù)生長期的HepG-2細胞按5×104ml-1細胞濃度，取100 μl種于96孔板中，24 h待細胞貼壁后，加入不同時間、終濃度為20%、40%、60%、80%的上清液共同培養(yǎng)，以不加藥物的孔為對照組，48 h、60 h觀察細胞的形態(tài)變化。

1.2.3MTS法研究上清對HepG-2細胞增殖的影響將處于對數(shù)生長期的HepG-2細胞按5×104ml-1細胞濃度，取100 μl種于96孔板中，24 h待細胞貼壁后，加入不同時間、終濃度為20%、40%、60%、80%的上清液共同培養(yǎng)，以不加藥物的孔為對照組，每個藥物濃度及對照組都設三個復孔。 培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48 h后，每孔分別加入20 μl的MTS染色液，于37℃孵箱中孵育4 h，用酶標儀于490 nm下測定各孔吸光度，求平均值計算Inhibitory。用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)作曲線估計。實驗重復3次，結果取平均值，以相對應的OD值表示細胞增殖能力的大小，繪制生長曲線。抑制率=(1-實驗組吸光度/不加上清的陰性對照組的吸光度)×100%。

1.2.4Transwell侵襲及遷移實驗按1∶5比例將Matrigel膠與無血清培養(yǎng)基配成基質膠，混勻后按50 μl/室加入Transwell小室中，37℃培養(yǎng)箱中孵育2~3 h使其固態(tài)化。消化HepG-2細胞，用無血清培養(yǎng)基清洗后重懸細胞，在上室中加入200 μl含1×105個細胞數(shù)的細胞懸液，下室中加入600 μl含10%血清的培養(yǎng)基，37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后1%甲醛固定，0.1%結晶紫染色后擦去小室上表面的基質膠及細胞，在顯微鏡下隨機選取5個視野，觀察拍照并計數(shù)。Transwell細胞遷移實驗不在小室中加基質膠，上室中加入200 μl 含3×104個細胞數(shù)的細胞懸液，其余操作步驟同侵襲實驗。

1.2.5檢測細胞凋亡的改變將HepG-2細胞接種于6孔板，每孔接種細胞3×104個。37℃、5%的CO2培養(yǎng)，24 h加入不同濃度的上清(分組：實驗分為對照組和實驗組，實驗組加入不同濃度的上清，對照組不加藥)。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，胰酶消化收集細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次，用流式細胞儀檢測凋亡。

2結果

2.1上清對HepG-2細胞增殖的影響(表1、圖1)為觀察上清對肝癌細胞HepG-2的增殖抑制作用，實驗使用不同濃度、不同時間段的上清處理HepG-2，MTS結果顯示：20%濃度的48 h上清作用于肝癌HepG-2細胞的24、48 h的抑制率分別為22.09%、28.37%；40%濃度的上清作用于肝癌HepG-2細胞的24、48 h的抑制率分別為38.64%、40.83%。60%濃度的上清作用于肝癌HepG-2細胞的24、48 h的抑制率分別為46.60%、55.88%；80%濃度的上清作用于肝癌HepG-2細胞的24、48 h的抑制率分別為57.91%、62.85%。結果表明：各濃度組的共培養(yǎng)上清對人肝癌細胞株HepG-2細胞的抑制作用，強于對照組，經統(tǒng)計處理，除共培養(yǎng)12 h和20%的濃度對其影響差異不顯著外(P>0.01)，其他組差異均有顯著性(P<0.05)，綜上可知，這種抑制作用與藥物濃度及作用時間呈正相關，劑量越大、藥物作用時間越長，抑制率越高(P<0.01或P<0.05)。而對L02細胞的抑制作用隨著劑量增大、藥物作用時間延長抑制率亦有增加的趨勢，但差異無顯著性(P>0.05)。

Note：Difference between concentration，1)P<0.05；2)P<0.01.Difference between time，3)P<0.05，4)P<0.01.

2.2上清對HepG-2形態(tài)的影響(圖2)HepG-2肝癌細胞與胚胎干細胞接觸式共培養(yǎng)上清作用于HepG-2肝癌細胞后，在倒置熒光顯微鏡下觀察到肝癌細胞HepG-2形態(tài)學發(fā)生明顯的變化，與空白對照組正常培養(yǎng)狀態(tài)下(不加上清)的HepG-2肝癌細胞相比，實驗組腫瘤細胞數(shù)量增加緩慢，細胞形態(tài)皺縮變形，細胞核周圍多出現(xiàn)空泡，處于分裂相細胞明顯減少，部分細胞出現(xiàn)老化或者死亡跡象，并且隨著藥物濃度的增加，現(xiàn)象越明顯，細胞數(shù)量越少，并且細胞間連接少，細胞壁貼壁不牢靠，而未用上清的對照組細胞呈上皮型貼壁生長,細胞輪廓清楚,細胞間接觸緊密,胞質中無異常顆粒出現(xiàn),增殖旺盛具體見圖2，綜上可以發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)上清能對肝癌細胞的形態(tài)產生很大的影響，并且具有濃度依賴性，濃度越高，抑制效果越好。

2.3Hoechst33258熒光染色凋亡細胞形態(tài)學變化經Hoechst33342 染色后，熒光顯微鏡下觀察:對照組細胞結構清晰，細胞核飽滿，呈均勻藍色;上清組部分細胞細胞核致密濃染，固縮，細胞邊緣處伴有凋亡小體產生等細胞凋亡特征，可知干細胞上清和共培養(yǎng)上清都能促進細胞的凋亡，但是共培養(yǎng)細胞組的凋亡率明顯高于非共培養(yǎng)組，見圖3。

2.4上清對肝癌細胞侵襲、遷移的影響上清可抑制 HepG-2 細胞的遷移、侵襲，其中平均穿膜細胞數(shù)明顯低于對照組(P<0.05或P<0.01 );加上清組遷移、侵襲細胞數(shù)明顯減少(P<0.01)。見圖4、5。

2.5流式細胞術檢測細胞凋亡檢測結果顯示用流式細胞技術檢測對照組與加入20%、40%、60%、80%濃度上清對人肝癌細胞株作用48 h后細胞的凋亡情況，對照組凋亡率為0.44%，四個用藥組凋亡率分別為5.85%、11.08%、18.27%和20.9%，與對照組檢測結果比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，細胞早期凋亡率明顯高于對照組(P<0.01)，而上清對L02細胞無明顯的抑制作用，見圖6。

3討論

肝細胞肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC) 是世界五大惡性腫瘤之一，嚴重威脅人類健康。目前，癌癥的治療方法主要有以下幾種：手術切除、放療、化療、中醫(yī)中藥治療?？傮w而言這些方法的效果不太令人滿意 。腫瘤的發(fā)生，一是由基因決定，二是取決于機體的免疫功能，免疫力下降或者免疫功能失調可能會導致腫瘤的發(fā)生，所以通過提高機體免疫功能來發(fā)揮抗癌作用成為新的抗癌藥物的研究方向，同時，正常成人免疫功能早已定型，刺激正常人提高其免疫力是很困難的，故尋求有生命活力的干細胞及其受腫瘤細胞刺激產生的有效抗癌因子和免疫因子是很有意義的。近年來，作為惡性腫瘤第四種治療模式的生物治療研究得到蓬勃發(fā)展，取得了一系列可喜的成果，該領域的飛速發(fā)展為腫瘤治療提供了新希望。它的優(yōu)勢在于靶向性強，特異性高，效果確切，毒副作用小，遠期抗癌效果好。胚胎干細胞是目前所知最全能的細胞，具有自我更新和多向分化的潛能，各種細胞自我調節(jié)方式及信號通路表達都是正常的。它與腫瘤細胞在某些調節(jié)信號上是相交叉的，鑒于此，我們猜想這種正常生長發(fā)育的胚胎干細胞在與腫瘤細胞作用過程中可以控制腫瘤細胞的生長，逆轉其惡性的生物學活性。細胞凋亡是指為維持內環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡。細胞凋亡是為更好地適應生存環(huán)境而爭取的一種死亡過程，具有重要的生物學意義及復雜的分子生物學機制[16，17]。

本實驗通過在體外共培養(yǎng)胚胎干細胞和肝癌細胞，給胚胎干細胞體外直接接觸，刺激干細胞，再用這種體外作用過后的上清作用于肝癌細胞，研究對肝癌細胞增殖、侵襲遷移和凋亡的影響。從結果可以看出，不同濃度的共培養(yǎng)上清液均對HepG-2細胞的增殖有一定的抑制作用，并且40%濃度及以上的濃度能明顯促進肝癌細胞的凋亡，主要是早期和晚期凋亡，小室法也看出，上清對肝癌細胞的侵襲和遷移也具有明顯的抑制作用，同時，上清對正常的肝細胞L02無明顯的作用。胚胎干細胞與肝癌細胞HepG-2共培養(yǎng)上清能夠在體外明顯抑制肝癌細胞HepG-2的增殖、遷移和侵襲，并且促進其凋亡，并且具有濃度依賴性，共培養(yǎng)時間越長，抑制效果越好。

說明此上清具有一定的抗腫瘤效應。我們猜測，由于胚胎干細胞有全能分化的特點，肝癌細胞在體外可能刺激干細胞分泌一些免疫因子，能夠抑制肝癌細胞HepG-2的增殖、遷移和侵襲，并且促進肝癌細胞的凋亡。上清中的這些細胞因子抑制HepG-2細胞增殖、遷移和侵襲行為，進而限制腫瘤的生長、轉移并誘導細胞發(fā)生凋亡，從而達到治療腫瘤的目的。由于抗腫瘤作用機制一般具有多途徑、多靶點的特點，故其具體的作用機制有待進一步探討。同時，上清中具體有哪些免疫成分，都有待下一步研究。這種生物治療和從免疫的角度來治療腫瘤，具有很大的研究意義，可能為腫瘤的治療帶來新的希望。

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[收稿2015-08-05修回2015-08-14]

(編輯倪鵬)

Research H9 and HepG-2 in vitro co-culture supernatants affect HepG-2 proliferation,migration and apoptosis

HEXue-Mei,ZHENGLiang-Dong,ZHANGTing,LIUMeng-Nan,FENGTao.ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400000,China

[Abstract]Objective:To explore the influence of co-culture supernatant from embryonic stem cell H9 and hepatoma cell line HepG-2 on the proliferation,migration and apoptosis of hepatoma cell HepG-2.Methods: We conducted in virto co-culture of H9 and HepG-2,then obtained supernatants in 12 h,24 h,36 h and 48 h and let supernatants of different concentration,namely 20%,40%,60% and 80% to act on HepG-2 cells.We observed growth condition and morphological changes of the cells under an inverted fluorescence microscope.MTS method was employed to evaluate proliferation conditon of HepG-2 cells in 24 h and 48 h since supernatants of varied concentrations had been added.We applied flow cytometry to show the apoptosis of cells.We also detected apoptosis of cells using Hochest33258 chromosome.We probed influence of supernatants on migration of cells.Results: Co-culture supernatants of varied concentration all had inhibitive effect on proliferation of HepG-2 cells.Supernatants of concentrations higher than 40% promoted apoptosis, particularly early and late apoptosis of HepG-2 cells rather notably.Chamber method also revealed the supernatant′s inhibition to invasion and migration of HepG-2 cells,and it had no conspicuous effects on normal hepatocyte L02.Conclusion: Co-culture supernatant of embryonic stem cells and hepatoma cell HepG-2 significantly inhibits the proliferation,migration and invasion of hepatoma cell HepG-2 in virto while promoting its apoptosis.Its effectiveness is concentration-dependent and increases over time.These results prove the anti-tumor effectiveness of this supernatant.

[Key words]Co-culture supernatants;Hepatoma cell HepG-2;Embryonic stem cell H9;Cell proliferation;Apoptosis

通訊作者及指導教師：馮濤(1963年-)，男，碩士，教授，博士生導師，主要從事基因工程、腫瘤發(fā)病機理及基因治療方面研究。

作者簡介：何雪梅(1989年-)，女，碩士，主要從事生物化學與分子生物學方面研究，E-mail:609875364@qq.com。

中圖分類號R3
①本文為國家自然科學基金面上項目(No.81071770，81201679)。

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)02-0154-06

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.02.002 10.3969/j.issn.1000-484X.2016.02.003