·中醫(yī)中藥與免疫·

王海鳳　郭　兵　馬旭平　薛瑞辰

(河北北方學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，張家口075000 )

大黃水提取物對(duì)妊娠早期孕鼠生殖毒性作用及其機(jī)理的初步研究①

·中醫(yī)中藥與免疫·

王海鳳郭兵馬旭平薛瑞辰

(河北北方學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，張家口075000 )

[摘要]目的：本試驗(yàn)觀察大黃水提取物對(duì)妊娠早期小鼠的生殖毒性作用并初步探討其作用機(jī)理。方法：給妊娠第3天小鼠連續(xù)5 d天灌服不同劑量(7、5、2.5 g/kg)大黃水提取物，對(duì)照組灌服0.9%生理鹽水，各組于孕第12采血處死小鼠。放射免疫技術(shù)測定血清中雌二醇和孕酮水平；ELISA檢測子宮組織勻漿中IFN-γ，IL-2和TNF-α含量，石蠟切片后免疫組織化學(xué)染色法檢測子宮內(nèi)膜巨噬細(xì)胞數(shù)量，甲苯胺藍(lán)染色法檢測子宮內(nèi)膜肥大細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果：隨著大黃水提取物劑量的增加，小鼠的流產(chǎn)率逐漸上升，7 g/kg處理組小鼠100%流產(chǎn)。雌激素和孕激素含量呈下降趨勢，細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α、IL-2含量不同程度增加，肥大細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著增加 (P<0.05)。結(jié)論：大黃水提取物不僅由于其瀉泄作用干擾孕鼠妊娠狀態(tài)的穩(wěn)定性，而且可直接影響早期胚胎發(fā)育的子宮內(nèi)膜環(huán)境，從而導(dǎo)致流產(chǎn)。

[關(guān)鍵詞]大黃水提取物；生殖毒性；妊娠小鼠；激素；細(xì)胞因子；免疫細(xì)胞

大黃屬中藥瀉下藥，始載于我國現(xiàn)存最早的藥學(xué)專著《神農(nóng)本草經(jīng)》,為我國四大最常用的中藥之一。2002年版《中藥及其制劑不良反應(yīng)大典》與《中藥現(xiàn)代研究與應(yīng)用》等均有記載,不同品質(zhì)的大黃對(duì)胃腸道、生殖系統(tǒng)和血液系統(tǒng)等有不同程度的毒性。饒曉黎等[1]研究認(rèn)為，大黃的下瀉作用常常造成妊娠個(gè)體的流產(chǎn)，隨劑量增大，大黃組的孕鼠流產(chǎn)率明顯升高，對(duì)子宮內(nèi)膜的微細(xì)結(jié)構(gòu)影響增大。楊守業(yè)等[2]也研究報(bào)道大黃藥物毒性可致妊娠大鼠流產(chǎn)。以往研究發(fā)現(xiàn)大黃具有胚胎毒性，但是大黃發(fā)揮生殖毒性的作用機(jī)理目前尚沒有明確的定論。本研究在驗(yàn)證大黃致流產(chǎn)作用的基礎(chǔ)上對(duì)孕鼠子宮細(xì)胞因子含量和免疫細(xì)胞數(shù)量以及血清中激素水平進(jìn)行觀察，揭示大黃在細(xì)胞和分子水平的致流產(chǎn)作用機(jī)制，為大黃的臨床安全應(yīng)用提供了參考依據(jù)，也可完善大黃的藥理作用研究。

1材料與方法

1.1材料大黃的干燥根莖，粉碎為粗粉，10倍水浸泡兩次，合并提取液，過濾，40℃減壓濃縮至生藥量含量為0.4 g/ml備用。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用7～8周齡成熟健康未經(jīng)產(chǎn)昆明小鼠(購于河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，常規(guī)飼養(yǎng)，自由采食飲水。按雌雄2∶1的比例合籠過夜，次日清晨檢出陰栓者定為受孕第0天。小鼠IL-2、IFN-γ、TNF-α、ELISA試劑盒(北京嘉美生物公司)，雌二醇孕酮放射免疫試劑盒(上海瑞齊生物技術(shù)有限公司)；大鼠抗小鼠 F4/80巨噬細(xì)胞單克隆抗體，eBioscience產(chǎn)品；滑走切片機(jī)(08-230-2C，ERMA INC.TOKYO.JAPAN)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組與處理大黃水提取物半數(shù)致死量(LD50)的測定，用健康昆明小鼠60只(30~33 g)，雌雄各半，隨機(jī)分為6個(gè)劑量組，灌胃給藥，觀察7天，記錄不同劑量小鼠死亡數(shù)，計(jì)算半數(shù)致死量。

以LD50預(yù)實(shí)驗(yàn)為依據(jù)，把配種后的孕鼠隨機(jī)分為4組(3個(gè)處理組，1個(gè)對(duì)照組)，每組12只。給藥組于孕第3天開始，每天同一時(shí)間灌服一次大黃水提取物，連續(xù)5 d。大黃水提取物的劑量為7、5、2.5 g/kg，對(duì)照組灌服0.9%生理鹽水。每天按實(shí)際體重調(diào)整大黃水提取物的注射灌服劑量。每天給藥后注意觀察孕鼠有無異常情況，所有小鼠于孕第12天分別稱重后眼球采血，分離血清，放射免疫方法測定血清中雌二醇，孕酮水平；頸椎脫臼處死小鼠，檢查胚胎著床結(jié)果并記錄活胚數(shù)和胚胎總數(shù)。取左側(cè)子宮冰浴環(huán)境進(jìn)行組織勻漿，勻漿液4℃，12 000 r/min，離心15 min，取上清液-40℃?zhèn)浯?，根?jù)抗原抗體特異性結(jié)合的性質(zhì)，選用種屬特異性的酶聯(lián)免疫分析試劑盒測定子宮組織勻漿液中細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α的含量：按照試劑盒說明書操作，試劑盒反應(yīng)終止后，在酶標(biāo)儀上450 nm波長下讀取吸光度(Optical density，OD)值，利用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，據(jù)此各標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞因子IL-2，IFN-γ和TNF-α含量。右側(cè)子宮置Bouin′s液中固定48 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，Paraplast包埋，制5 μm組織切片，應(yīng)用SP法對(duì)小孕鼠子宮巨噬細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，甲苯胺藍(lán)染色法檢測子宮內(nèi)膜肥大細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞計(jì)數(shù)于光鏡下(10×40倍)對(duì)每組5例(對(duì)照組3例)的縱切切片隨機(jī)順序取20個(gè)視野，對(duì)陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),計(jì)算每個(gè)視野中細(xì)胞的平均個(gè)數(shù)。

免疫組織化學(xué)染色主要步驟：①切片脫蠟入水，3%H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶，PBS(pH7.4，下同)洗?？乖瓱嵝迯?fù)12 min。②10%封閉用正常山羊血清室溫孵育30 min。③滴加F4/80巨噬細(xì)胞單克隆抗體，4℃過夜，PBS洗(5 min×3，下同)。④滴加生物素化兔抗大鼠IgG (1:50)，37℃孵育30 min。PBS洗。⑤滴加辣根酶標(biāo)記鏈親合素工作液，37℃孵育30 min。PBS洗。⑥ DAB顯色，常規(guī)脫水，透明，封片。

1.2.2指標(biāo)測定放射免疫方法測定血清中雌二醇，孕酮水平；ELISA檢測子宮組織勻漿中細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α含量；石蠟組織切片后免疫組織化學(xué)染色法檢測子宮內(nèi)膜巨噬細(xì)胞數(shù)量，甲苯胺藍(lán)染色法檢測子宮內(nèi)膜肥大細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞計(jì)數(shù)于光鏡下(10×40倍)對(duì)每組5例(對(duì)照組3例)的縱切切片隨機(jī)順序取20個(gè)視野，對(duì)陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),計(jì)算每個(gè)視野中細(xì)胞的平均個(gè)數(shù)。

1.2.3實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，按組平均計(jì)算各項(xiàng)觀測值。

2結(jié)果

2.1大黃水提取物 LD50 預(yù)試驗(yàn)結(jié)果由表1應(yīng)用概率單位法計(jì)算可得：大黃水提取物L(fēng)D50為 8.68 g/kg,95 %可信區(qū)間為 7.16～10.2 g/kg。以此為依據(jù)確定試驗(yàn)的劑量。

表1大黃水提取物L(fēng)D50 測定結(jié)果

Tab.1Rhubarb extract LD50 test in mice

Note：In the same column,values with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05),while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05),and with different capital letter superscripts mean significant difference (P>0.01).The same as below.

2.2各組妊娠結(jié)局比較從表2可見，與對(duì)照組相比，大黃水提取物各處理組妊娠小鼠的體重均下降，子宮和陰道出血，表現(xiàn)出不同程度的中毒癥狀。這些現(xiàn)象隨處理劑量的增加而加重。

表2不同劑量大黃水提取物致流產(chǎn)效果

Tab.2Abortion effects on mice in different doses of Rhubarb extract

Note：In the same column,values with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05),while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05),and with different capital letter superscripts mean significant difference (P>0.01).The same as below.

根據(jù)公式(流產(chǎn)率=發(fā)生流產(chǎn)的母鼠數(shù)/試驗(yàn)組母鼠總數(shù)×100%)計(jì)算各組孕鼠的流產(chǎn)率，隨著劑量的增大，流產(chǎn)率逐漸增加。小劑量也能導(dǎo)致孕鼠流產(chǎn)。7 g/kg處理組小鼠全部發(fā)生流產(chǎn)，剖檢發(fā)現(xiàn)胚胎死亡率100 %，并開始融化，子宮淤血嚴(yán)重，胎盤結(jié)構(gòu)被破壞。5 g/kg處理組胚胎吸收率17.36%。2.5 g/kg組僅有少量小鼠陰道有微量出血，并且出血時(shí)間分別較7 g/kg處理組推遲，胚胎吸收率為9.37%，生理鹽水組無顯性流產(chǎn)現(xiàn)象，胚胎呈粉紅色，胎膜及胚胎輪廓清晰，透光度好，子宮無出血、瘀血現(xiàn)象。

2.3血清中激素水平的測定與對(duì)照組相比，大黃水提取物處理組小鼠雌激素和孕激素含量呈下降趨勢，且劑量越大，激素水平越低。其中7 g/kg大黃水提取物處理組孕鼠孕激素水平降低更明顯(P<0.01)，見表3。

表3小鼠血清雌二醇和孕酮的測定 (n=12)

Tab.3Detection of estrogen and progesterone contents in serm(n=12)

Note：In the same column,values with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05),while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05),and with different capital letter superscripts mean significant difference (P>0.01).The same as below.

2.4子宮組織勻漿中細(xì)胞因子含量的測定圖1顯示，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品已知系列濃度溶液的吸光度測定值作標(biāo)準(zhǔn)曲線，IFN-γ、IL-2和TNF-α含量標(biāo)準(zhǔn)曲線幾乎為直線，R2均大于0.980 0，符合線性關(guān)系，可以由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算小鼠子宮組織勻漿中的IFN-γ、IL-2和TNF-α含量。

由表4可知，與對(duì)照組比較，不同劑量大黃水提取物組對(duì)細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α含量都有顯著的促進(jìn)作用，差異顯著(P<0.01或P<0.05)。隨著用藥劑量的增加，IFN-γ和TNF-α、IL-2含量也隨之升高，IL-2水平變化不明顯。

表4子宮組織勻漿中細(xì)胞因子的變化(n=12)

Tab.4Changes of cytokines contents in uterine tissue homogenates(n=12)

Note：In the same column,values with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05),while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05),and with different capital letter superscripts mean significant difference (P>0.01).The same as below.

2.5巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞子宮的分布數(shù)量測定子宮切片上可見肥大細(xì)胞主要分布于肌層內(nèi)，子宮內(nèi)膜極少，肥大細(xì)胞呈圓形、橢圓形、長梭形，胞核為淡藍(lán)色，胞質(zhì)內(nèi)充滿紫紅色顆粒。有些細(xì)胞顆粒不易分辨，只見紫紅色的胞質(zhì)。由表5可見，7 g/kg和5 g/kg處理組的子宮肥大細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組顯著增多(P<0.05)；其中7 g/kg處理組小鼠子宮肥大細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組增加60.87%，差異極顯著(P<0.01)，2.5 g/kg處理組小鼠子宮肥大細(xì)胞數(shù)量變化不太明顯。

在顯微鏡下觀察，對(duì)照組小鼠子宮內(nèi)膜中巨噬細(xì)胞數(shù)量很少，每個(gè)子宮斷面只見極少的幾個(gè)陽性細(xì)胞，大黃水提取物處理組巨噬細(xì)胞數(shù)量保持著較高的水平，而且隨著大黃灌服劑量的增加巨噬細(xì)胞數(shù)量逐漸上升，7 g/kg和5 g/kg處理組與對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01)，其中7g/kg處理組小鼠子宮內(nèi)膜巨噬細(xì)胞數(shù)量是對(duì)照組的4.42倍，見表5和圖2、3。

表5小鼠子宮肥大細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量的變化

Tab.5Changes of mast cells and macrophages in mouse uterine

3討論

藥理學(xué)研究表明大黃有一定的毒性。劉夢杰等研究發(fā)現(xiàn)[3]，大黃水提取物對(duì)幼年雌性大鼠的卵巢功能具有一定的毒性，其影響程度和用藥劑量成正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果顯示：隨著大黃劑量的增加，實(shí)驗(yàn)孕鼠的流產(chǎn)率呈明顯升高的趨勢，可能是大黃的致瀉作用所致。腹瀉必然引起全身精神狀況不佳，從而受孕率降低，流產(chǎn)率和死胎率升高，與以往饒曉黎和楊守業(yè)等人報(bào)道的大黃藥物毒性致妊娠大鼠流產(chǎn)的作用相符。

子宮是胚胎發(fā)育的重要場所，胚胎著床需要雌激素、孕激素的相互協(xié)調(diào)作用[4]。雌激素誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜增生，為卵泡著床奠定基礎(chǔ)；當(dāng)囊胚植入子宮內(nèi)膜時(shí)，孕激素促使增生的子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)變?yōu)橥懩?，促進(jìn)卵泡順利著床，同時(shí)，孕激素可降低子宮興奮性和對(duì)催產(chǎn)素的敏感性，有安胎作用[5，6]。本研究顯示，與對(duì)照組相比，各大黃給藥組均影響小鼠孕激素的正常生理水平，故容易引起流產(chǎn)，同時(shí)，隨著藥物濃度的升高，雌激素水平明顯下降，從而對(duì)著床產(chǎn)生不利影響。雌激素和孕激素水平的下降再次提示黃體和胎盤對(duì)維持正常妊娠有重要作用。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，孕鼠灌服大黃水提取物后,在導(dǎo)致流產(chǎn)的同時(shí),IFN-γ、IL-2和TNF-α含量均不同程度升高，且具有量效關(guān)系。TNF-α對(duì)生殖過程有重要影響，在小鼠懷孕期被嚴(yán)格控制著。母胎界面組織中一旦存在某種因素使TNF-α表達(dá)增加，則可誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡，直接損傷胎盤或促進(jìn)胎盤血管血栓形成，造成胎兒供血系統(tǒng)栓塞、壞死[7]。IFN-γ可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化生成一氧化氮(NO)和TNF-α，抑制滋養(yǎng)細(xì)胞生長，與TNF-α協(xié)同作用致NK細(xì)胞活化浸潤，并增強(qiáng)TNF-α激活的滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡。超生理劑量的IFN-γ會(huì)直接導(dǎo)致流產(chǎn)，因此又稱它為流產(chǎn)誘導(dǎo)因子。IL-2主要通過誘導(dǎo)T細(xì)胞和NK細(xì)胞活化和增殖，分泌IFN-γ干擾鼠類胚胎發(fā)育、著床和滋養(yǎng)層的生長[8]。Chouat等[9]早在1990年就發(fā)現(xiàn)，當(dāng)把IL-2、IFN-γ和TNF-α注射給懷孕母鼠時(shí),會(huì)導(dǎo)致妊娠終止。本研究結(jié)果也證實(shí)IFN-γ，TNF-α和IL-2含量與流產(chǎn)有密切關(guān)系，即Th1類細(xì)胞因子的升高導(dǎo)致流產(chǎn)率的上升。說明大黃的作用不僅由于其瀉泄作用干擾孕鼠妊娠狀態(tài)的穩(wěn)定性，從而引起流產(chǎn)甚至死胎。而且由于對(duì)子宮中細(xì)胞因子有損害，可能直接影響早期胚胎發(fā)育的環(huán)境。

子宮中肥大細(xì)胞數(shù)量是衡量子宮局部細(xì)胞免疫水平的指標(biāo)之一，較外周血T細(xì)胞的數(shù)量指標(biāo)更精確，可直接反映子宮局部細(xì)胞免疫水平的變化[10,11]。肥大細(xì)胞是不利于妊娠的細(xì)胞之一，自然流產(chǎn)大鼠子宮內(nèi)肥大細(xì)胞數(shù)量顯著增多，認(rèn)為肥大細(xì)胞釋放TNF-α等是導(dǎo)致流產(chǎn)的原因之一[12]。本研究發(fā)現(xiàn)大黃水提取物處理組小鼠子宮內(nèi)膜肥大細(xì)胞數(shù)量顯著增多，從而分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等Th1型細(xì)胞因子，導(dǎo)致流產(chǎn)。

巨噬細(xì)胞是母胎界面主要的免疫細(xì)胞之一，巨噬細(xì)胞過度表達(dá)，可使TNF-α和NO的分泌量增加，從而對(duì)胚胎產(chǎn)生毒性作用，導(dǎo)致流產(chǎn)[13,14]。本研究中大黃水提取物組孕鼠子宮組織中巨噬細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組明顯增多，并且多分布于子宮內(nèi)膜。推測孕鼠灌服大黃水提取物后，首先激活NK細(xì)胞，使子宮中IFN-γ含量升高，巨噬細(xì)胞受干擾素-γ刺激預(yù)致敏后，產(chǎn)生高濃度TNF-α，TNF-α擴(kuò)大單核/巨噬細(xì)胞前體細(xì)胞的分化，使巨噬細(xì)胞數(shù)量增加，并且可激活巨噬細(xì)胞中的一氧化氮合成酶(NOS)，增加NO生成量，NO再激活巨噬細(xì)胞。TNF-α和NO共同作用，可殺傷內(nèi)皮細(xì)胞，抑制蛻膜血管的形成，造成缺血、出血、血栓形成、壞死，最終導(dǎo)致胚胎的供血減少，導(dǎo)致胚胎丟失[15,16]。

4結(jié)論

大黃水提取物不僅由于其瀉泄作用干擾孕鼠妊娠狀態(tài)的穩(wěn)定性引起孕鼠流產(chǎn)，而且通過降低雌激素和孕激素含量、增加Th1類細(xì)胞因子(IFN-γ、TNF-α和IL-2)含量以及肥大細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量，從而影響早期胚胎發(fā)育的子宮內(nèi)膜環(huán)境，導(dǎo)致流產(chǎn)率上升。

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[收稿2015-07-20修回2015-09-22]

(編輯許四平)

Reproductive toxicity study of rhubarb extract on early pregnancy mice and its preliminary mechanism

WANGHai-Feng,GUOBing,MAXu-Ping，XUERui-Chen.CollegeofAnimalScienceandTechnology,HeBeiNorthUniversity,Zhangjiakou075000，China

[Abstract]Objective:To explore the abortion effect and mechanism induced by Chinese herbal medicine rhubarb extract.Methods: The pregnant mice at day 3 of gestation were Drenched by Aqueous extract of rhubarb at different doses (7，5，2.5 g/kg)once per day for five days,and mices in control group were oral administration of same volume of saline.All mices at 12 day of gestation were sacrificed.estradiol and progesterone levels in serum were detected by Radioimmunoassay;Content of IFN-γ，IL-2 and TNF-α in uterine lysates were measured by ELISA,macrophages in endometrium were determined by immunohistochemical method,mast cells in endometrium were tested by Toluidine blue staining,respectively.Results: showed as follows:With increasing dose of rhubarb extract,abortion rate and resorption rate were gradually increased and was 100% abortion in 7g/kg treatment groups.Estrogen and progesterone content showed a downward trend,IFN-γ，IL-2 and TNF-α in uterine lysates and the numbers of macrophages and mast cells were significantly higher in mices Drenched by Aqueous extract of rhubarb than in the control.Conclusion: These results show that rhubarb extract not only interfere stability of pregnancy state in pregnant mices because of its diarrhea,but also can directly affect endometrial environment in early embryonic mice,Resulting in abortion.

[Key words]Rhubarb extract;Reproductive toxicity;Pregnant mice;Hormone;Cytokines;Immune cells

作者簡介：王海鳳(1983年-)，女，碩士，助理研究員，主要從事中藥藥理方面研究，E-mail:whf831102@126.com。

中圖分類號(hào)R967
①本文為河北北方學(xué)院青年基金項(xiàng)目(Q2014016)。

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)02-0184-05