方海瑞　蔣紅群　徐芳潔　侯　雋　董　丹　陳聰哲　吳向未　陳雪玲

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，石河子832002)

原頭蚴對體外培養(yǎng)小鼠脾細(xì)胞中Th細(xì)胞亞群的影響①

方海瑞蔣紅群徐芳潔侯雋董丹陳聰哲吳向未②陳雪玲

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，石河子832002)

[摘要]目的：觀察原頭蚴對體外培養(yǎng)小鼠脾細(xì)胞中Th細(xì)胞亞群及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的影響。方法：BALB/c小鼠脾細(xì)胞與原頭蚴共培養(yǎng)，用ELISA檢測上清液IL-4、IFN-γ、TGF-β含量；同時(shí)收集細(xì)胞用FCM檢測Th細(xì)胞亞群。結(jié)果：ELISA檢測不同感染時(shí)間原頭蚴組IL-4、TGF-β分泌均增加，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；FCM檢測原頭蚴組不同時(shí)間點(diǎn)Th2、Treg細(xì)胞的比例，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但Th1細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：原頭蚴能刺激體外培養(yǎng)的小鼠脾細(xì)胞向Th2、Treg細(xì)胞分化且上調(diào)相應(yīng)細(xì)胞因子的分泌，提示這些亞群細(xì)胞可能在包蟲病感染的免疫逃逸中發(fā)揮一定作用。

[關(guān)鍵詞]原頭蚴；脾細(xì)胞；Th細(xì)胞

包蟲病或稱棘球蚴病(Hydatid disease)，由細(xì)粒棘球絳蟲幼蟲(也稱棘球蚴或包蟲) 寄生在人畜體內(nèi)而引發(fā)的是一種人畜共患寄生蟲病，主要分布于牧區(qū)[1]。以細(xì)粒棘球蚴引起的囊型包蟲病多見。細(xì)粒棘球蚴長期寄生于宿主體內(nèi)，對宿主造成不同程度的傷害[2]。其次，當(dāng)包囊意外破裂，部分原頭節(jié)可能進(jìn)入組織內(nèi)，造成再次感染，給包蟲病的治療帶來很大困難[3]。蟲體之所以能在宿主體內(nèi)長期生存，有賴于對宿主的免疫逃避功能。目前關(guān)于蟲體免疫逃逸的研究集中在臨床體內(nèi)患者觀察或者試驗(yàn)研究，IL-2 及 IL-4、IL-10等Th1/Th2 細(xì)胞因子的表達(dá)量變化，進(jìn)而提示 Th1/Th2 的平衡應(yīng)答模式改變可能產(chǎn)生的免疫逃避方式[4]。本研究通過在體外利用小鼠脾細(xì)胞和細(xì)粒棘球蚴原頭蚴共培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀檢測 Th細(xì)胞比例及ELISA檢測培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子含量的變化，探討體外原頭蚴對小鼠 Th2、Th1、Treg細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子的影響，為進(jìn)一步闡明包蟲病早期免疫逃逸提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料雌性 BALB/c 小鼠，6 ～ 8 周，購自新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2主要試劑和儀器RPMI1640 培養(yǎng)基，胎牛血清(FBS) 均購自 Hyclione 公司；流式抗體 CD3-FITC、CD4-PE、IL-4-APC、IFN-γ-APC、Foxp3- eFluor660均購自ebioscience 公司； IL-4、IFN-γ 、TGF-β酶聯(lián)免疫法(ELISA法)試劑盒購自中國達(dá)科為公司。破膜劑、固定劑均購自美國eBioscience 公司；佛波酯 (PMA)、離子霉素 (Inomycin)、莫能霉素(Monensin)、BFA購自北京聯(lián)科公司；小鼠淋巴細(xì)胞分離液購自Solarbio 公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)粒棘球蚴原頭蚴的制備從感染細(xì)粒棘球蚴病的羊肝上無菌抽取無鈣化、無感染、完整的單囊型細(xì)粒棘球蚴包囊內(nèi)容物，置于無菌離心管內(nèi)，待原頭蚴(Protoscolex,PSC)自然沉淀后用含有100 U/ml青霉素和鏈霉素雙抗的無菌PBS(pH7.30)漂洗3次，除去育囊碎片，使其自然沉淀，經(jīng)0.5%伊紅染色5 min，在顯微鏡下鑒定具有活性的蟲體數(shù)(>90%)，用含雙抗的無菌PBS稀釋成濃度為1 000個(gè)/ml的原頭蚴懸液，備用。

1.2.2小鼠脾臟細(xì)胞分離脫頸處死小鼠，無菌摘取脾臟，用1支2.5 ml和1支1 ml注射器在含有少許PBS的小平皿中刮出脾細(xì)胞。用1 ml注射器抽吸刮出的脾細(xì)胞3～5次，使脾細(xì)胞盡量分散。向1新離心管加入3 ml小鼠淋巴細(xì)胞分離液，再將約1.5 ml脾細(xì)胞懸液緩慢加入(兩者的體積比為2∶1)，以2 000 r/min(離心半徑13 cm)離心20 min，取出中間的云絮層(淋巴細(xì)胞層)，用3 ml PBS重懸后以1 000 r/min(離心半徑13 cm)離心5 min。重復(fù)洗滌2～3次。最后將沉淀細(xì)胞懸浮于1 ml 1640培養(yǎng)基中，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，配成細(xì)胞數(shù)為2×107~3×107個(gè)/ml，備用。

1.2.3不同作用時(shí)間原頭蚴對小鼠Th子集及相關(guān)細(xì)胞因子的影響(1) 制備好的脾細(xì)胞懸液加入到6孔板里，每孔0.5 ml，再加入1 000個(gè)/ml原頭蚴0.5 ml(0.5 ml 1640為對照組)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3 個(gè)復(fù)孔;并依次加入佛波酯、離子霉素、莫能霉素，使其終質(zhì)量濃度為4 μl/m1，37℃，5% CO2培養(yǎng)，分別在12、24、36、48 h收集細(xì)胞，2 000 r/min 離心5 min，收集細(xì)胞，PBS 洗滌2遍，之后加入流式表面抗體孵育30 min，隨后細(xì)胞固定、破膜、胞內(nèi)染色，用于流式細(xì)胞儀檢測 Th細(xì)胞亞群變化。(2)制備好的脾細(xì)胞懸液加入到6孔板里，每孔0.5 ml，再加入1 000個(gè)/ml原頭蚴0.5 ml(0.5 ml 1640為對照組)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，各孔加入ConA，使每孔的ConA 濃度為10 μg/ml。分別在12、24、36、48 h后離心收集上清液。

1.2.4ELISA 檢測上清液中相關(guān)細(xì)胞因子的含量 按ELISA試劑盒說明書操作。

2結(jié)果

2.1原頭蚴與小鼠脾細(xì)胞共培養(yǎng)，不同時(shí)間點(diǎn)Th2細(xì)胞數(shù)量增加通過流式細(xì)胞儀檢測CD4+IL-4+細(xì)胞的比例，結(jié)果顯示，在24、36、48 h實(shí)驗(yàn)組和對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.2原頭蚴與小鼠脾細(xì)胞共培養(yǎng)，不同時(shí)間點(diǎn)CD4+Foxp3+細(xì)胞數(shù)量增加通過流式細(xì)胞儀檢測CD4+Foxp3+細(xì)胞的比例，結(jié)果顯示，在24、36、48 h實(shí)驗(yàn)組和對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

2.3原頭蚴與小鼠脾細(xì)胞共培養(yǎng)，不同時(shí)間點(diǎn)Th1細(xì)胞數(shù)量無改變通過流式細(xì)胞儀檢測CD4+IFN-γ+細(xì)胞的比例，結(jié)果顯示隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長，Th1細(xì)胞的比例在實(shí)驗(yàn)組和對照組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

2.4原頭蚴與小鼠脾細(xì)胞共培養(yǎng)，細(xì)胞因子IL-4升高、IFN-γ先升后降采用 ELISA 法檢測小鼠脾臟細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4 、IFN-γ濃度，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加上清液中IL-4的濃度是增加的，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組和對照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而IFN-γ的濃度是先增高在下降，實(shí)驗(yàn)組和對照組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

2.5原頭蚴與小鼠脾細(xì)胞共培養(yǎng)，細(xì)胞因子TGF-β升高采用 ELISA 法檢測小鼠脾臟細(xì)胞培養(yǎng)上清中TGF-β濃度，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加其上清液的濃度是增加的，實(shí)驗(yàn)組和對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(P<0.05)。見圖5。

3討論

宿主抗細(xì)粒棘球蚴感染的免疫應(yīng)答是一個(gè)復(fù)雜的進(jìn)程，T 淋巴細(xì)胞在細(xì)粒棘球蚴與宿主關(guān)系上發(fā)揮著重要作用[5，6]。不同的抗原進(jìn)入機(jī)體優(yōu)先激活的Th細(xì)胞不同,其直接決定了機(jī)體對抗原免疫應(yīng)答的方向和結(jié)果[7]。棘球蚴病的免疫是免疫保護(hù)和免疫損傷并存的機(jī)制,其中以細(xì)胞免疫造成的保護(hù)和傷害為主[8]。因此Th細(xì)胞作為免疫應(yīng)答最重要的調(diào)節(jié)細(xì)胞,在機(jī)體的抗蟲免疫中起著極為關(guān)鍵的作用。本研究通過FCM檢測了體外共培養(yǎng)脾細(xì)胞和原頭蚴后，Th1、Th2、Treg細(xì)胞以及相關(guān)細(xì)胞因子在細(xì)粒棘球蚴感染中的表達(dá)。通過FCM可以看出Th1細(xì)胞數(shù)量沒有變化，其實(shí)驗(yàn)組的數(shù)量高于對照組但是沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，培養(yǎng)的上清液中IFN-γ水平先升后降，可能是一開始原頭蚴和脾細(xì)胞接觸刺激了IFN-γ的產(chǎn)生，抑制原頭蚴的生長，但隨著刺激時(shí)間的延長，IL-4分泌增加，可能抑制了IFN-γ的產(chǎn)生，使之?dāng)?shù)量減少，促使了蟲體的免疫逃逸。

Treg細(xì)胞是一種具有免疫調(diào)節(jié)功能的CD4+T 細(xì)胞，在維持機(jī)體內(nèi)外的免疫耐受方面有著重要的作用。CD4+CD25+Foxp3+是研究較為成熟的 Treg 細(xì)胞表型標(biāo)記，F(xiàn)oxp3 是其最特異性的轉(zhuǎn)錄因子，對 Treg 細(xì)胞分化成熟和功能的發(fā)揮具有重要意義[9]。在本實(shí)驗(yàn)中我們用FCM檢測了CD4+Foxp3+的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，其含量是增加的，說明可能CD4+Foxp3+細(xì)胞在體外棘球蚴感染中可以減弱及抑制脾細(xì)胞分泌IFN-γ，對蟲體有一定的保護(hù)作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示感染后，Treg細(xì)胞、Th2細(xì)胞和細(xì)胞因子IL-4水平均隨著感染時(shí)間的增加而上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示感染時(shí)間對 T細(xì)胞亞群變化及其細(xì)胞因子的產(chǎn)生有一定的影響，但影響程度有限。本實(shí)驗(yàn)我們檢測了CD4+Foxp3、Th1和Th2細(xì)胞在體外不同時(shí)間點(diǎn)的分布表達(dá)量，三者之間的聯(lián)系有待進(jìn)一步的研究，同時(shí)三個(gè)亞群細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的量也有所差異。

本實(shí)驗(yàn)通過FCM體外檢測不同時(shí)間點(diǎn)脾細(xì)胞與原頭蚴共培養(yǎng)后Th細(xì)胞亞群的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)隨著感染時(shí)間的增加，Th2細(xì)胞和Treg細(xì)胞的比例有所增加，這些亞群細(xì)胞可能在原頭蚴免疫逃逸中有一定的聯(lián)系。吐爾洪江等[10]在血清分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，包蟲病組Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-10和TGF-β顯著高于健康對照組,提示包蟲感染可能通過刺激 Treg細(xì)胞加強(qiáng)對宿主的免疫抑制作用。我們通過用ELISA檢測上清液中細(xì)胞因子水平發(fā)現(xiàn)，IL-4以及TGF-β都有增加的趨勢，原頭蚴促進(jìn)脾細(xì)胞TGF-β的表達(dá)，可能通過抑制淋巴細(xì)胞的免疫功能，發(fā)揮對宿主的免疫逃避作用[11]。有研究結(jié)果顯示IL-4/IL-10可以削弱Th1細(xì)胞的保護(hù)性免疫應(yīng)答從而使原頭蚴可以在宿主體內(nèi)存活[12-14]。在本研究中細(xì)胞因子IL-4、IL-10的水平增加，可能符合這一觀點(diǎn)，此外還可以 表明在原頭蚴感染期間可能有多種細(xì)胞因子參與了調(diào)節(jié)，但其具體作用需要進(jìn)一步的研究。TGF-β具有雙重作用，生物活性復(fù)雜多樣，既可通過介導(dǎo)免疫應(yīng)答發(fā)揮抗寄生蟲作用，引起宿主一系列病理損傷，也可使機(jī)體處于免疫抑制狀態(tài)，有助于寄生蟲逃避宿主的攻擊[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與TGF-β在血吸蟲中的表達(dá)趨勢相一致，都是為了提高TGF-β的表達(dá)量以逃避宿主的免疫應(yīng)答，TGF-β在Th細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子的分化表達(dá)中扮演不同的作用，在本實(shí)驗(yàn)中TGF-β可能聯(lián)合IL-4抑制了IFN-γ的產(chǎn)生，促進(jìn)了蟲體在體外的存活。

細(xì)粒棘球蚴的免疫病理是多種細(xì)胞及多種細(xì)胞因子相互作用、相互調(diào)節(jié)的結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)對進(jìn)一步深入研究細(xì)粒棘球蚴的免疫逃逸奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Carmena D，Sanchez-Serrano LP,Barbero-Martinez I.Echinococc-usgranulosus infection in Spain[J].Zoonoses Public Health,2008,55(3):156-165.

[2]Zhang WB,Wen H,Li J,etal.Immunology and Immunodiagnoisis of cystic echinococcosis:an update[J].Clin Dev Immunol,2012：101895.

[3]Baz A,Ettlin GM,Dematteis S.Complexity and function of cytokine responses in experimental infection by Echinococcus granulosus[J].Immunobiology,2006,211(1/2):3-9.

[4]Jankovic D,Liu Z,Gause WC.Th1- and Th2-cell commitment during infectious disease:asymmetry in divergent pathways[J].Trends Immunol,2001,22(8):450-457.

[5]Dai WJ,Waldvogel A,Siles-Lucas M,etal.Echinococcus multilocularis proliferation in mice and respective parasite 14-3-3 gene expression is mainly controlled by an alphabeta CD4 T-cell-mediated immune response[J].Immunology,2004,112(3):481-488.

[6]王麗婷,馬紅,賈繼東.瘦素對肝纖維化作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2006,26(1):42-45.

[7]沈蕾,張兆松.CD4+T細(xì)胞與血吸蟲感染的保護(hù)性免疫[J].中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志,2001,19(3):246-249.

[8]李富榮.細(xì)胞因子在棘球蚴感染、治療評價(jià)中的作用[J].國外醫(yī)學(xué):寄生蟲病分冊,1999,7(4):145-147.

[9]Fontenot JD,Gavin MA,Rudensky AY.Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+regulatory T cells[J].Nat Immunol,2003,4(4):330-336.

[10]吐爾洪江·吐遜,單驕宇,李濤,等.Th17細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在肝包蟲病免疫逃避中的作用[J].中華消化外科雜志,2010,9(4):283-286.

[11]陳小林,印雙紅,吳向未,等.原頭蚴及囊液促體外培養(yǎng)小鼠脾細(xì)胞TGF-β表達(dá)的研究[J].中國病原生物學(xué)雜志,2013,8(6):523-526.

[12]Vuitton DA,Gottstein B.Echinococcus multilocularis and its intermediate host:a model of parasite-host interplay[J].Biomed Biotechnol,2010,2010:923193.

[13]Chandrasekhar S,Parija SC.Serum antibody & Th2 cytokine profiles in patients with cystic echinococcosis[J].Indian J Med Res,2009,130(6):731-735.

[14]Mezioug D,Touil-Boukoffa C.Cytokine profile in human hydatidosis:possible role in the immunosurveillance of patients infected with Echinococcus granulosus[J].Parasite,2009,16(1):57-64.

[15]Zhang S,Hüe S,Sène D,etal.Expression of major histocompatibility complex class I chain-related molecule A,NKG2D,and transforming growth factor-beta in the liver of humans with alveolar echinococcosis:new actors in the tolerance to parasites?[J].J Infect Dis,2008,197(9):1341-1349.

[收稿2015-06-14修回2015-07-28]

(編輯許四平)

Effect of protoscolex on T subsets in mice spleen cells in vitro

FANGHai-Rui,JIANGHong-Qun,XUFang-Jie,HOUJun,DONGDan,CHENCong-Zhe,WUXiang-Wei,CHENXue-Ling.DepartmentofImmunologyofMedicalSchool，ShiheziUniversity，Shihezi832002，China

[Abstract]Objective:To observe the effect of protoscolex on Th subsets and correlative cytokine in mice spleen cells in vitro.Methods: Co-culture spleen cells from BALB/c mice with protoscolices,then IL-4,IFN-γ and TGF- β production in cell culture supernatants were analyzed by ELISA.The percentage of Th subsets were detected by Flow Cytometry analysis.Results: Secretion levels of IL-4 and TGF-β were significantly increased in spleen cells at different time point in co-culture system with protoscolices.Ratios of Th2 and Treg cells were also significantly increased in co-culture system at different time points than the control groups.However,there was no statistical significance for ratio of Th1 cells at different time points.Conclusion: The protoscolex can increase the ratios of Th2 cells and Treg cells from spleen cells.Secretion levels of IL-4 and TGF-β were also increased in spleen cells co-cultured with protoscolices.The results suggest that these Th cell subsets play a role in the immune escape of the hydatid disease.

[Key words]Protoscolex;Spleen cells;Th cells

通訊作者及指導(dǎo)教師：陳雪玲(1971 年-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事感染免疫方面的研究，E-mail:xuelingch@ hotmail.com。

作者簡介：方海瑞(1988年-)，女，在讀碩士，主要從事地方感染性疾病方面的研究，E-mail:fhrharry1120@163.com。

中圖分類號R383.33
①本文受國家自然科學(xué)基金(No.81260412)、國家自然科學(xué)基金(No.81360453)資助。
②石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，石河子832002。

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-484X(2016)02-0174-05