陳煦 王新力 鄒遠康 李天, 2 * 趙雄*

1. 第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院骨科，西安 710032 2. 第四軍醫(yī)大學生物醫(yī)學工程學院，西安 710032

骨質疏松癥的嚴重性僅次于心腦血管疾病和腫瘤。國內(nèi)骨質疏松癥總患病率為12.4%，老年人患病比例超過一半以上，其中，并發(fā)骨折發(fā)生率接近33%。微小RNA(miRNA)是一種廣泛存在于真核生物中，影響細胞增殖、分化、凋亡的重要分子，在腫瘤預后與基因治療、自身免疫疾病中的功能研究、心血管系統(tǒng)疾病及內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病診療上有廣泛的應用前景。在骨分化與骨再生過程中，miRNA的異常表達與骨質疏松發(fā)生的關系尤為密切，成為當今的研究熱點之一。本文將對miRNA與骨分化和骨再生相關機制做一綜述，旨在為骨質疏松癥的臨床治療提供參考。

1 miRNA調(diào)節(jié)骨分化

miRNA是一類廣泛存在于生物基因組中，由內(nèi)含子和編碼基因間隔區(qū)基因編碼、長度在20～22 nt的單鏈小分子RNA。miRNA5′端2到8位核苷酸可通過堿基互補配對靶向結合mRNA3′端多個非翻譯位點，進而發(fā)揮其生物學作用[1]。 目前，關于miRNA表達譜的分析方法有多種，如鎖核酸探針PCR，高通量測序技術和微陣列分析[2]。相關研究發(fā)現(xiàn)，Runx2和其下游分子Osterix是調(diào)節(jié)成骨細胞分化重要的特異性轉錄因子，也是miRNA作用的主要靶點，miRNA通過與它們相互作用激活或抑制骨的分化。

1.1 miRNA調(diào)控Runx2信號通路

Runx2即核心結合因子α1(core-binding factor alpha1，Cbfa1)，是對成骨細胞分化和骨質形成有重要影響的特異性轉錄因子。Runx2可促進成骨基因的表達，包括骨鈣素(osteocalcin，OCN)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、I型膠原(collagen-1，ColI)、骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)等，進而發(fā)揮相應的生物學效應。研究發(fā)現(xiàn)，65%～80%鎖骨或顱骨發(fā)育不全的人存在不同程度的Runx2突變[3]，Runx2基因敲除小鼠成骨細胞發(fā)育受阻，骨骼發(fā)育不良或缺如[4]。這些表明Runx2參與骨代謝的一些信號通路，在骨生長發(fā)育過程中具有重要作用。

miRNA可以直接與Runx2相互作用調(diào)控Runx2表達。研究發(fā)現(xiàn)，miR-133可以靶向結合Runx2的 mRNA，抑制小鼠C2C12細胞向成骨細胞的分化[5]。在小鼠骨髓間充質干細胞中，miR-338-3p可直接作用于Runx2和成纖維細胞的生長因子2型受體(Fibroblast growth factor receptor 2，F(xiàn)GFR2)，引起骨質疏松[6]。Jeong等[7]研究發(fā)現(xiàn)，雌激素受體相關受體γ(estrogen-related receptor γ，ERR γ)可通過下調(diào)Runx2在前成骨細胞的表達活性，抑制成骨細胞分化。其后續(xù)實驗也表明，ERR γ通過誘導小鼠C3H10T1/2細胞miR-433表達，在轉錄后水平直接調(diào)控Runx2，抑制骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein，BMP-2)的表達。另有研究[8]表明，Smad泛素化調(diào)節(jié)因子1(Smad ubiquitination regulatory factor 1， Smurf1)可通過蛋白酶體途徑降解Runx2，而miR-15b能通過減少骨髓間充質干細胞中Smurf1的表達間接上調(diào)Runx2的水平。因此，Runx2作為骨質疏松的信號通路中的關鍵分子，可以與許多上下游分子相互作用，通過“串話(crosstalk)”作用影響骨的生長發(fā)育。

1.2 miRNA調(diào)控Osterix信號通路

Osterix(OSX)又稱SP7，是一個含有鋅指結構的重要轉錄因子，屬Kruppel樣家族的SP亞群，其基因敲除小鼠可因骨礦化異常在出生后迅速死亡。研究[9]發(fā)現(xiàn)，在原代培養(yǎng)的小鼠成骨細胞中，miR-93過表達可作用于OSX基因，抑制骨礦化過程。據(jù)Li等[10]報道，miR-143作為多種腫瘤如非小細胞肺癌、胰腺癌和乳腺癌的抑制劑，可通過減少OSX的表達抑制MC3T3-E1向成骨細胞分化。

miRNA主要作用于OSX基因或OSX mRNA來發(fā)揮負調(diào)控作用。近期研究[11]表明，miR-145通過減少OSX的表達，抑制C2C12和MC3T3-E1細胞的成骨分化。另一項研究[12]用BMP誘導成骨細胞分化，發(fā)現(xiàn)C2C12細胞內(nèi)的miR-214作為OSX抑制物參與了此過程的調(diào)控。此外，MiR-31可降低OSX mRNA的表達，抑制人骨髓間充質干細胞的成骨發(fā)育[13]。與其類似的一項研究[14]顯示，通過上調(diào)miR-125b表達和下調(diào)OSX表達可抑制骨髓間充質干細胞的增殖與分化。另有研究[15]發(fā)現(xiàn)，miR-31，miR-142和miR-138均表現(xiàn)出抑制OSX的表達，而miR-322明顯上調(diào)OSX水平。

1.3 miRNA與骨代謝信號間通路之的相互作用

Runx2和OSX的許多上游或下游分子也參與骨分化與代謝，骨的分化與代謝正是這些調(diào)控分子與信號通路的協(xié)同作用下完成的，即“串話”作用(crosstalk)。BMP是一種屬于TGF-β家族的多功能的生長因子，可通過Smad依賴的BMP信號通路刺激間充質骨成熟，是一種受Runx2調(diào)節(jié)的成骨誘導劑[16]。BMP信號可通過Ⅰ型和Ⅱ型絲氨酸/蘇氨酸激酶細胞膜受體特異性激活Smad-1，- 5，- 8，并與Smad-4形成配合物，激活轉錄過程[17]。Li等研究表明，在MC3T3細胞中，miR-29b通過抑制TGF-β3以及激活素II型受體(activin receptor 2A，ACVR2A，TGF-β超家族的另一成員)維持Runx2等一些重要轉錄因子的正常水平。此外，一些其他經(jīng)典的Wnt信號通路，如MiR-335-5p通過激活Wnt /β-catenin，促進糖原合成酶激酶-3 (glycogen synthase kinase 3，GSK-3)的磷酸化，增強β-catenin轉錄信號，并通過下調(diào)Dickkopf相關蛋白1(Dickkopf-related protein-1，DKK1)促進小鼠C3H10T1 / 2細胞的成骨分化[18]。除了BMP、TGFβ和Wnt信號轉導，一些其他信號通路，如MAPK信號、Notch信號通路、Hedgehog信號通路、nell-1信號通路、 IGF信號與氧化應激信號通路也在其中發(fā)揮著重要作用，有待進一步深入研究。

2 miRNA調(diào)節(jié)骨再生

2.1 尋找合適的再生前體——間充質干細胞

骨骼發(fā)育涉及整個生命過程，包括骨的生長，再生和重塑。骨質疏松和骨損傷會導致骨強度的減弱，從而增加骨折的風險。對于骨質疏松及骨折患者的骨修復，目前研究的首要突破是找到了合適的再生前體：間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)。間充質干細胞是骨、軟骨、肌肉、韌帶、肌腱、脂肪等間充質組織的再生基礎。實驗表明，移植后的MSCs可產(chǎn)生胚胎發(fā)育中神經(jīng)外胚層起源的細胞，如骨骼肌細胞、心肌細胞、內(nèi)皮細胞、肝細胞、膽管上皮細胞等[19]。骨組織的形成始于骨髓基質干細胞的生長，后者可分化為成骨細胞的前體，再逐漸發(fā)育成熟。在這一發(fā)育過程中，均可檢測到miRNA在其中發(fā)揮的重要調(diào)節(jié)作用[20]。此外，基因和 miRNA的表達的檢測技術使我們能夠揭示特定miRNA調(diào)控骨髓間充質干細胞向不同細胞的分化過程，如miR-96、miR-124、miR-199a可誘導成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞不同的分化去向[21]。研究也發(fā)現(xiàn)，各種miRNA水平在未分化的間充質干細胞和分化的骨細胞之間具有差異，如miR-30c、miR-15b和miR-130b在成骨細胞中過表達，其水平明顯高于未分化的間充質干細胞[22]。

2.2 探索調(diào)節(jié)的關鍵靶點——目標基因

骨重建的關鍵是識別miRNA的靶基因。有關靶基因預測的生物信息學技術產(chǎn)品如pictar-4，5和熒光素酶等檢測技術，可為miRNA靶基因的檢測提供幫助[23]。一方面，經(jīng)典的骨轉錄元件如Satb2的抑制分子miR-34b和miR-34c在小鼠主要的成骨細胞中可同時被檢測到[24]。另一方面，許多新的或易被忽視的靶基因如PPAR γ 可被miR-20a和mir-548d-5p抑制。而miR-20a的過表達，會導致Bambi和Crim1基因沉默，無法發(fā)揮正常的生物學功能[25]。值得注意的是，除了3′UTR區(qū)，miRNA可能在許多天然靶基因的氨基酸編碼序列中發(fā)揮生物學功能。劉等[26]發(fā)現(xiàn)，CDS和3′UTR等靶向目標能有效地被miR-15a / miR-16和miR-92a抑制。Tay等[27]研究發(fā)現(xiàn)：miR-134能靶向結合性別決定區(qū)Y相關的HMG盒2，miR-296能靶向結合基因的同源異型盒和miR-470能特異結合八聚體結合轉錄因子4(Oct4，也稱POU結構域第5類轉錄因子1)。這些miRNA均作用于編碼區(qū)，共同促進維甲酸對小鼠胚胎干細胞的誘導分化作用。此外，除了轉錄后控制的mRNAs，miR-2861已被證實結合HDAC5 mRNA的CDS，而miR-3960已被證實能與Hoxa2 mRNA CDS相互作用[28]，且miR-93表達對Osterix mRNA的CDS抑制性效果也通過熒光素酶報告基因分析得以驗證[29]。

2.3 控制細微的調(diào)節(jié)過程——誘導阻遏因子

鑒于目前已有的發(fā)現(xiàn)，通過影響骨相關的miRNA的表達水平能夠調(diào)節(jié)骨修復和再生。進一步的研究方向應該集中在如何通過調(diào)控miRNA在基因水平的表達作用來影響骨骼發(fā)育。通常采用的方法是使用抗miRNA的分子阻礙這些目標蛋白編碼基因的啟動子，抑制那些靶向蛋白編碼基因的表達[30]。目前，一類新構建的化學修飾、膽固醇結合的單鏈RNA類似物可用于結合互補的miRNA。Ebert和他的同事發(fā)明了一種新型miRNA抑制劑，可在哺乳動物細胞中表達，他們稱之為“miRNA海綿”[31]。Qureshi等[32]使用了一個銀納米粒子復合物光活化miR-148b模擬傳遞，成功誘導細胞成骨分化。另一項研究[33]發(fā)現(xiàn)，細胞穿透性肽(cell penetrating peptides，CPP)富含精氨酸，可通過介導 miR-29b在細胞內(nèi)作用，促進hMSCs向成骨細胞分化。這些成果的發(fā)現(xiàn)為骨質疏松及骨折等多種復雜疾病的修復治療帶來了前景，將成為未來研究靶向藥物治療的研究熱點。

3 述評

綜上所述，骨質疏松癥是一種病因復雜，治療困難的疾??；其分子機制涉及遺傳基因、信號通路、激素及旁分泌因子等。目前研究試圖通過影響miRNA調(diào)節(jié)骨分化的過程實現(xiàn)骨再生的方案主要存在兩方面的問題，其一是雖然在miRNA調(diào)節(jié)骨分化的機制方面已取得一定進展，發(fā)現(xiàn)了與成骨細胞分化相關的信號網(wǎng)絡，但骨質疏松的發(fā)病與破骨細胞功能亢進，骨代謝不平衡等多種因素有關。在這些異常生理現(xiàn)象中，關于miRNA具體機制的研究為數(shù)不多，有待進一步探究?？上驳氖?，近期低氧誘導因子、血小板源生長因子、蛋白激酶B、局部粘著斑激酶等新的信號通路的發(fā)現(xiàn)，為我們尋求miRNA在骨質疏松治療上提供了新的路徑，如目前新發(fā)現(xiàn)的miR-214就是通過調(diào)控Akt通路來影響骨代謝過程[34]。其二是在干細胞的骨再生領域，以miRNA為基礎的骨骼再生是否能應用于體內(nèi)骨再生。miRNA這種新興療法可能存在很多潛在的安全性問題。由于每個細胞的miRNA都能夠調(diào)控上百種基因的表達，因此miRNA途徑的微小失調(diào)也會對骨骼造成非常嚴重的后果。目前miRNA的在臨床應用遇到的瓶頸是給藥途徑、給藥濃度上的問題。雖然Eskildsen 等[35]在構建的非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠模型中發(fā)現(xiàn)羥基磷灰石/磷酸三鈣(HA/TCP)與anti-mir-138分子填充骨髓間充質干細胞可以促進骨形成。但這種模擬或干擾miRNA研究多基于細胞株及動物實驗，所用的miRNA濃度并非正常生理條件下的人體內(nèi)的miRNA濃度，所以其具體相關性功能還需進一步驗證。