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黑素細胞是氧化應激的煽動者和受害者

氧化應激可造成細胞內(nèi)核酸、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)損傷，導致遺傳物質(zhì)突變或細胞死亡。線粒體和過氧化物酶體在正常細胞代謝過程中會產(chǎn)生活性氧簇（ROS）。機體處于病理狀態(tài)（如炎癥和癌癥）以及受外源性刺激后（UV或化學物質(zhì)）可使機體ROS的產(chǎn)量增加，其中UV是誘導機體生成ROS的主要來源之一。表皮中的黑素細胞具有合成黑素的特殊功能（UV誘導曬黑過程或炎癥后的色素沉著），氧化應激能夠破壞黑素細胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，同時還能危害其生存或?qū)е缕鋹盒宰儭?/p>

一、黑素和黑素細胞的氧化還原狀態(tài)

黑素合成的過程包括氧化反應以及超氧陰離子（O2?）和過氧化氫（H2O2）的產(chǎn)生，因此，黑素細胞特別容易發(fā)生氧化應激。然而，黑素合成的意義在于產(chǎn)生黑素小體保護其他細胞成分免受氧化應激的損傷。酪氨酸酶是黑素合成的限速酶，可以將酪氨酸氧化成多巴、然后多巴生成多巴醌，后者是一種特定的鄰醌，能夠與親核化合物（如硫醇或氨基）反應。酪氨酸酶的催化活性導致的O2?產(chǎn)生。多巴醌通過氧化還原交換轉(zhuǎn)化為多巴色素。在自發(fā)脫羧反應之后，多巴色素或者被氧化為吲哚醌而生成雙羥基吲哚（5，6?DHI），或者通過酪氨酸酶相關蛋白2（TRP?2）互變異構(gòu)之后產(chǎn)生雙羥基吲哚羧酸（5，6?DHICA），接著5，6?DHICA轉(zhuǎn)化為相應的醌類。此外，TRP?2通過增加谷胱甘肽的水平以及減少自由基誘導的醌類的毒性和DNA損害來抵御氧化應激。從吲哚至醌類的氧化還原循環(huán)會產(chǎn)生ROS。上述活性醌類的聚合最終導致褐色/黑色的真黑素形成。紅-黃色褐黑素與真黑素的區(qū)別在于前者的硫醌比值較高，其合成涉及半胱氨酸-多巴（而不是多巴）的生成，后者被轉(zhuǎn)化為苯并噻嗪衍生物。這些差異導致褐黑素光誘導的促氧化性比真黑素更強。

在皮膚中，黑素的促氧化性和抗氧化性之間的平衡主要取決于真黑素與褐黑素的相對含量、黑素中間產(chǎn)物的水平、黑素小體微環(huán)境內(nèi)活性金屬的濃度。有關于黑素或黑素中間產(chǎn)物作為促或抗氧化劑作用相互矛盾的報道。有報道顯示，構(gòu)成性色素沉著與體外培養(yǎng)的人黑素細胞的催化活性和人皮膚中硫氧還蛋白還原酶的水平直接相關。UV照射后誘導產(chǎn)生的H2O2與構(gòu)成性色素沉著呈負相關，提示黑素具有抗氧化作用。作為DNA氧化損傷主要形式，8羥基脫氧鳥苷（8?OHdG）的誘導和多種堿基切除修復（BER）基因的表達在黑素細胞中高于角質(zhì)形成細胞。而矛盾的是，有報道顯示，在體外培養(yǎng)條件下，相比低黑素含量，高黑素含量的人黑素細胞更易遭受UVA損傷，但受過氧化氫誘導的DNA氧化損傷較少。據(jù)報道，人黑素細胞或小鼠黑素瘤細胞中黑素生成這一刺激可以增加UVA誘導的DNA損傷。相反，體外培養(yǎng)條件下人黑素細胞中α黑皮質(zhì)素（α?MSH）對黑素生成的刺激可以增加過氧化氫酶活性和含量，并顯著減少UV誘導的H2O2生成。在人黑素瘤細胞中，增加的黑素可以抵御UV或過氧化氫誘導的線粒體DNA損傷。有研究將純的外源性黑素或黑素中間產(chǎn)物添加至培養(yǎng)的細胞或裸DNA中，該報道推動了關于黑素及其中間產(chǎn)物是具有促氧化作用還是抗氧化作用的爭論。盡管這些數(shù)據(jù)支持黑素具有氧化特性，但由于黑素通常是被包裹在黑素小體內(nèi)，所以實際的實驗條件不太可能模擬人體生理環(huán)境。

二、旁分泌因子可激活黑素細胞抗氧化防御系統(tǒng)

人表皮黑素細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持主要是通過一個復雜的旁分泌網(wǎng)絡（由表皮角質(zhì)形成細胞和真皮成纖維細胞合成的生長因子和細胞因子）來維持的，并受UV調(diào)節(jié)。角質(zhì)形成細胞源性內(nèi)皮素1是一種有效的絲裂原和黑素生成因子，可以減少H2O2的產(chǎn)生和UV照射后人黑素細胞的凋亡。α?MSH和促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）均由角質(zhì)形成細胞和黑素細胞合成，通過結(jié)合并激活黑皮質(zhì)素1受體（MC1R）刺激真黑素的合成和黑素細胞的存活及增殖。MC1R是一種表達在黑素細胞表面的Gs蛋白偶聯(lián)受體。用α?MSH處理能夠使UV誘導體外培養(yǎng)的人黑素細胞生成H2O2量迅速減少。此外，α?MSH可以增加過氧化氫酶的蛋白水平和活性，并中和UV對該酶的抑制作用。用α?MSH處理可以減少UV照射后黑素細胞中8?oxodG的誘導，并增強其修復，同時還可以降低H2O2誘導的DNA氧化損傷。需要結(jié)合并激活MC1R的α?MSH抗氧化作用不存在于MC1R功能表達缺失的黑素細胞，并且可被生理性MC1R拮抗劑刺鼠信號蛋白抑制。這些結(jié)果證實了活化的MC1R對保護黑素細胞免受氧化應激的重要性。

p53的激活是一種重要機制，活化的MC1R可以經(jīng)此減少黑素細胞中的氧化應激。值得注意的是，p53可以通過增加人黑素細胞中酪氨酸酶的表達和鼠角質(zhì)形成細胞中類嗎啡樣神經(jīng)肽（黑皮質(zhì)素的前體）的表達來調(diào)控色素沉著。α?MSH結(jié)合對MC1R的激活通過增加p53Ser15位點的磷酸化水平，增加了UV誘導的人黑素細胞中p53的蓄積。用α?MSH處理還可以通過一種p53依賴性機制增加BER酶OGG1和APE?1的水平。

此外，α?MSH對MC1R的激活可以通過上調(diào)抗氧化基因包括血紅素氧合酶1（HO?1）、鐵蛋白和過氧化物氧化還原酶1的表達調(diào)控細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)。α?MSH可以激活大量已知的可以調(diào)控黑素細胞氧化還原狀態(tài)的轉(zhuǎn)錄因子。在正常人黑素細胞和黑素瘤細胞中，氧化還原傳感器APE?1是Mitf的靶點，后者是黑素細胞生存和功能的主要調(diào)控子。用α?MSH處理人黑素細胞可以上調(diào)Mitf以及APE?1。黑素細胞還表達Nrf?2（一種上調(diào)第二階段解毒酶基因表達的重要轉(zhuǎn)錄因子）及其主要靶標是HO?1。α?MSH可以增加體外培養(yǎng)的人黑素細胞中Nrf?2基因及其靶基因HO?1、γ谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽?S?轉(zhuǎn)移酶Pi的表達，并解除UV對Nrf?2及其靶標的抑制作用。另一種由α?MSH激活的轉(zhuǎn)錄因子是NFκB，已知由TNF?α和ROS激活。用α?MSH處理的黑素細胞可以通過增加Bcl2（已知的NFκB和Mitf的靶標）的蛋白水平抑制UV誘導的凋亡。

三、黑素瘤中氧化應激的重要性

日光是導致皮膚中ROS形成的主要誘因，也是引起皮膚癌的主要因素。UVA和（或）UVB可損傷皮膚自身的抗氧化防御系統(tǒng)，導致其ROS水平增加。急性的UV照射是黑素瘤產(chǎn)生主要的致病因素。用UV（75%UVB和25%UVA）照射體外培養(yǎng)的人黑素細胞可以導致快速的劑量依賴性H2O2生成，隨后降低過氧化氫酶的活性和蛋白水平，并減少HO?1的表達。UVB照射人OGG1蛋白（一種重要的BER酶）可以導致其失活。

氧化應激可導致或加劇幾種黑素瘤相關基因的突變。激活V600EBRAF突變（通常在痣和黑素瘤中表達的一種體細胞突變）可能受氧化應激的誘導。在黑素細胞中，p16是一種重要的氧化應激調(diào)控子，其在培養(yǎng)的人黑素細胞中的消耗可以顯著增加ROS水平。相比角質(zhì)形成細胞和成纖維細胞，黑素細胞對p16的消耗更敏感，表明p16基因的突變與黑素瘤有關。PTEN的缺失與黑素瘤的發(fā)展相關，可能是因為Akt的持續(xù)活化使超氧陰離子增加所致。與黑素瘤風險增加相關的MC1R等位基因的功能缺失不能對α?MSH產(chǎn)生應答，因此可以引起人黑素細胞中持續(xù)的氧化應激。此外，氧化應激能夠通過脂質(zhì)過氧化物（滅活DNA修復酶）影響核苷酸切除修復（針對UV誘導性DNA光產(chǎn)物的主要修復路徑）。屬于抗氧化基因谷胱甘肽?S?轉(zhuǎn)移酶家族的GSTM1和GSTT1的零多態(tài)性與高黑素瘤風險相關，尤其是在有日曬傷病史的患兒中。在谷胱甘肽?S?轉(zhuǎn)移酶基因GSTP1中的一個SNP（可以降低酶的活性）與黑素瘤的易感性以及在與MC1R突變型等位基因共表達時黑素瘤風險的進一步增加相關。這些結(jié)果有力證實了氧化應激促進了黑素瘤的發(fā)生。

越來越多的證據(jù)顯示，黑素瘤中存在異常的氧化還原狀態(tài)。來源于黑素瘤患者的黑素細胞由于內(nèi)源性抗氧化失衡，其對氧化劑的敏感性增強。與正常黑素細胞相比，黑素瘤細胞內(nèi)的O2?水平較高，可以異常激活轉(zhuǎn)錄因子NF?κB和AP?1。而且與正常黑素細胞相比，黑素瘤細胞表達較高水平的一氧化氮合酶，因此能產(chǎn)生較高水平的一氧化氮，這種增加與黑素瘤的疾病階段有關。氧化應激在黑素瘤中的重要性得到進一步證實，即抗氧化劑N?乙酰半胱氨酸可以在HGF?生存素黑素瘤小鼠模型中抑制腫瘤的形成，以及一氧化氮合酶的選擇性抑制劑可以抑制黑素瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移潛能。因此，抗氧化劑被認為可以預防及治療黑素瘤。

已有多個研究團隊對氧化應激下異常黑素合成和黑素瘤的關系進行了研究。有研究發(fā)現(xiàn)，黑素瘤的前體，即發(fā)育不良痣的ROS增加，褐黑素、硫、鐵和鈣的水平均很高，與此同時DNA的損傷更多。有報道顯示，在HGF小鼠中，UVA誘導的黑素瘤的頻率隨著黑素光反應性氧化過程的皮膚著色而增加。相反，HGF小鼠中腫瘤的形成受到抗氧化劑N?乙酰半胱氨酸的抑制。人皮膚對UVA誘導的色素沉著缺乏自身的光防護特性，表明UVA照射（如日光浴床）不是一種安全的舉措。近期有研究者發(fā)現(xiàn)，伴有mc1r功能缺失和共表達激活BRAFV600E突變的隱性黃色小鼠與白化對照組相比，更多發(fā)展為侵襲性黑素瘤，并且這種褐黑素可以引起DNA氧化損傷。他們推測，黑素瘤的起因是褐黑素合成所致的DNA氧化損傷，而與UV照射無關。人黑素細胞同時合成真黑素和褐黑素，而不像隱性黃色小鼠的黑素細胞只合成褐黑素，這些結(jié)果如何適用于人類色素沉著和黑素瘤的研究值得進一步探討。這些色素的比值可以決定對黑素細胞氧化還原狀態(tài)尤其是UV照射的整體效應。同時，人黑素細胞與小鼠黑素細胞合成的真黑素和褐黑素及其中間產(chǎn)物可能在化學結(jié)構(gòu)上有所不同，可能影響其促氧化或抗氧化的特性?？紤]到真黑素是一種ROS清除劑，因此可以推測真黑素的減少（如皮膚白皙的個體）或缺乏（如隱性黃色小鼠）使得黑素細胞更易受氧化應激的損傷，從而增加罹患黑素瘤的風險。

四、白癜風中的氧化應激和黑素細胞缺失

有證據(jù)顯示，氧化應激是白癜風發(fā)生發(fā)展的關鍵因素。通過比較黑素細胞受UVB誘導的死亡發(fā)現(xiàn)，相比正常黑素細胞，白癜風患者的黑素細胞敏感性更高，歸因于其缺乏應對增強的氧化應激能力。有進一步證據(jù)顯示，白癜風患者非皮損區(qū)皮膚內(nèi)黑素細胞對物理或化學性氧化應激的敏感性被夸大了。已知白癜風患者表皮內(nèi)H2O2（1mmol/L）和過氧亞硝基的水平均非常高，同時伴有過氧化氫酶水平和活性的降低，這可以影響免疫應答。高水平的H2O2可以使蛋氨酸亞砜還原酶（MSR）A、B和硫氧還蛋白/硫氧還蛋白還原酶失活且濃度降低，從而促進白癜風病變中的氧化應激和黑素細胞死亡。同時發(fā)現(xiàn)表皮內(nèi)高水平的H2O2可以使阿黑皮素原衍生的生物活性肽ACTH氧化，這種效應能夠通過假過氧化氫酶處理而減輕。這些結(jié)果證實，白癜風皮膚的促氧化狀態(tài)是黑素細胞死亡的原因所在。

轉(zhuǎn)錄因子Nrf?2與白癜風的發(fā)病機制有關。Nrf?2基因的等位基因突變型A?650被認為是白癜風的一個風險因素。有報道顯示，與非皮損區(qū)相比，白癜風皮損區(qū)表皮內(nèi)的Nrf?2及其靶標NQO?1、γ?谷氨酰半胱氨酸合成酶催化和調(diào)節(jié)亞基（分別為GCLC和GCLM）的轉(zhuǎn)錄水平增加。然而，親電子化合物姜黃素和檀香醇對Nrf?2及其靶基因HO?1、NQO?1、GCLC和GCLM的誘導在白癜風非皮損區(qū)是明顯的，但皮損區(qū)除外，進一步證實了白癜風病變中氧化還原自穩(wěn)態(tài)的破壞。用PUVA治療白癜風患者可以增加皮膚中Nrf?2靶標HO?1的表達。培養(yǎng)的白癜風非皮損區(qū)黑素細胞與其正常對照相比較，前者響應UVA照射或酚類化合物4?叔丁基酚對HO?1的誘導大于后者，證實白癜風患者的黑素細胞對氧化應激更加敏感。

對于白癜風患者的皮膚，正常水平和（或）活性的其他抗氧化劑及BER酶可以加劇氧化應激誘導的黑素細胞死亡。過氧化氫酶的等位基因突變型與白癜風相關，已發(fā)現(xiàn)在白癜風中幾種抗氧化酶如，過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽還原酶的水平發(fā)生改變，解釋了表皮內(nèi)過氧化氫持續(xù)高水平的原因所在。有研究顯示，在白癜風皮損區(qū)和非皮損區(qū)，BER酶OGG1、APE1和DNA聚合酶β的水平均增加。除了高水平的過氧化氫之外，還可以在皮損區(qū)和非皮損區(qū)內(nèi)檢測到高水平的誘生型一氧化氮合酶（iNos），以及在白癜風患者的皮膚和血漿中檢測到8?oxoG增加，進一步證實白癜風中氧化應激是普遍存在的。

五、針對氧化應激通路治療黑素瘤和白癜風

了解健康及病變黑素細胞中存在的氧化還原相關機制的主要益處是能夠利用這些通路進行有效的靶向性治療和實施預防措施。白癜風患者皮膚的色素脫失以表皮內(nèi)高水平的過氧化氫和過氧亞硝基為特征，可以通過降低過氧化氫的水平來恢復其色素沉著，如采用窄波段UVB激活假過氧化氫酶。治療黑素瘤（以異常氧化還原狀態(tài)為特征）有兩種不同的策略。第一種策略，使用增強ROS清除能力的試劑，通過抑制過氧化氫信號（其介導了生長因子的增殖效應，并抑制蛋白酪氨酸磷酸酶的活性，如PTEN）抑制黑素瘤的生長。超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶或過氧化氫酶的過度表達可以減慢腫瘤細胞的生長。越來越多的證據(jù)顯示，抗氧化劑有作為化學預防性藥物抑制黑素瘤發(fā)生和發(fā)展的功效。使用抗氧化劑NAC或硒可以延緩UV誘導性黑素瘤的發(fā)生。Honikiol是一種有效的超氧化物和氫過氧自由基清除劑，可以抑制黑素瘤細胞的體外生長。一氧化氮的選擇性抑制劑可以減緩黑素瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移。硒可以增加谷胱甘肽過氧化物酶的活性和谷胱甘肽的水平，還可以縮小在體人黑素瘤異種移植的大小，以及抑制體外人黑素瘤細胞的生長。用cAMP誘導劑如α?MSH處理人黑素瘤細胞系，可以抑制其增殖，部分是由于抑制了氧化應激所致。第二種策略，使用引起細胞凋亡的藥物（不進行ROS清除）來治療黑素瘤。這類藥物包括丁硫氨酸亞砜胺（耗盡谷胱甘肽）和戒酒硫（抑制銅、鋅超氧化物歧化酶），二者都可以抑制體外黑素瘤細胞的增殖。此外，槲皮素、莫特沙芬釓、美法侖和順鉑可以抑制硫氧還蛋白，可以有效殺死癌細胞。已知可以抑制APE?1/Ref?1核酸內(nèi)切酶活性的白藜蘆醇能夠使黑素瘤細胞對DNA烷化劑敏感。

上述幾種藥物聯(lián)合治療能夠協(xié)同抑制黑素瘤的生長。只有理解氧化應激通路在色素生成、黑素細胞增殖和惡性轉(zhuǎn)化中的復雜性，才能開發(fā)臨床有效的化合物，并為罹患色素性皮膚疾病和黑素瘤的患者提供希望。

［陳旭孔佩慧摘自Denat L,Kadekaro AL,Marrot L,Leachman S,Abdel?Malek ZA.Melanocytes as instigators and victims of oxidative stress［J］.JInvest Dermatol,2014,134（6）:1512?1518.］

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