張海晶，孫桂波，陳榮昌，王健，陳大忠，王永彬，王永寬，解鈞秀*，孫曉波*

(1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院, 哈爾濱　150040； 2. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京　100193；

3. 吉林敖東延邊藥業(yè)股份有限公司，吉林 延吉　133700)

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安神補腦液對大鼠長期毒性的觀察

張海晶1，孫桂波2，陳榮昌2，王健2，陳大忠1，王永彬3，王永寬3，解鈞秀3*，孫曉波2*

(1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院, 哈爾濱150040； 2. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京100193；

3. 吉林敖東延邊藥業(yè)股份有限公司，吉林 延吉133700)

【摘要】目的觀察安神補腦液長期灌胃給藥對大鼠所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)及嚴(yán)重程度，提供毒副反應(yīng)的靶器官及其損害的可逆程度，確定無毒反應(yīng)劑量，以評價安神補腦液長期用藥的安全性，為擬定臨床試驗劑量及觀察指標(biāo)提供參考。方法 Wistar大鼠隨機分為安神補腦液低、中、高劑量組(2.5、5、10 mL/kg)和溶劑對照組(灌服同容積蒸餾水 2 mL/100 g)，每組60只，雌雄各半，每天給藥1 次，每周給藥6 d，連續(xù)26周。觀察大鼠的外觀行為、體重、攝食量，并分別于給藥第13、26周末及四周恢復(fù)期結(jié)束進行血液學(xué)及血液生化學(xué)等各項指標(biāo)檢測及臟器系數(shù)、病理組織學(xué)檢查。結(jié)果長期連續(xù)灌胃給予安神補腦液，對動物一般狀態(tài)、行為活動和外觀體征無明顯不良影響；各劑量組的攝食量、體重、血液學(xué)及血液生化學(xué)指標(biāo)與對照組比較無明顯差別；給藥3個月、6個月對動物各臟器組織位置、重量和臟器系數(shù)無不良影響，但部分臟器重量有所增加，各組動物臟器系數(shù)在正常范圍內(nèi)；病理結(jié)果顯示對照組和安神補腦液高劑量組動物未見明顯與給藥相關(guān)的異常病理改變和毒性改變，恢復(fù)期停藥后未見延遲性毒性，因此，中、低劑量組動物各臟器組織無需進行組織病理形態(tài)學(xué)檢查。結(jié)論安神補腦液長期用藥對大鼠未見明確的毒性反應(yīng)，停藥后亦無延遲性毒性反應(yīng)，預(yù)期擬定的臨床用藥量為安全劑量。

【關(guān)鍵詞】安神補腦液；長期毒性；大鼠

安神補腦液由鹿茸、甘草、制何首烏、干姜、淫羊藿等多味中藥組成[1]，有養(yǎng)心安神、滋補肝腎、定志安神之功效，適用于神經(jīng)衰弱所引起的失眠多夢、頭昏腦脹、煩躁心悸、記憶力減退等不適，對促進血液循環(huán)，改善睡眠和食欲，緩解肌肉疲勞，提高心臟、大腦工作效率等具有較好的治療效果[2-3]。目前國內(nèi)對安神補腦液的研究多集中于其有效成分的含量測定及不同工藝對其療效的影響，以及對于鎮(zhèn)靜安神作用的探討，對于長期服用的有關(guān)毒理學(xué)方面報道較少，而長期毒性試驗可以觀察連續(xù)反復(fù)給藥時，實驗動物出現(xiàn)的毒性作用、劑量與毒性效應(yīng)的關(guān)系、主要毒性靶器官、毒性反應(yīng)的性質(zhì)和程度、毒性反應(yīng)是否可逆等，是臨床前毒性評價的主要內(nèi)容，是新藥審評重點內(nèi)容之一，它為臨床安全用藥的劑量設(shè)計提供參考依據(jù)，為臨床毒副作用的監(jiān)護及生理生化指標(biāo)檢測提供依據(jù)[4]。因此為探討安神補腦液安全性，參照國家藥品安全試驗研究的有關(guān)規(guī)定，對其進行了長期毒性實驗研究。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1受試藥物

安神補腦液由吉林敖東延邊藥業(yè)股份有限公司提供(批號：1107059)，蒸餾水配制成不同濃度的藥液，備用(每天配制一次)。

1.1.2實驗動物

6周齡Wistar大鼠240只，SPF 級，雌雄各半，雄性(120±7.26)g；雌性(112±10.9)g，購自北京維通利華實驗動物有限公司【SCXK(京)2012-0001】。飼養(yǎng)于SPF 級動物實驗室內(nèi)，室溫20～25℃，濕度40%～70%，自由取食全價鼠顆粒飼料和實驗動物飲用水。動物實驗過程在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所完成【SYXK(京)2013-0023】，并按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.1.3實驗儀器

美國Hemavet 950動物血液分析儀、Olympus CH-20顯微鏡、德國BT-M1單通道血凝儀測定、美國雅培Alcyon-300型全自動生化分析儀。

1.2實驗方法

1.2.1動物分組及給藥

Wistar 大鼠(SPF級)雌雄各半，實驗前檢疫與馴化1周，取狀況良好的大鼠240只，隨機分為4 組，安神補腦液低、中、高劑量組和溶劑對照組，每組60只。根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理局2004年下發(fā)的《中藥、天然藥物長期毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》給藥劑量的一般原則，安神補腦液各劑量組分別為2.5、5、10 mL/(kg·d)，對照組灌服同容積蒸餾水 2 mL/100 g。各組每日灌胃給藥1次，每周給藥6 d，停藥1 d，連續(xù)給藥26周，并設(shè)4 周恢復(fù)期。按《中藥、天然藥物長期毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》中的要求檢測各項指標(biāo)。

1.2.2大鼠一般狀況、體重及攝食量觀察

試驗期間每天對大鼠的外觀體征、被毛狀態(tài)、行為活動，有無震顫、痙攣等神經(jīng)反應(yīng)、糞便形狀及顏色、下腹部、肛門處有無污物及排泄物等進行觀察。給藥期間以及恢復(fù)期，體重和攝食量每周測定一次。另外，在進行解剖時先測定動物的體重。

1.2.3血液學(xué)指標(biāo)檢測

分別于給藥第13、26周末及4周恢復(fù)期結(jié)束進行血液學(xué)各項指標(biāo)檢測。各組20只，均雌雄各半。末次給藥后大鼠禁食16 h，10%水合氯醛(0.4 mL/100 g體重)腹腔注射麻醉，腹主動脈采血。動物血液分析儀檢測血紅蛋白(Hb)含量、紅細(xì)胞(RBC)、白細(xì)胞(WBC)及其分類、血小板(PLT)等，顯微鏡法檢測網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)(RET)，比濁法測定凝血酶原時間(PT)。

1.2.4血液生化指標(biāo)檢測

綜上，“社會穩(wěn)定看高校，高校穩(wěn)定看食堂。”高校食品安全關(guān)系到社會和諧穩(wěn)定、學(xué)校持續(xù)發(fā)展和師生生命安全健康，應(yīng)著重把好合同審核、從業(yè)人員入口和食品安全監(jiān)管“三關(guān)”，筑牢高校食品安全的長城。

各檢測時間同血液學(xué)指標(biāo)檢測，腹主動脈采血后，室溫靜置1 h左右，3000 r/min離心10 min，分離血清。如不能當(dāng)日檢測血清，將之放入凍存管中，-80℃凍存。全自動生化分析儀檢測血清中天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、肌酸磷酸激酶(CK)、尿素氮(Urea)、總蛋白(TP)、總膽固醇(CHO)等指標(biāo)。

1.2.5系統(tǒng)尸檢、臟器系數(shù)及組織病理學(xué)檢查

給藥第13、26周末及4周恢復(fù)期結(jié)束，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，剖檢，細(xì)致全面檢查腦、心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、腎上腺、胸腺、雄性動物睪丸和附睪、雌性動物子宮和卵巢等臟器并稱其重量，計算各臟器重量與重量之比( 臟器系數(shù))。將給藥13周的每組20只動物、26周的每組中12只動物及恢復(fù)期的每組中8只動物的腦、脊髓、胸腺、甲狀腺(連甲狀旁腺)、心臟、腎臟等20種組織臟器用4%甲醛固定、保存。先將高劑量組和對照組的臟器組織，按常規(guī)方法進行脫水、包埋、切片、HE染色后，光學(xué)顯微鏡觀察。如某一組織發(fā)生病理改變，其他劑量組動物該組織再進行組織病理學(xué)檢查，以確定劑量-反應(yīng)關(guān)系。反之，中、低劑量組免做組織病理學(xué)檢查。

1.2.6統(tǒng)計學(xué)分析

2結(jié)果

2.1對大鼠一般狀況、體重及攝食量的影響

給藥期間，各劑量組動物的行為活動、外觀體征與對照組比較均相同，未見異常改變。在恢復(fù)期期間，各劑量組動物仍未見異常體征。安神補腦液低、中、高三個劑量組和對照組給藥期間及恢復(fù)期期間，動物攝食量有所波動，但控制在一定范圍內(nèi)，動物體重持續(xù)增長，與對照組比較，安神補腦液低、中、高三個劑量組大鼠的攝食量與體重均無顯著性差異(圖1～2)，安神補腦液對實驗大鼠攝食量及雌雄大鼠體重增長無明顯影響。

圖1　安神補腦液對實驗大鼠攝食量的影響　　Fig.1　Effect of Anshen Bunao liquid on the food intake of rats

圖2　安神補腦液對大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響　　Fig.2　Effect of Anshen Bunao liquid on hematologic parameters in the rats

2.2對大鼠血液學(xué)及血液生化學(xué)指標(biāo)的影響

給藥3個月、6個月，安神補腦液各劑量組動物的血液學(xué)及血液生化學(xué)指標(biāo)均在正常值范圍之內(nèi)，與對照組比較差異無顯著性?；謴?fù)期各組血液學(xué)及血液生化學(xué)指標(biāo)均與對照組無差別，如圖3、4。

2.3對大鼠臟器系數(shù)及組織病理學(xué)的影響

給藥后第13周末、26周末及恢復(fù)期觀察結(jié)束尸體解剖，對照組及各給藥組動物系統(tǒng)臟器組織均未發(fā)現(xiàn)肉眼可見的病理改變。所有的臟器重量及臟器系數(shù)均在正常生理值范圍之內(nèi)，各給藥組臟器重量及臟器系數(shù)與同期對照組比較，在統(tǒng)計學(xué)上均無顯著性差異?；謴?fù)期觀察結(jié)束，雄性動物低劑量組提肛肌重量高于對照組，雌性動物高劑量組腎上腺重量及卵巢和子宮的重量高于對照組；各給藥組臟器系數(shù)與同期對照組比較，在統(tǒng)計學(xué)上均無顯著性差異。具體見表1。

圖3　安神補腦液對大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響　　Fig.3　Effects of Anshen Bunao liquid on hematology in the rats

圖4　安神補腦液對大鼠血液生化學(xué)指標(biāo)的影響　　Fig.4　Effects of Anshen Bunao liquid on biochemical parameters in the rats

病理組織學(xué)檢查顯示對照和高劑量給藥組動物未見明顯與給藥相關(guān)的大體及顯微鏡觀察異常病理改變，未見與給藥相關(guān)的毒性改變，恢復(fù)期停藥1個月后未見延遲性毒性，因此中、低劑量組動物各臟器組織未做組織病理形態(tài)學(xué)檢查；所觀察到的病理改變均為常見的自發(fā)性或偶發(fā)病變，與給藥無明顯相關(guān)性，見圖5、6。

Tab.1Effects of Anshen Bunao liquid on organ weight in the rats

臟器Organs對照組Control安神補腦液組AnshenBunaoliquidgroups2.5510提肛肌給藥13周13thweeks1.828±0.3752.036±0.4161.809±0.3251.788±0.342Levatoranimuscles給藥26周26thweeks2.058±0.2442.083±0.1941.941±0.2212.064±0.172(♂)恢復(fù)4周recovery4thweeks1.906±0.1472.247±0.188*2.089±0.2641.925±0.18腎上腺給藥13周13thweeks0.059±0.0160.067±0.0160.07±0.0140.068±0.026Adrenalgland給藥26周26thweeks0.088±0.0150.086±0.0230.091±0.0300.091±0.024(♀)恢復(fù)4周recovery4thweeks0.061±0.0020.071±0.0090.106±0.0140.097±0.012*卵巢和子宮給藥13周13thweeks0.744±0.1070.822±0.2080.905±0.2880.844±0.134Ovaryanduterus給藥26周26thweeks0.966±0.1641.002±0.1910.997±0.2221.015±0.133(♀)恢復(fù)4周recovery4thweeks0.900±0.0930.869±0.0931.064±0.0751.077±0.125*

注：*P<0.05與對照組比較。

Note.*P<0.05, vs. control group.

圖5　安神補腦液高劑量組大鼠給藥期心、肝、腦、腎、卵巢、睪丸的組織學(xué)圖像(×10)　　Fig.5　Histological appearance of heart (A), liver (B), brain (C), kidney (D), ovary (E), and testis (F) of the rats during the period of high dose Anshen Bunao liquid administration.( ×10)

圖6　安神補腦液高劑量組大鼠恢復(fù)期心、肝、腦、腎、卵巢、睪丸的組織學(xué)圖像(×10)　　Fig.6　Histological appearance of heart (A), liver (B), brain (C), kidney (D), ovary (E), and testis (F) of the rats during the recovery period after high dose Anshen Bunao liquid administration (×10)

3討論

安神補腦液為治療神經(jīng)衰弱類藥物，用藥周期較長，因此觀察其毒性反應(yīng)對臨床安全用藥有重要的參考價值。實驗結(jié)果顯示：安神補腦液低、中、高劑量組連續(xù)灌胃給藥6個月及停藥1個月，各劑量組雌、雄大鼠體重增長正常，飲水、進食量及一般狀況與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，提示安神補腦液不影響大鼠生長發(fā)育；安神補腦液各劑量組的血液學(xué)及血液生化學(xué)指標(biāo)與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，提示安神補腦液不影響大鼠骨髓造血功能，對肝腎功能亦無損害，不影響蛋白質(zhì)、糖的代謝和排泄；主要臟器系數(shù)及組織病理學(xué)檢查均無明顯差異和異常變化，提示安神補腦液對大鼠主要臟器質(zhì)量和臟器系數(shù)無明顯影響。

根據(jù)《中藥、天然藥物長期毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，本實驗條件下安神補腦液低劑量組給藥量與預(yù)期的臨床治療劑量是等效劑量，且高、中劑量組分別達到臨床用藥劑量的4、2倍，而大鼠的各項檢查均未見藥物引起的毒性反應(yīng)，未發(fā)現(xiàn)明確的毒性靶器官，亦無延遲性毒性反應(yīng)。依據(jù)本試驗的結(jié)果分析，可認(rèn)為安神補腦液無明顯的長期毒性，表明其臨床用藥量為安全劑量。此試驗既為安神補腦液的長期合理應(yīng)用提供科學(xué)的理論依據(jù)，也為國內(nèi)對安神補腦液的進一步及有關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

參考文獻

[1]國家藥典委員會． 中華人民共和國藥典一部 [S]．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010: 715-716．

[2]陳從祥． 磁療加安神補腦液治療神經(jīng)衰弱886例療效觀察 [J]． 中國實用醫(yī)藥, 2008, 3( 20): 91．

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[4]許迪, 孔利佳, 杜佐華, 等. 大鼠長期毒性試驗質(zhì)量控制探討 [J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2010, 20(1): 61-63, 69.

研究報告

Evaluation of the chronic toxicity of Anshen Bunao liquid in rats

ZHANG Hai-jing1, SUN Gui-bo2, CHEN Rong-chang2, WANG Jian2, CHEN Da-zhong1,

WANG Yong-bin3, WANG Yong-kuan3, XIE Jun-xiu3*, SUN Xiao-bo2*

(1. Research Institute of Traditional Chinese Medicine, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China;

2. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union

Medical College, Beijing100193; 3. Jilin Ao Dong Yanbian Pharmaceutical Co., Ltd., Yanji 133700)

【Abstract】ObjectiveTo study the chronic toxicity and its severity of a Chinese medicine, Anshen Bunao Liquid (ABL), in rats, provide the target organs and extent of reversibility of their adverse effects, determine its non-toxic dose, and to evaluate the safety of medication and provide reference for clinical trial dose and observation indexes. Methods Two hundred and forty healthy 6-week old Wistar rats (male:female=1:1) were divided into low，middle, and high dose Anshen Bunao liquid groups (2.5, 5, 10 mL/kg)，and solvent control group (distilled water 2 mL/100 g), with 60 rats in each group. The drug was orally administered to rats once a day and 6 days per week for 26 weeks. The general state, body mass and food intake were measured．By the end of 13 weeks, 26 weeks of experiment and 4-week recovery period after drug withdrawal, hematological and biochemical indexes were assayed, organ coefficients were determined, and histopathological observation was performed. ResultsLong-term continuous oral administration of Anshen Bunao liquid, the general state, behavior and gross appearance showed no significant abnormal changes. Compared with the control group, no significant differences in all checked items were found in the treatment groups．During 3 and 6 months, the size and location of organs, organ weight and organ coefficient had no obvious changes, with only non-significant increase of weight of some organs. All the organ coefficients of the animals in different groups were within normal range. Histopathology showed no obvious pathological and toxicological changes even in the high-dose drug treatment group, and no delayed toxicity occurred after withdrawal of drug administration. ConclusionsThe Chinese drug, Anshen Bunao liquid has no obvious toxicity and no delayed toxicity after withdrawal of the drug in rats. It is expected that the planned dose in clinical use is a safe dose.

【Key words】Anshen Bunao liquid; Chronic Toxicity; Rats

[收稿日期]2014-10-09

Doi:10.3969/j.issn.1005-4847.2015.02.009

【中圖分類號】Q95-33

【文獻標(biāo)識碼】A

【文章編號】1005-4847(2015) 02-0147-06

[通訊作者]解鈞秀，正高級工程師，從事新藥開發(fā)研究，E-mail: kf6237458@163.com；孫曉波，研究員，研究方向：心血管藥理，E-mail: xbsun@ imPlad.ac.cn。

[作者簡介]張海晶(1988-)，女，碩士研究生，研究方向：中藥新藥與物質(zhì)基礎(chǔ)。

[基金項目]國家科技重大專項課題，重大新藥創(chuàng)制基金項目(編號：2012ZX09501001-004)。