呂運舟，竇全琴，蔣澤平

(江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院，江蘇　南京　211153)

薄殼山核桃愈傷組織誘導(dǎo)的影響因素

呂運舟，竇全琴，蔣澤平

(江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院，江蘇南京211153)

摘要：以薄殼山核桃品種馬罕×波尼的雜交種子為材料，研究不同外植體來源、不同培養(yǎng)基成分及不同質(zhì)量濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑對愈傷組織誘導(dǎo)效率的影響。結(jié)果表明，MS較1/2 MS和WPM培養(yǎng)基更加有利于薄殼山核桃愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)；最佳植物生長調(diào)節(jié)劑組合為2.0 mg/L NAA+ 0.1 mg/L 6-BA；種子苗幼莖較胚根、胚軸、幼葉更適于作為愈傷組織誘導(dǎo)的起始外植體，愈傷誘導(dǎo)率為72.79%。

關(guān)鍵詞：薄殼山核桃；組織培養(yǎng)；愈傷組織；誘導(dǎo)；胚根；胚軸

文章編號：1001-7380(2015)05-0029-04

收稿日期：2015-09-16;修回日期：2015-10-15

基金項目:江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院青年基金項目“美國薄殼山核桃組織培養(yǎng)研究”(JAF-2012-08)；2013年江蘇省林業(yè)三新工程項目“薄殼山核桃早果豐產(chǎn)栽培技術(shù)及模式集成示范”(lysx[2013]06)

作者簡介：呂運舟(1983-)，男，安徽六安人，博士，從事林木遺傳育種及栽培工作。

中圖分類號：S664.1；Q943.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi:10.3969/j.issn.1001-7380.2015.05.009

Impact factors of the callus inducement and growth

ofCaryaillinoensisin vitro culture

LYU Yun-zhou, DOU Quan-qin, JIANG Ze-ping

(Jiangsu Academy of Forestry, Nanjing 211153,China)

Abstract：The hybrid seeds between ‘Mahan’ and ‘Pownee’ were used to resarch the effect of different explant, different component of media and different concentration of plant growth regulators on the efficiency of callus induction. The results showed that MS basic medium was more suitable for callus induction and subculture of Carya illinoensis,and 2.0 mg/L NAA+ 0.1 mg/L 6-BA was the optimal combination. The tender stem segments were more suitable for callus induction compared with radicle, hypocotyls and spires, with the induction rate of 72.79%.

Key words：Carya illinoensis; Tissue culture; Callus; Induction; Radicle; Hypocotyl

薄殼山核桃[Caryaillinoensis(Wangenh. ) K. Koch. ]又名美國山核桃、薄殼山核桃、長山核桃， 屬胡桃科(Juglandaceae)山核桃屬( Carya Nutt)[1]，原產(chǎn)北美，是世界著名干果之一， 也是優(yōu)良的果材兼用樹種[2]。

薄殼山核桃推廣面積逐年增大，目前良種繁育主要依靠嫁接繁殖，但是需要大量砧木且技術(shù)要求高、人工成本大。組織培養(yǎng)快速繁育技術(shù)是保持薄殼山核桃優(yōu)良性狀和加快繁殖的有效手段，可促進(jìn)該樹種的推廣和利用[3-4]。國外研究者開展薄殼山核桃組織培養(yǎng)研究較早，并取得了一定進(jìn)展，但尚未建立成熟的再生體系[5-7]。Mathews等[5]利用未成熟胚成功誘導(dǎo)出薄殼山核桃體細(xì)胞胚，但是未能實現(xiàn)增殖和生根。已有多篇文獻(xiàn)報道，利用帶芽的莖段作為外植體，可以誘導(dǎo)分化不定芽，但都存在繼代困難、生根困難等難題[6-7]。在國內(nèi)，董筱昀等[8]、傅玉蘭等[9]已開展了薄殼山核桃的外植體消毒及莖段誘導(dǎo)、增殖等相關(guān)技術(shù)的研究，但并未突破關(guān)鍵技術(shù)，實現(xiàn)擴(kuò)繁體系。研發(fā)薄殼山核桃愈傷組織誘導(dǎo)，進(jìn)而建立間接植株再生體系，可以為其擴(kuò)繁提供新的思路，也為遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

本試驗研究了不同培養(yǎng)基組成，不同植物生長調(diào)節(jié)劑配比，不同外植體材料等因素對薄殼山核桃愈傷組織誘導(dǎo)的影響，初步建立了薄殼山核桃愈傷組織誘導(dǎo)方法。

1材料與方法

1.1　供試材料

采集人工控制授粉的馬罕×波尼的雜交種子，采取恒溫培養(yǎng)箱催芽(30 ℃), 出芽后移植育苗盤置于溫室內(nèi)生長(室溫25 ℃，光照強(qiáng)度為1 500～2 000 lx，光照時間16 h/d)，剪取胚軸、胚根及幼苗莖段(未木質(zhì)化)、幼葉為接種外植體。

1.2　外植體滅菌方法

將外植體剪成3～4 cm長度，洗衣粉浸泡清洗，流水沖洗3 h以上，75%酒精溶液浸潤30 s,無菌水沖洗1次，0.1% HgCl2溶液浸泡滅菌，期間不斷搖晃，滅菌脫毒時間2～8 min，再用無菌水沖洗5～7遍，吸水紙吸干外植體表面水珠，剪成1～2 cm置于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

1.3　培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括(1)在附含2.0 mg/L NAA，0.5 mg/L 6-BA的MS，1/2 MS和WPM培養(yǎng)基。(2)以MS為基本培養(yǎng)基，附加0～3 mg/L NAA，0～3 mg/L 2,4-D和 0～0.5 mg/L 6-BA。所有培養(yǎng)基均附含30.0 g/L蔗糖，10.0 mg/L肌醇，500 mg/L水解酪蛋白(CH)，10.0 mg/L維生素C，6.0 g/L瓊脂。pH 5.80，于(23±1)℃下暗培養(yǎng)。

1.4　統(tǒng)計分析

培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計愈傷分化率。每個組合每次接種不少于30個外植體，每組重復(fù)3次。愈傷誘導(dǎo)率(%)=分化愈傷外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100。

2結(jié)果與分析

2.1　滅菌時間對不同外植體的影響

植物愈傷組織誘導(dǎo)過程是體細(xì)胞脫分化過程，與其細(xì)胞分裂活力緊密相關(guān)[10]。滅菌過程不僅清除了外植體表面微生物，同時也會對植物細(xì)胞產(chǎn)生一定傷害，影響分化能力。為了盡可能減少對薄殼山核桃外植體體細(xì)胞傷害，設(shè)置了從2～8 min滅菌時間。試驗結(jié)果如表1，隨著滅菌時間的增加，外植體胚根、胚軸、幼莖及幼葉的污染率遞減，滅菌時間達(dá)到8 min，除幼莖外其他3種外植體污染率均為零，幼莖也只有4.4%。但是滅菌時間的增加對外植體褐化率呈正相關(guān)，特別是幼嫩組織胚軸與胚芽，滅菌8 min導(dǎo)致接種的45個外植體中分別有31個和33個發(fā)生褐化，褐化率為70%左右。因此，綜合考慮對外植體污染率及褐化的影響，確定胚軸、胚根的滅菌時間為4 min，幼葉滅菌時間為6 min，而幼莖的滅菌時間最長，為8 min。

表1　不同處理時間的滅菌效果

每組試驗接種45個外植體。

2.2　不同培養(yǎng)基成分對愈傷組織誘導(dǎo)效率的影響

薄殼山核桃愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)分別采用MS, 1/2 MS和WPM培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)，采用蔗糖作為碳源并添加2.0 mg/L NAA，0.1 mg/L 6-BA植物生長調(diào)節(jié)劑。結(jié)果顯示(如表2)，薄殼山核桃幼莖在3種培養(yǎng)基中均可以形成愈傷組織，但愈傷誘導(dǎo)率存在明顯差異，以含氮量高的MS作為基本培養(yǎng)基時幼莖愈傷誘導(dǎo)率為69.5%，顯著高于1/2 MS,WPM時的53.7%和52.8%。此外，不同基本培養(yǎng)基來源的新生愈傷組織狀態(tài)也存在差異。MS基本培養(yǎng)基上的愈傷組織質(zhì)地致密,且顆粒較為均勻圓潤，顏色淡黃； 1/2 MS培養(yǎng)基上生長的愈傷組織水質(zhì)化較為嚴(yán)重，顏色較黃，不適于繼代培養(yǎng)；而WPM培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的愈傷組織顏色暗黃，呈松散顆粒狀，繼代之后容易褐化。多重比較結(jié)果可以看出,MS培養(yǎng)基上與其他2種培養(yǎng)基的愈傷誘導(dǎo)率差異顯著，因此在外植體相同、外源調(diào)節(jié)劑相同的情況下，基本培養(yǎng)基成分對薄殼山核桃愈傷組織誘導(dǎo)率及愈傷狀態(tài)的影響較大。

表2薄殼山核桃幼莖在不同培養(yǎng)基上愈傷誘導(dǎo)率及愈傷狀態(tài)

處理愈傷誘導(dǎo)率/%愈傷狀態(tài)MS69.5±4.1a 顏色淡黃,質(zhì)地致密、水潤1/2MS53.7±3.3b 顏色黃,水質(zhì)化程度高WPM52.8±5.7b 顏色暗黃,呈松散顆粒狀

以MS為基本培養(yǎng)基，每組合接種外植體不少于30個，每組重復(fù)3次。數(shù)值表示平均值±SD，不同字母表示在P<0.05時的Duncan多重范圍的差異檢驗的顯著性。

2.3　不同外植體的愈傷組織誘導(dǎo)特點

愈傷組織形成與外植體分化程度相關(guān)，一般生理年齡越小其脫分化能力越強(qiáng)。選擇合適的外植體材料對于建立愈傷組織誘導(dǎo)體系具有重要意義。本試驗選用4種薄殼山核桃外植體作為起始材料，于質(zhì)量濃度2.0 mg/L NAA，0.1 mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈傷組織，結(jié)果表明不同外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率有所差異(如表3)。4種外植體在MS培養(yǎng)基上接種7～10 d后，均有愈傷組織形成，其中幼葉的愈傷誘導(dǎo)率最低，只有35.6%，另3種外植體的愈傷誘導(dǎo)率相近，胚根、胚軸及幼莖分別為55.6%,63.3%和54.4%。

表3　不同外植體對薄殼山核桃愈傷組織誘導(dǎo)的影響

不同外植體形成的愈傷組織狀態(tài)存在較大差異，以胚軸、幼莖誘導(dǎo)的愈傷組織狀態(tài)較好(如表3)，顏色淡黃、質(zhì)地致密水潤；胚根誘導(dǎo)的愈傷質(zhì)地較硬，生長速度較慢；而幼葉在切口周圍有少量愈傷生成，有透明裝逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榛液稚?。此外，各種來源的愈傷組織繼代后的生長特點也不同。分別接種50塊愈傷，培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計生長情況及褐化率發(fā)現(xiàn)，脫離外植體后幼葉產(chǎn)生的愈傷組織不能夠增殖，36塊愈傷組織團(tuán)發(fā)生褐化，褐化率(褐化愈傷數(shù)/繼代愈傷總數(shù))達(dá)到72%，因此幼葉不能夠作為薄殼山核桃愈傷組織誘導(dǎo)起始材料。較于胚根與胚軸，生理年齡更大的幼莖愈傷組織繼代20 d的褐化率更低，為46%。因此，薄殼山核桃幼莖可作為愈傷組織誘導(dǎo)的外植體。

2.4　不同植物生長調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

在植物外植體在組織培養(yǎng)中產(chǎn)生愈傷的過程中，外源生長調(diào)節(jié)劑是影響誘導(dǎo)效率的重要因素。以MS為基本培養(yǎng)基，系統(tǒng)研究不同質(zhì)量濃度生長素、細(xì)胞分裂素類物質(zhì)對薄殼山核桃幼莖愈傷組織誘導(dǎo)率的影響，結(jié)果(見表4)顯示，NAA為2.0 mg/L，6-BA為0.1 mg/L時的愈傷誘導(dǎo)率最高，為72.79%，而對照培養(yǎng)基不能誘導(dǎo)愈傷組織生成。在其他條件相同情況下，愈傷誘導(dǎo)率隨著NAA質(zhì)量濃度的提高而遞增，當(dāng)NAA增加至2.0 mg/L時，薄殼山核桃幼莖的愈傷誘導(dǎo)率略有下降，為56.12%，且愈傷組織結(jié)構(gòu)變得松散，不利于后續(xù)分化。因此薄殼山核桃幼莖愈傷誘導(dǎo)NAA以2.0 mg/L為宜。

表4　幼莖在不同植物生長調(diào)節(jié)劑下的愈傷誘導(dǎo)率

此外，從表4可以看出，生長素類物質(zhì)是誘導(dǎo)薄殼山核桃愈傷組織所必需的因素，而2,4-D在1.0 mg/L時誘導(dǎo)效率最高，為66.54%。適量添加6-BA可以增加薄殼山核桃愈傷組織誘導(dǎo)率，但其質(zhì)量濃度增加到0.5 mg/L時,反而有一定的抑制作用，說明適度的生長素/細(xì)胞分裂素類物質(zhì)配比可以有效提高愈傷形成及狀態(tài)穩(wěn)定。

3結(jié)論與討論

本實驗研究結(jié)果表明， 薄殼山核桃外植體在接種過程容易污染，選擇溫室萌發(fā)種子及幼苗為外植體來源，可以有效控制接種污染，但是取自萌發(fā)種子的胚軸、胚根的褐化率較高。而種子苗幼莖取材容易，接種污染率低，是薄殼山核桃愈傷組織誘導(dǎo)的理想材料。MS培養(yǎng)基較1/2 MS,WPM培養(yǎng)基更適于薄殼山核桃愈傷組織誘導(dǎo)，適當(dāng)?shù)纳L素/細(xì)胞分裂素類物質(zhì)配比比單一性誘導(dǎo)效果更好，因此，附含2.0 mg/L NAA，0.1 mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基為薄殼山核桃誘導(dǎo)愈傷的理想培養(yǎng)基。

基因型差異是影響植物愈傷組織誘導(dǎo)的重要因素[11]，本試驗為了減少遺傳因素對實驗結(jié)果的影響，選擇馬罕×波尼雜交子代群體作為研究材料，對于后續(xù)研究具有指導(dǎo)意義。薄殼山核桃在生長過程中容易積累多酚、醌類等次生代謝物質(zhì)，可能是造成本實驗中愈傷組織褐化的主要原因。鑒于愈傷組織繼代過程中增殖較少、較易褐化的特點，筆者建議在以后的薄殼山核桃愈傷組織分化及遺傳轉(zhuǎn)化研究過程中，盡量減少繼代次數(shù)，新生愈傷組織直接轉(zhuǎn)入分化階段，以提高不定芽分化率。

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