陳晶，韓貴清,*，尚晨，張海玲，李佶愷，劉慧瑩，張月學(xué)

(1.哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150025；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所，黑龍江 哈爾濱150080)

去除紫花苜蓿葉片高豐度蛋白的方法及其應(yīng)用

陳晶1，韓貴清1,2*，尚晨2，張海玲2，李佶愷2，劉慧瑩2，張月學(xué)2

(1.哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150025；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所，黑龍江 哈爾濱150080)

摘要：紫花苜蓿葉片中大量的高豐度蛋白(核酮糖-l，5-二磷酸羧化/加氧酶，Rubisco)干擾了蛋白質(zhì)的動態(tài)分辨率，嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)組學(xué)研究中功能蛋白的檢測與鑒定。為了探究去除高豐度蛋白的適宜方法，本研究利用Mg/NP-40與聚乙二醇(PEG)預(yù)分離紫花苜蓿葉片蛋白，通過雙向凝膠電泳法比較了不同濃度PEG對葉片高豐度蛋白的分離情況。電泳圖譜顯示0，15%，17.5%，20%PEG處理的蛋白質(zhì)中分別可以檢測到(335±17)，(417±3)，(445±7)，(459±11)個蛋白質(zhì)點(diǎn)，0，15%，17.5%處理組間差異顯著(P<0.05)，17.5%和20%PEG 處理組間沒有差異(P<0.05)。然而，17.5%PEG能夠檢測到更多的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，證明其更能有效沉淀高豐度蛋白，便于檢測被Rubisco遮蓋的蛋白質(zhì)點(diǎn)。將該方法應(yīng)用于紫花苜蓿葉片響應(yīng)低溫脅迫的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中檢驗其應(yīng)用效果，與三氯乙酸/丙酮法提取的全蛋白相比，去除高豐度蛋白后鑒定出8個新的蛋白質(zhì)差異點(diǎn)，證明該方法適用于實際的蛋白質(zhì)組學(xué)研究?？梢姡琈g/NP-40與17.5%PEG法是最適宜去除紫花苜蓿葉片高豐度蛋白的方法。

關(guān)鍵詞：高豐度蛋白；核酮糖-l，5-二磷酸羧化/加氧酶；聚乙二醇；紫花苜蓿；蛋白質(zhì)組學(xué)

DOI：10.11686/cyxb2015044

Chen J, Han G Q, Shan C, Zhang H L, Li J K, Liu H Y, Zhang Y X. Proteomic methods for removing high-abundance proteins in alfalfa leaf. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(7): 131-138.

陳晶，韓貴清，尚晨，張海玲，李佶愷，劉慧瑩，張月學(xué). 去除紫花苜蓿葉片高豐度蛋白的方法及其應(yīng)用. 草業(yè)學(xué)報, 2015, 24(7): 131-138.

http://cyxb.lzu.edu.cn

收稿日期：2015-01-21；改回日期：2015-04-09

基金項目：黑龍江省博士后特殊基金項目(LBH-TZ1209)和“十二五”支撐項目(2011BAD17B04-2)資助。

作者簡介：陳晶(1984-)，女，黑龍江哈爾濱人，在讀博士。E-mail:ccyj15@163.com

通訊作者*Corresponding author. E-mail:ccyj200@163.com

Abstract:The higher content of high-abundance proteins (Ribulose-l, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase; RuBisCo) interferes with the dynamic resolution of proteins in two-dimensional electrophoresis (2-DE), affecting the detection and identification of functional proteins in proteomics. To explore suitable methods for removing high-abundance protein, Mg/NP-40 and different concentrations of polyethylene glycol (PEG) were used for protein pre-fractionation and the treatments’ influence on the separation of proteins in alfalfa leaf was compared. The results indicated that (335±17), (417±3), (445±7) and (459±11) spots were detected in treatments of 0, 15%, 17.5% and 20% PEG respectively. There were significant differences between the 0-17.5% treatments but no significant differences were found between the 17.5% and 20% treatments. More differential protein spots were detected in the 17.5% treatment, which thus proved the most effective way of removing RuBisCo proteins. In order to inspect the applicability of this result, a proteomic study of alfalfa in response to low temperatures was under taken. Compared with total proteins extracted by TCA/acetone, eight new protein spots were identified after PEG treatment to remove high-abundance proteins. The research thus indicates that pre-fractionation with Mg/NP-40 and17.5% PEG is suitable for proteomic studies of alfalfa.

Proteomic methods for removing high-abundance proteins in alfalfa leaf

CHEN Jing1, HAN Gui-Qing1,2*, SHAN Chen2, ZHAN Hai-Ling2, LI Ji-Kai2, LIU Hui-Ying2, ZHANG Yue-Xue2

1.CollegeofLifeSciencesandTechnology,HarbinNormalUniversity,Harbin150025,China; 2.InstituteofGrassResearch,HeilongjiangAcademyofAgricultureSciences,Harbin150080,China

Key words: high-abundance protein; Rubisco; polyethylene glycol; alfalfa; proteomics

蛋白質(zhì)組學(xué)是21世紀(jì)的前沿?zé)狳c(diǎn)領(lǐng)域之一。近十年來，其從高度專業(yè)化轉(zhuǎn)變?yōu)槌Ｒ?guī)的技術(shù)手段應(yīng)用于植物學(xué)研究[1]。大量蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)的挖掘在植物基因功能分析和特殊蛋白質(zhì)鑒定上發(fā)揮了重要作用，也在一定程度上為基因組和代謝組間構(gòu)建了“溝通”橋梁[2]。紫花苜蓿(Medicagosativa)是多年生豆科牧草，其豐富的蛋白質(zhì)含量及優(yōu)良的適應(yīng)性為草業(yè)和畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供了有利條件[3]。對其非生物性(低溫、鹽堿、干旱、藥害等)逆境因子應(yīng)答反應(yīng)和抗、耐性機(jī)理的蛋白質(zhì)組學(xué)研究具有重要意義。但紫花苜蓿葉片中大量高豐度蛋白[如，核酮糖-l，5-二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)]的存在降低了蛋白質(zhì)的動態(tài)分辨率，極大地影響了逆境應(yīng)答和代謝過程中功能蛋白的分析與鑒定。

Rubisco作為一種“超大量”蛋白，普遍存在于綠色植物中。在對擬南芥(Arabidopsisthaliana)和水稻(Oryzasativa)葉片的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，其高豐度蛋白Rubisco及其變體分別占蛋白總量的12%和35.3%，極易遮蓋鄰近蛋白，使一些低豐度蛋白無法被識別[4-5]。近年來，國內(nèi)外科學(xué)家一直致力于尋求提高低豐度蛋白分辨率的方法。Cellar 等[6]利用Rubisco免疫耗竭柱去除了葉片組織中90%~98%的Rubisco，增強(qiáng)了低豐度蛋白的檢測和鑒定；但該方法復(fù)雜、耗時且費(fèi)用較高。Cho 等[7]發(fā)現(xiàn)高濃度二硫蘇糖醇(dithiothretiol, DTT)可以有效去除水稻葉片中的Rubisco酶，提高雙向凝膠電泳的分辨率；但DTT 沉淀法原理及其在其他作物中的有效性還需要進(jìn)一步研究和檢驗[8]。另外，也有研究發(fā)現(xiàn)肌醇六磷酸鈉結(jié)合鈣離子法可以去除植物葉片中的大部分Rubisco酶，其在不同植物中有效性及適宜的反應(yīng)溫度也需要檢驗和篩選[8-9]。PEG是一種直鏈大分子聚合物，能夠破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層而使蛋白發(fā)生沉淀作用，最早應(yīng)用于一些細(xì)菌和病毒蛋白的提純[10-11]。Kim等[12]在2001年采用聚乙二醇(PEG)沉淀法預(yù)分離了水稻葉片蛋白，去除了大部分Rubisco。此后該方法又被成功應(yīng)用于擬南芥[13]、水稻[14-15]和甜瓜(Cucumis)[16]的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，有效提高了低豐度蛋白的分辨率，也是目前應(yīng)用最多的去除植物高豐度蛋白的方法。與其他方法相比，PEG沉淀法更加快捷、簡單、費(fèi)用低廉且具有較廣的適用性。到目前為止，尚沒有探究紫花苜蓿高豐度蛋白去除方法的相關(guān)報道。因此，本試驗在前人的基礎(chǔ)上，利用不同濃度的PEG預(yù)分離紫花苜蓿葉片蛋白，旨在篩選去除高豐度蛋白的適宜方法；并將該方法應(yīng)用于紫花苜蓿響應(yīng)低溫的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，檢測其可應(yīng)用性。

1材料與方法

1.1　材料

紫花苜蓿WL525HQ種子由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所提供。2014年，紫花苜蓿種子播種于混有草炭土∶蛭石=2∶1的塑料花盆中，置于晝/夜溫度 25℃/20℃，光周期 16 h/8 h，濕度約為80%，光照強(qiáng)度 12000 lx的人工氣候箱中。培養(yǎng)至60 d苗齡，移至溫度 4℃，其他條件相同的恒溫箱中處理12 h。于低溫處理0和12 h時分別剪取紫花苜蓿葉片若干，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2　高豐度蛋白的去除

1.2.1蛋白質(zhì)提取取凍存葉片(低溫4℃處理0 h)2 g,于液氮中研磨成粉末后加入8 mL 預(yù)冷的Mg/NP-40蛋白提取液[0.5 mol/L pH 8.3 Tris-HCl，2%(v/v) NP-40，0.02 mol/L 氯化鎂，0.001 mmol/L 乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)，0.02 mol/L DTT，0.001 mol/L苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)][5]，在冰上研磨10 min。4℃，12000 r/min離心30 min后取上清液，棄沉淀。上清液分為4組，分別加入適量50%(w/v)PEG4000至終濃度為 0，15%，17.5%，20%，充分混勻后冰浴30 min。以PEG終濃度 0為對照(Control，CK)，其余3組4℃，12000 r/min離心1 h，分別取上清記為S1、S2、S3，相對應(yīng)沉淀記為P1、P2、P3，加入3倍體積量-20℃預(yù)冷的10% (w/v)三氯乙酸/丙酮，混勻，-20℃過夜。4℃，12000 r/min離心1 h,棄上清，沉淀中加入3倍體積量-20℃預(yù)冷丙酮，重懸后置于-20℃ 1 h。 4℃，12000 r/min離心30 min，棄上清，沉淀凍干成粉末。

1.2.2聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳檢測蛋白質(zhì)干粉中加入裂解液[7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4%(w/v) 3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽(3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] propanesulfonate，CHAPS)，0.04 mol/L DTT]，振蕩均勻后置于搖床上持續(xù)振蕩1 h，使蛋白完全溶解。2D-Quant 試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，留取相應(yīng)體積蛋白溶液，其余-80℃冰箱凍存。配制12%分離膠和5%濃縮膠用于SDS-PAGE電泳檢測。電泳結(jié)束后，考馬斯亮藍(lán)R-250染色，乙醇冰乙酸脫色至條帶清晰。白光掃描儀掃描凝膠，分析蛋白質(zhì)分離情況。

1.2.3雙向電泳檢測選用13 cm IPG(pH 4～7)膠條，蛋白質(zhì)上樣量為650 μg，加入水化液[8 mol/L尿素，2%(w/v)CHAPS，0.3%(w/v)DTT，1%(v/v)IPG buffer]稀釋至250 μL。第一向等電聚焦程序為：30 V，12 h；200 V，1 h；500 V，1 h；1000 V，2 h；8000 V，3 h；8000 V，45000 Vh；1000 V，任意。第二向12.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳程序為：10 mA/膠條，0.5 h；40 mA/膠條，2.5～4 h。雙向電泳后，考馬斯亮藍(lán)R-250染色，10%(v/v)冰醋酸脫色后，白光掃描儀掃描凝膠，使用ImageMaster 2D Platinum凝膠分析軟件進(jìn)行比對分析。

1.3　PEG沉淀法的應(yīng)用性驗證

1.3.1蛋白質(zhì)提取葉片全蛋白提取用傳統(tǒng)方法三氯乙酸/丙酮提取法。取凍存葉片(低溫4℃處理0，12 h)各0.5 g置于預(yù)冷的研缽中，加入液氮充分研磨后轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中并加入三倍體積-20℃預(yù)冷的蛋白提取液[含10%(w/v)三氯乙酸、0.07%(v/v)β-巰基乙醇、1%(v/v)蛋白酶抑制劑的丙酮溶液]，-20℃沉淀過夜。4℃，12000 r/min離心1 h，棄去上清，保留沉淀。用三倍于沉淀體積的含有0.07%(v/v)的β-巰基乙醇的冷丙酮將沉淀重懸，-20℃沉淀1 h以上。4℃，12000 r/min離心1 h，棄去上清，保留沉淀。將沉淀凍干成粉末，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

低豐度蛋白提取用Mg/NP-40+PEG法，PEG濃度為17.5% (詳見1.2.1)。

1.3.2雙向電泳選用24 cm IPG(pH 4～7)膠條，蛋白質(zhì)上樣量為1000 μg，上樣體積為450 μL。第一向等電聚焦程序為：30 V，12 h；200 V，2 h；500 V，2 h；1000 V，2 h；8000 V，3 h；8000 V，65000 Vh；1000 V，任意。第二向12.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳程序為：1 W/膠條，1 h；13 W/膠條，3.5～4 h。雙向電泳后，考馬斯亮藍(lán)R-250染色，10%(v/v)冰醋酸脫色后，白光掃描儀掃描凝膠，使用ImageMaster 2D Platinum凝膠分析軟件進(jìn)行比對分析。

1.3.3差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的鑒定篩選出的差異點(diǎn)通過MADLI_TOF/TOF進(jìn)行鑒定，所得結(jié)果利用MASCOT軟件搜索NCBIMedicago、NCBI Viridiplantae 和Uniprot數(shù)據(jù)庫。

1.4　統(tǒng)計分析

本試驗中，所有處理3次重復(fù)，相關(guān)數(shù)據(jù)通過軟件DPS進(jìn)行差異顯著度分析。

2結(jié)果與分析

2.1　不同濃度PEG處理下SDS-PAGE電泳分析結(jié)果

為探究不同濃度PEG對紫花苜蓿葉片高豐度蛋白的分離情況，對各處理下蛋白質(zhì)的沉淀和上清部分進(jìn)行了SDS-PAGE檢測。圖1是以PEG濃度0%為對照組(control)，不同濃度PEG處理蛋白樣品后沉淀和上清部分的SDS-PAGE電泳分析對比圖。其中P1~P3與S1~S3分別對應(yīng)PEG濃度15%，17.5%，20% 蛋白樣品的沉淀和上清部分。圖中對照組高豐度蛋白條帶清晰，聚集在55 kD左右處。而PEG處理后，沉淀樣P1～P3可見清晰的高豐度蛋白條帶，并且Rubisco分散為55 kD左右大亞基(large subunit of Rubisco, LSR)和14.4 kD左右小亞基(small subunit of Rubisco, SSR)；上清樣S1～S3高豐度蛋白條帶減弱，其中S2和S3中高豐度蛋白下降更明顯，低豐度蛋白條帶清晰穩(wěn)定。可見，PEG可以沉淀富集紫花苜蓿葉片中的Rubisco，17.5%，20%的PEG均可用于去除高豐度。

圖1　不同濃度PEG處理下蛋白質(zhì)樣品SDS-PAGE電泳圖Fig.1　SDS-PAGE analysis of proteins from the PEG fractionation　　　P1~P3為PEG濃度15%,17.5%,20% 蛋白樣品的沉淀部分；S1~S3為PEG濃度15%,17.5%,20% 蛋白樣品的上清部分。 P1-P3 stand for protein precipitation of treatment with 15%,17.5% and 20% PEG, respectively. S1-S3 stand for protein supernate of treatment with 15%,17.5% and 20% PEG, respectively.

2.2　不同濃度PEG處理下雙向電泳圖像分析結(jié)果

圖2顯示不同濃度PEG處理下蛋白質(zhì)樣品上清部分的雙向電泳圖像。圖中紅框內(nèi)為高豐度蛋白點(diǎn)，用3D圖像顯示豐度。對照和S1可見大量高豐度蛋白點(diǎn)，S2和S3中高豐度蛋白明顯減少。而隨著PEG濃度的升高可檢測出的蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)目增多(表1)，與對照組重疊的點(diǎn)數(shù)減少，17.5%和20%的PEG處理均可獲得較多蛋白質(zhì)點(diǎn)，且二者沒有顯著差異(P<0.05)；與對照組相比差異點(diǎn)數(shù)變化較大，差異率分別為(33.33±0.72)%， (56.62±0.22)%，(52.28±0.72)%，差異顯著(P<0.05)?？梢?，17.5%和20%的PEG均可用于提取低豐度蛋白，與SDS-PAGE分析結(jié)果一致，但17.5%PEG處理下可檢測出更多差異點(diǎn)(表1)。在圖2的3D圖像中，S2的蛋白質(zhì)點(diǎn)形成相對分離的單峰圖像，可觀察到清晰的蛋白點(diǎn)和豐度；S3則蛋白損失過多，呈現(xiàn)細(xì)小尖峰圖像?？梢?，17.5% PEG更適宜于紫花苜蓿的高豐度蛋白的去除。

圖2　不同濃度PEG處理下2-DE對比圖像Fig.2　Comparation of 2-DE gels from the PEG fractionation 　　　右側(cè)圖像為雙向電泳圖中紅框內(nèi)蛋白質(zhì)點(diǎn)的3D圖像3D images on the right showing protein spots in the red box of 2-DE gels.

2.3　PEG沉淀法在響應(yīng)低溫蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用

為了驗證PEG沉淀法在紫花苜蓿響應(yīng)低溫蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的可應(yīng)用性，紫花苜蓿葉片的蛋白分別用三氯乙酸/丙酮法和17.5% PEG沉淀法進(jìn)行提取，雙向電泳后經(jīng)ImageMaster 2D Platinum軟件分析確定響應(yīng)低溫的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。圖3為4℃處理12 h下紫花苜蓿葉片的雙向電泳圖譜(A為三氯乙酸/丙酮法，B為17.5% PEG沉淀法)，數(shù)字分別標(biāo)注了全蛋白和低豐度蛋白響應(yīng)低溫的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。與未處理的對照組相比，經(jīng)低溫后紫花苜蓿葉片蛋白(A)中有14個點(diǎn)蛋白質(zhì)豐度變化在1.5倍以上(圖3)，而PEG去除高豐度蛋白Rubisco后，低豐度蛋白(B)中發(fā)現(xiàn)8個新的差異點(diǎn)(圖3)。經(jīng)MADLI_TOF/TOF鑒定，所得結(jié)果利用MASCOT軟件搜索相關(guān)數(shù)據(jù)庫確定其蛋白種類“L”表示低豐度蛋白?！癓” represents low-abundance protein.

表1　不同處理下2-DE圖像蛋白點(diǎn)統(tǒng)計分析

注：重疊點(diǎn)數(shù)為PEG處理后上清液與對照組相重疊點(diǎn)數(shù)。同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: Overlapping spots represent spots of supernatant from PEG fractionation overlapping with spots of control.The different letters in the same column mean significant differences atP<0.05.

圖3　紫花苜蓿葉片響應(yīng)低溫的全蛋白(A)和低豐度蛋白(B)雙向電泳圖Fig.3　2-DE gels of holoprotein (A) and low-abundance protein (B) in response to low temperature in alfalfa數(shù)字表示差異點(diǎn)編號 Digits represent spots numbers.

蛋白質(zhì)點(diǎn)序號SpotsNo.蛋白質(zhì)名稱ProteinnameNCBI/Uniprot中序列號AccessionNo.inNCBI/Uniprot植物種類Plantspecies蛋白質(zhì)分子量/等電點(diǎn)Proteinmolecularweight(Da)/Proteinisoelectricpoint蛋白質(zhì)得分Proteinscore1Rubisco活化酶Rubiscoactivasegi|23320705紫花苜蓿Medicagosativa30170.2/5.63100.0002Rubisco活化酶Rubiscoactivasegi|23320705紫花苜蓿Medicagosativa30170.2/5.63100.0003Rubisco活化酶RubiscoactivaseRCAB_HORVU大麥Hordeumvulgare47425.8/7.59100.0004Rubisco活化酶Rubiscoactivasegi|23320705紫花苜蓿Medicagosativa30170.2/5.6398.3085Rubisco活化酶Rubiscoactivasegi|223536483蕁麻Ricinuscommunis52191.7/5.35100.0006Rubisco大亞基結(jié)合蛋白β亞基Rubiscolargesubunit-bindingproteinsub-unitbetaRUBB_PEA豌豆Pisumsativum63287.4/5.8599.5557Rubisco大亞基Rubiscolargesubunitgi|1223773紫花苜蓿Medicagosativa50684.6/6.2294.2688轉(zhuǎn)酮醇酶Transketolasegi|502121526鷹嘴豆Cicerarietinum80412.5/6100.0009轉(zhuǎn)酮醇酶Transketolasegi|502121526鷹嘴豆Cicerarietinum79905.7/6.51100.00010轉(zhuǎn)酮醇酶Transketolasegi|502121526鷹嘴豆Cicerarietinum80412.5/6100.00011S-腺苷-L甲硫氨酸合成酶S-adenosyl-L-methioninesynthetasegi|139478060黃花苜蓿Medicagofalcata43588/5.77100.00012谷氨酸1-半醛轉(zhuǎn)氨酶Glutamate1-semialdehydeaminotransferasegi|345451030紫花苜蓿Medicagosativa50260.5/6.36100.00013非典型蛋白PREDICTED:UncharacterizedproteinLOC101499502gi|502140419鷹嘴豆Cicerarietinum36689.6/6.3100.00014未命名蛋白產(chǎn)物Unnamedproteinproductgi|297746499葡萄Vitisvinifera24323.4/7.6395.924L1Rubisco大亞基Rubiscolargesubunitgi|404243904紫花苜蓿Medicagosativa21709.9/5.78100.000L2肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶Peptidyl-prolylcis-transisomeraseCYP20-3gi|334186198擬南芥Arabidopsisthaliana28403.2/8.9799.831L3真核翻譯起始因子Eukaryotictranslationinitiationfactor5A-2gi|20138664紫花苜蓿Medicagosativa17501.7/5.41100.000L42-半胱氨酸過氧化物還原酶2-CysperoxiredoxinBAS1-likegi|502112098鷹嘴豆Cicerarietinum30698.1/6.12100.000L52-半胱氨酸過氧化物還原酶2-CysperoxiredoxinBAS1-likegi|502112102鷹嘴豆Cicerarietinum29144.1/6.12100.000L65-甲基四氫蝶酰三谷氨酸高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5-methyltetrahydropteroyl-triglutamate-homocysteinemethyltransferaseMETE_ARATH擬南芥Arabidopsisthaliana84645.6/6.09100.000L75-甲基四氫蝶酰三谷氨酸高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5-methyltetrahydropteroyl-triglutamate-homocysteinemethyltransferase-likegi|525345100鷹嘴豆Cicerarietinum84599.7/6.01100.000L8放氧增強(qiáng)蛋白Oxygen-evolvingenhancerproteingi|502153108鷹嘴豆Cicerarietinum35106.8/6.24100.000

(表2)。由鑒定結(jié)果可知，紫花苜蓿葉片蛋白和低豐度蛋白中Rubisco及其變體分別占差異蛋白的50%和12.5%。去除高豐度蛋白后，可檢測出原本被遮蓋或因共遷移影響的蛋白質(zhì)，其蛋白種類可見表2?？梢?，17.5%的PEG可以清除大部分Rubisco，并可應(yīng)用于紫花苜蓿響應(yīng)低溫的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中。

3討論

植物組織中常含有拷貝數(shù)眾多的高豐度蛋白，例如，Rubisco作為光合作用中固定CO2關(guān)鍵酶，一般占蛋白總量的30%~60%，嚴(yán)重影響鄰近蛋白點(diǎn)的識別和其他蛋白點(diǎn)在凝膠電泳中的共同遷移，從而降低了低豐度蛋白的分辨率[17-19]。同樣的，由于高豐度蛋白占據(jù)了樣品中的一大部分，使得在雙向電泳IPG膠條上樣容量一定的情況下，低豐度蛋白的含量受到限制而不易被檢測到[20]。而低豐度蛋白作為細(xì)胞或組織中的受體分子、信號分子等參與基因表達(dá)調(diào)控，往往具有十分重要的功能[19]。因此，如何去除高豐度蛋白以便分離鑒定低豐度蛋白一直是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中亟待解決的問題之一。在以往的文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)，15%~20%PEG可以有效去除植物蛋白中大部分高豐度蛋白，尤其是Rubisco的大亞基，但在不同物種或組織中用于預(yù)分離的PEG濃度是不同的。在一定范圍內(nèi)，高濃度PEG對蛋白質(zhì)的沉淀效率高。Xi等[13]利用16%的PEG去除了擬南芥中大部分高豐度蛋白；王瑩等[21]利用20%PEG提取了水稻葉鞘中的低豐度蛋白；鐘俐等[16]研究發(fā)現(xiàn)15%PEG更適宜于甜瓜葉片的低豐度蛋白提取。本研究表明，適宜的PEG濃度可以去除紫花苜蓿葉片的高豐度蛋白，且這種篩選是十分必要的。PEG濃度過低無法有效沉淀高豐度蛋白(圖2中S1)；濃度過高則易造成蛋白質(zhì)過度沉淀，蛋白質(zhì)點(diǎn)損失(圖2中S3)。本研究中，17.5%PEG能夠清除大部分高豐度蛋白，使原本被遮蓋的蛋白質(zhì)點(diǎn)更易于被檢測到；同時避免了蛋白的過度損失?？梢?，該濃度最適宜紫花苜蓿葉片高豐度蛋白的去除。

為了驗證PEG沉淀法在紫花苜蓿蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的可行性，比較了三氯乙酸/丙酮法與PEG去除葉片高豐度蛋白后響應(yīng)低溫的差異蛋白變化。三氯乙酸/丙酮法是提取植物蛋白質(zhì)的常用方法之一[22-25]，具有降低次生代謝物質(zhì)的干擾、減少蛋白降解等優(yōu)點(diǎn)[26-27]。與其提取的蛋白相比，17.5% PEG去除了大部分Rubisco，并檢測到8個響應(yīng)低溫的新蛋白質(zhì)。其中Rubisco大亞基(點(diǎn)L1)主要參與光合作用過程中CO2的固定；肽酰脯氨酰-順反式異構(gòu)酶(點(diǎn)L2)和真核翻譯起始因子(點(diǎn)L3)參與蛋白質(zhì)的翻譯和折疊加工[25,28-30]；2-半胱氨酸過氧化物還原酶(點(diǎn)L4和L5)響應(yīng)低溫脅迫下機(jī)體內(nèi)部的氧化還原平衡[31]；5-甲基四氫蝶酰三谷氨酸高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(點(diǎn)L6和L7)是一類甲基轉(zhuǎn)移酶，可為S-甲硫氨酸腺苷途徑提供底物；而放氧增強(qiáng)蛋白(點(diǎn)L8)作為獲光復(fù)合體的組成元件，能通過激發(fā)葉綠素而獲得更多的光能，并把能量轉(zhuǎn)移到光化反應(yīng)中心，有助于增強(qiáng)低溫逆境下的光合作用效率[32]。這些新發(fā)現(xiàn)的蛋白點(diǎn)在紫花苜蓿葉片中由于高豐度蛋白遮蓋而無法檢測到?？梢?，利用17.5%PEG去除高豐度蛋白在紫花苜蓿蛋白質(zhì)組學(xué)研究中有實際的應(yīng)用意義，有助于低豐度蛋白的檢測。該方法也可用于紫花苜蓿生長發(fā)育或逆境應(yīng)答的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，有助于功能蛋白的分析與鑒定。

4結(jié)論

高豐度蛋白影響了紫花苜蓿葉片中低豐度蛋白的鑒定。本研究采用PEG沉淀法，比較了0，15%，17.5%和20%的PEG對高豐度蛋白的分離情況，結(jié)果顯示，17.5%的PEG最適宜用于紫花苜蓿葉片高豐度蛋白的去除。此法應(yīng)用于紫花苜蓿低溫應(yīng)答的差異蛋白鑒定中，獲得8個新差異蛋白，證明其適用于紫花苜蓿的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

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