賈雙雙，徐坤

(1.安徽科技學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018)

南方根結(jié)線蟲侵染對不同抗性番茄砧木滲調(diào)物質(zhì)及羥脯氨酸含量的比較

賈雙雙1,2，徐坤2*

(1.安徽科技學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018)

摘要：為探討番茄砧木對南方根結(jié)線蟲的抗性生理機(jī)制，以高感砧木Ls-89與高抗砧木坂砧2號為試材，采用盆栽人工接種線蟲二齡幼蟲法，研究了南方根結(jié)線蟲侵染對不同抗性番茄砧木幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及細(xì)胞壁羥脯氨酸含量的影響。研究表明，未接種南方根結(jié)線蟲的番茄砧木幼苗，其根系與葉片可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)與細(xì)胞壁羥脯氨酸含量變化并未因品種抗性不同而有顯著差異(P>0.05)；接種南方根結(jié)線蟲后，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量與細(xì)胞壁羥脯氨酸含量變化規(guī)律基本一致，均呈周期性升高，且坂砧2號升幅顯著高于Ls-89(P<0.05)。據(jù)此認(rèn)為，可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸、細(xì)胞壁羥脯氨酸等物質(zhì)的含量變化均與番茄砧木幼苗對南方根結(jié)線蟲的抗性密切相關(guān)，可作為評判植株抗性的綜合指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：番茄；砧木幼苗；南方根結(jié)線蟲；滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)；細(xì)胞壁羥脯氨酸

DOI：10.11686/cyxb2014333

Jia S S, Xu K. The effects ofMeloidogyneincognitainfection on osmolyte and hydroxyproline levels in tomato rootstock seedlings with different resistance. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(7): 123-130.

賈雙雙， 徐坤. 南方根結(jié)線蟲侵染對不同抗性番茄砧木滲調(diào)物質(zhì)及羥脯氨酸含量的比較. 草業(yè)學(xué)報, 2015, 24(7): 123-130.

http://cyxb.lzu.edu.cn

收稿日期：2014-08-20；改回日期：2014-12-10

基金項目：安徽省教育廳項目(KJ2013B078)，安徽科技學(xué)院引進(jìn)人才項目(ZRC2013351),山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新體系(SDAIT-02-022-05)和山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新項目(31648)資助。

作者簡介：賈雙雙(1984-)，女，河北趙縣人，講師，博士。E-mail：jiashuang84@163.com

通訊作者*Corresponding author. E-mail：xukun@sdau.edu.cn

Abstract:In order to clarify the physiological resistance mechanism of tomato rootstock to Meloidogyne incognita, both a highly susceptible rootstock variety Ls-89 and a highly resistant rootstock variety Banzhen No.2 were planted in pots and inoculated with second instar larvae to study the effects of M. incognita infection on osmolyte levels and cell wall hydroxyproline contents of these differentially resistant tomato rootstock varieties. Without M. incognita inoculation, there was no significant difference (P>0.05) between seedlings of the two varieties in concentrations of osmoregulation substances, including soluble sugar, soluble protein, proline and cell wall hydroxyproline. After inoculation, the concentrations of osmoregulation substances and cell wall hydroxyproline contents were increased in roots and leaves in seedlings of the two varieties, with the responses in Banzhen No.2 being significantly higher (P<0.05) than those of Ls-89. These results indicate that changes in soluble sugar, soluble protein, proline and cell wall hydroxyproline concentrations are closely associated with the resistance of tomato rootstock seedlings to M. incognita, and could be used as general indices of plant resistance elevation.

The effects ofMeloidogyneincognitainfection on osmolyte and hydroxyproline levels in tomato rootstock seedlings with different resistance

JIA Shuang-Shuang1,2, XU Kun2*

1.CollegeofLifeScience,AnhuiScienceandTechnologyUniversity,Fengyang233100,China; 2.CollegeofHorticultureScienceandEngineering,ShandongAgriculturalUniversity,Tai’an271018,China

Key words: tomato (Lycopersiconesculentum); rootstock seedlings;Meloidogyneincognita; osmoregulation substance; cell wall hydroxyproline

植物寄生線蟲病是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要病害之一，已在世界范圍內(nèi)引發(fā)巨大經(jīng)濟(jì)損失[1-2]，因此，前人對植物線蟲病的防治方法[3-4]、抗性機(jī)制[5]等進(jìn)行了較多的研究。前人研究表明，植物寄生線蟲病不僅顯著降低根系吸收能力[6]，影響根系活力[7-8]，還顯著降低葉片葉綠素含量[9-10]。談家金等[11]研究表明，松材線蟲侵染使黑松(Pinusthunbergii)幼苗莖部可溶性糖與可溶性蛋白含量降低，并認(rèn)為可溶性蛋白含量可用于病害的早期診斷；而郝玉金等[12]研究發(fā)現(xiàn)，山定子(Malusbaccata)接種南京毛刺線蟲后，根尖游離脯氨酸與還原糖含量呈現(xiàn)不同程度的增加，而總糖含量卻降低。

富含羥脯氨酸糖蛋白(hydroxyproline-rich glycoprotein，HRGP)是高等植物細(xì)胞壁中特有的一種結(jié)構(gòu)蛋白，廣泛存在于植物中。近年來研究發(fā)現(xiàn)，它與植物的抗病性存在密切關(guān)系[13]。其羥脯氨酸(Hyp)含量高是這類糖蛋白的特點之一，且細(xì)胞壁中HRGP含量與Hyp含量呈正相關(guān)[14]，因此，對羥脯氨酸(Hyp)含量的測定，在某種程度上代表了HRGP的含量。翟衡等[15]研究發(fā)現(xiàn)，不同抗性蘋果砧木接種南京毛刺線蟲后，根尖組織細(xì)胞壁中Hyp含量均有不同程度的增加，且抗性砧木的增加幅度均大于感病砧木，并認(rèn)為Hyp含量的增加可能是蘋果砧木抵御南京毛刺線蟲的一種防御機(jī)制。趙小釩和弭忠祥[16]也發(fā)現(xiàn)，不同抗性大豆(Glycinemax)品種感染灰斑病后，抗病品種葉片細(xì)胞壁中Hyp無論是積累含量還是維持時間均顯著高于感病品種，并認(rèn)為Hyp含量的積累與大豆對灰斑病的抗性密切相關(guān)。

番茄(Lycopersiconesculentum)是我國設(shè)施栽培面積最大的蔬菜之一，因其復(fù)種指數(shù)高、連作重茬栽培較為普遍，致使番茄根結(jié)線蟲病頻發(fā)[17-18]。Lopez-Perez等[19]、Rivard和Louws[20]指出，采用抗性品種和利用抗性砧木嫁接栽培將成為最具潛力的防控作物根結(jié)線蟲病的有效方法，但不同抗性番茄砧木對南方根結(jié)線蟲的反應(yīng)不同，而且關(guān)于番茄砧木抗南方根結(jié)線蟲的生理機(jī)制研究甚少。泰勒和薩塞[21]指出，在適宜的環(huán)境條件下，根結(jié)線蟲的生活周期為30 d左右。由于植物苗期是對逆境脅迫最為敏感的時期，在植物生長早期進(jìn)行抗性篩選鑒定較為容易[22]，因此，本試驗在前文[23]研究基礎(chǔ)上，選用2個抗南方根結(jié)線蟲水平顯著不同的番茄砧木為試材，研究南方根結(jié)線蟲一個侵染周期內(nèi)，幼苗根系與葉片中可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及細(xì)胞壁Hyp的變化動態(tài)，旨在探討滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及細(xì)胞壁Hyp積累與番茄砧木幼苗抗南方根結(jié)線蟲的關(guān)系，為進(jìn)一步研究番茄砧木抗線蟲生理機(jī)制及抗性砧木的篩選鑒定提供理論參考。

1材料與方法

1.1　試驗材料

試驗于2011-2012年在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝實驗站進(jìn)行，供試番茄砧木為抗南方根結(jié)線蟲水平顯著不同的2個品種Ls-89(高感)、坂砧2號(高抗)[23]。種子浸種催芽后，播于50孔穴盤內(nèi)，播后置日光溫室培養(yǎng)。幼苗長至3～4片真葉時，移植于直徑25 cm、高18 cm的塑料盆中，每盆2株，每品種栽植180盆，每30盆為一個處理小區(qū)，其中3個小區(qū)接種南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲，另3個小區(qū)為對照，隨機(jī)區(qū)組排列，重復(fù)3次。盆內(nèi)栽培基質(zhì)(砂∶土=1∶2)經(jīng)160℃高溫殺菌2 h。

1.2　接種取樣

移栽番茄砧木幼苗緩苗后，在幼苗根圍打孔(5孔/盆)，將南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲按5000條/盆注入，對照注入等量清水，然后用土掩埋。

分別于接種南方根結(jié)線蟲后第0，1，3，7，14，21，28，35 天取樣，每次每小區(qū)隨機(jī)取3株，將根系及葉片用流水洗凈，擦去表面水分后，投入液氮中，帶回實驗室進(jìn)行相應(yīng)生理指標(biāo)的測定，同時調(diào)查計算根結(jié)指數(shù)和病情指數(shù)。

1.3　測定指標(biāo)和方法

1.3.1抗病指標(biāo)的測定參照毛愛軍等[24]制定的標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查番茄幼苗發(fā)病情況，并計算病情指數(shù)(disease index，DI)。0級：植株根部無根瘤；1級：植株根部形成1~2個根瘤；2級：植株根部形成3~10個根瘤；3級：植株根部形成11~30個根瘤；4級：植株根部形成31~100個根瘤；5級：植株根部形成根瘤數(shù)超過100個。

DI=∑(各病級植株數(shù)×該級數(shù))/(調(diào)查總株數(shù)×最重病級數(shù)值)×100

采用Boiteux和Charchar[25]的方法計算根結(jié)指數(shù)(gall index，GI)，GI=單株根結(jié)數(shù)/單株根鮮重(g)。

1.3.2可溶性糖含量的測定按照趙世杰等[26]的方法進(jìn)行，采用蒽酮比色法進(jìn)行提取和測定，于630 nm下比色。

1.3.3可溶性蛋白含量的測定按照趙世杰等[26]的方法進(jìn)行，采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行提取和測定，于595 nm下比色。

1.3.4脯氨酸(Pro)含量的測定按照趙世杰等[26]的方法進(jìn)行，采用磺基水楊酸—酸性茚三酮法進(jìn)行提取和測定，于520 nm下比色。

1.3.5細(xì)胞壁羥脯氨酸(Hyp)含量的測定按照馮潔等[27]的方法制備細(xì)胞壁干樣，按照Shailasree等[28]的方法測定細(xì)胞壁Hyp含量。取細(xì)胞壁干樣20 mg，懸浮于5 mL 6 mol/L HCl中，110℃酸解18 h。取酸解液2 mL，用1 mol/L KOH溶液調(diào)pH值至7.0，加1 mL pH 8.7 0.8 mol/L硼酸緩沖液和2 mL 0.2 mol/L氯胺T，室溫下反應(yīng)25 min，加2 mL 3.6 mol/L Na2S2O3溶液終止反應(yīng)，加2 g KCl飽和后用3 mL甲苯萃取，棄甲苯層，于沸水浴中加熱30 min，冷卻后加4 mL甲苯再次萃取，取甲苯層2 mL與1 mL對甲氨基苯甲醛(DAMB)試劑室溫顯色20 min，560 nm處測定OD值，計算Hyp含量。

1.4　數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2003與SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計分析。

2結(jié)果與分析

2.1　接種南方根結(jié)線蟲對不同抗性番茄砧木幼苗發(fā)病情況的影響

從表1可以看出，接種南方根結(jié)線蟲后7 d，高感品種Ls-89幼苗根系已形成少量根結(jié)，說明線蟲已侵入根系，其后，隨侵染時間的延長，Ls-89的根結(jié)指數(shù)(GI)與病情指數(shù)(DI)均迅速升高，至接種后35 d時，其GI與DI分別高達(dá)30.45和96.67；而高抗品種坂砧2號直至接種28 d后，植株根系才出現(xiàn)根結(jié)，且其GI與DI分別僅為0.15和9.67，接種后35 d，分別為0.44和26.67。

2.2　南方根結(jié)線蟲侵染對番茄砧木幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

2.2.1幼苗根系與葉片可溶性糖含量的變化Ls-89與坂砧2號未接種根結(jié)線蟲的對照幼苗根系與葉片可溶性糖含量逐漸升高(圖1)，且坂砧2號顯著高于Ls-89(P<0.05)。接種后，Ls-89與坂砧2號根系與葉片可溶性糖含量均隨著侵染發(fā)生顯著性變化，至接種后7 d，根系可溶性糖含量均達(dá)峰值，兩砧木分別較其對照增加65.60%和106.01%(P<0.01)，之后迅速降低，至28 d時降至最低，隨后于35 d因二次侵染又有所升高，在整個侵染進(jìn)程中，坂砧2號始終顯著高于Ls-89(P<0.05)。接種后，Ls-89與坂砧2號葉片可溶性糖含量均在21 d達(dá)到峰值，分別較其對照增加46.80%和83.44%(P<0.01)。

表1　接種南方根結(jié)線蟲后供試番茄砧木幼苗發(fā)病情況比較

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note：Different small letters in the same column mean significant difference at 0.05 level, different capital letters mean extremely significant difference at 0.01 level.

圖1　南方根結(jié)線蟲對番茄砧木幼苗根系和葉片可溶性糖含量的影響Fig.1　Effect of M. incognita on soluble sugar content in roots and leaves of tomato rootstock seedlings　S′與R′分別表示接種南方根結(jié)線蟲的Ls-89與坂砧2號，S與R分別表示其對照，下同。S′ and R′ represent Ls-89 and Banzhen No.2 inoculated with M. incognita, respectively, S and R represent that of the control, respectively. The same below.

2.2.2幼苗根系與葉片可溶性蛋白含量的變化圖2可以看出，Ls-89與坂砧2號未接種根結(jié)線蟲的對照幼苗根系與葉片可溶性蛋白含量差異不顯著(P>0.05)。接種后7 d，Ls-89與坂砧2號根系可溶性蛋白含量均達(dá)峰值，分別較其對照增加172.88%和198.75%(P<0.01)；而葉片則在接種后14 d達(dá)到峰值，分別較其對照增加48.67%和74.68%(P<0.05)。

圖2　南方根結(jié)線蟲對番茄砧木幼苗根系和葉片可溶性蛋白含量的影響Fig.2　Effect of M. incognita on soluble protein content in roots and leaves of tomato rootstock seedlings

2.2.3幼苗根系與葉片脯氨酸含量的變化圖3所示，未接種根結(jié)線蟲的Ls-89與坂砧2號對照幼苗根系與葉片Pro含量變化不大，且差異不顯著(P>0.05)。接種3 d，Ls-89與坂砧2號根系Pro含量均達(dá)峰值，分別較其對照增加166.30%和242.86%(P<0.01)，而葉片均在接種后14 d達(dá)到峰值，分別較其對照增加73.90%和108.68%(P<0.01)。

圖3　南方根結(jié)線蟲對番茄砧木幼苗根系和葉片脯氨酸含量的影響Fig.3　Effect of M. incognita on proline content in roots and leaves of tomato rootstock seedlings

2.2.4幼苗根系與葉片細(xì)胞壁Hyp含量的變化圖4所示，未接種根結(jié)線蟲的Ls-89與坂砧2號幼苗根系與葉片細(xì)胞壁Hyp含量變化基本穩(wěn)定，且差異不顯著(P>0.05)，但根系顯著高于葉片(P<0.05)。接種后，Ls-89和坂砧2號根系與葉片細(xì)胞壁Hyp含量發(fā)生劇烈變化，至7 d時，兩砧木根系細(xì)胞壁Hyp含量達(dá)峰值，分別較其對照增加91.79%和133.33%(P<0.01)，之后迅速降低，至接種后28 d降至低谷，隨后因二次侵染又有所升高。接種后至7 d，Ls-89葉片細(xì)胞壁Hyp含量逐漸升高，7~21 d間又稍有降低，至28 d達(dá)峰值，較其對照增加96.44%(P<0.01)；而坂砧2號于侵染后14 d達(dá)峰值，較其對照增加109.62%(P<0.01)。整個侵染過程中，坂砧2號根系與葉片細(xì)胞壁Hyp含量均高于Ls-89。

圖4　南方根結(jié)線蟲對番茄砧木幼苗根系和葉片羥脯氨酸含量的影響Fig.4　Effect of M. incognita on Hyp content in roots and leaves of tomato rootstock seedlings

3討論

3.1　南方根結(jié)線蟲對不同抗性番茄砧木幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

可溶性糖、可溶性蛋白與脯氨酸等均是植物體內(nèi)適應(yīng)逆境脅迫的重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，與植物抗性密切相關(guān)[10,29-32]。劉大偉等[33]研究表明，不同抗性大豆品種接種大豆胞囊線蟲后，抗病品種可溶性糖含量低于感病品種，而可溶性蛋白含量則相反。Lewis和McClure[34]研究發(fā)現(xiàn)，不同抗性棉花(Gossypiumhirsutum)品種遭受南方根結(jié)線蟲侵染后，根系脯氨酸含量增加，但感病品種增幅顯著高于抗病品種。而本研究結(jié)果表明，接種南方根結(jié)線蟲后，高感砧木Ls-89與高抗砧木坂砧2號根系與葉片可溶性糖、可溶性蛋白與脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量升高，這與劉業(yè)霞等[35]的研究結(jié)果一致，與談家金等[11]相反，且坂砧2號升幅顯著高于Ls-89(P<0.05)，這與Lewis和McClure[34]的研究結(jié)果相反。這可能是因為抗病砧木可以通過調(diào)節(jié)體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量來調(diào)節(jié)代謝平衡，延緩根結(jié)線蟲侵害，而感病砧木隨著線蟲侵染，根結(jié)指數(shù)與病情指數(shù)持續(xù)增長，植株生長受抑制，可用滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)減少，無法正常調(diào)節(jié)代謝平衡。

3.2　南方根結(jié)線蟲對不同抗性番茄砧木幼苗細(xì)胞壁Hyp含量的影響

細(xì)胞壁富含羥脯氨酸糖蛋白，與植物的抗病性存在密切關(guān)系，目前已在多種植物病害中證實[13]。Esquerre-Tugaye等[36]研究認(rèn)為，甜瓜(Cucumismelo)幼苗感染炭疽病后，莖部細(xì)胞壁Hyp含量增加；Sujeeth等[37]研究發(fā)現(xiàn)，不同抗性珍珠粟(Pennisetumglaucum)幼苗感染霜霉病后，抗病品種胚芽鞘細(xì)胞壁Hyp含量顯著高于感病品種。本研究結(jié)果也證實，不同抗性番茄砧木幼苗接種南方根結(jié)線蟲后，根系與葉片細(xì)胞壁Hyp含量升高，且高抗砧木坂砧2號顯著高于高感砧木Ls-89(P<0.05)。

4結(jié)論

不同抗性番茄砧木幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)差異不大，而遭受南方根結(jié)線蟲侵染后，可溶性糖、可溶性蛋白與脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量迅速升高，細(xì)胞壁也隨之積累較多的羥脯氨酸，且均以高抗砧木坂砧2號顯著高于高感砧木Ls-89(P<0.05)。說明高抗砧木可通過較高含量的可溶性糖、可溶性蛋白及脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，細(xì)胞壁也通過積累較多的羥脯氨酸來調(diào)節(jié)代謝平衡，延緩根結(jié)線蟲侵害。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)與細(xì)胞壁羥脯氨酸含量的增加是番茄砧木幼苗抗根結(jié)線蟲的機(jī)制之一。

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