崔月明　胡庭俊　秦津等

摘要：研究馬尾藻多糖脂質(zhì)體對南美白對蝦免疫功能及抗病毒活性的影響。首先，選用72尾SPF南美白對蝦，分為脂質(zhì)體組和對照組，飼喂7 d后，測血淋巴上清中總蛋白含量，酚氧化酶、溶菌酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活性；然后，選用2批180尾SPF南美白對蝦分別觀察多糖脂質(zhì)體對感染白斑綜合征病毒或桃拉病毒對蝦的保護作用，將180尾對蝦隨機分為6組，設(shè)空白對照組、陽性對照組，藥物陽性對照組和高、中、低3個脂質(zhì)體劑量組，飼喂7 d后攻毒，攻毒后觀察7 d，記錄發(fā)病數(shù)、死亡數(shù)。結(jié)果表明，在免疫試驗中，脂質(zhì)體組酚氧化酶、溶菌酶和堿性磷酸酶的活性極顯著升高；在抗病毒保護試驗中，多糖脂質(zhì)體各劑量均能提高南美白對蝦的存活率，高劑量組存活率最高。說明馬尾藻多糖脂質(zhì)體對南美白對蝦具有免疫促進作用，并能提高其抗病力。

關(guān)鍵詞：馬尾藻多糖；脂質(zhì)體；南美白對蝦；免疫；病毒病

中圖分類號：S945.4+9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0323-03

收稿日期：2014-11-20

基金項目：廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃（編號：桂科攻0992014-6）。

作者簡介：崔月明（1980—），女，河南南陽人，博士研究生，講師，研究方向多糖免疫藥理學(xué)。E-mail：870180417@qq.com。

通信作者：胡庭俊，博士，教授，研究方向為中藥免疫藥理學(xué)。E-mail：tingjunhu@126.com。對蝦白斑綜合征（WSS）和桃拉綜合征（TS）是危害我國對蝦養(yǎng)殖業(yè)最多的兩大病毒病，其大面積的暴發(fā)嚴(yán)重危害了對蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。2001—2006年對南美白對蝦養(yǎng)殖的主產(chǎn)地10個省份的流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，在所有檢測到的病毒性疾病中白斑綜合征病毒（WSSV）占63.84%，桃拉綜合征病毒（TSV）占32.74%，成為危害最大的2種病毒病，并且其死亡率也呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢[1]。2009—2010年在福建、海南和廣東的流行病學(xué)調(diào)查中，對蝦WSSV的陽性結(jié)果占27.1%，它和傳染性皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV）同時呈現(xiàn)陽性的占16.95%[2]。針對這種病毒性疾病的大面積暴發(fā)，目前還沒有有效的救治方法，因此對病毒病的有效防治已成為對蝦養(yǎng)殖中的最主要問題[3]。對蝦和其他無脊椎動物一樣， 缺乏脊椎動物特異的抗原/抗體免疫反應(yīng)機制， 雖然一些病毒的重組蛋白能夠誘導(dǎo)特異的免疫反應(yīng)，但這種保護作用只是暫時的[4]，因此完全寄希望于通過疫苗免疫來控制蝦病是不切實際的。目前對病毒病的防治還是以防為主，報道稱中草藥類多糖、生物堿、有機酸、酮類等以及益生菌能激活對蝦的免疫系統(tǒng)， 增強抗病力，從而達(dá)到防病治病的目的[5]。楊明用烏梅為主要材料的中藥抗病毒復(fù)方飼喂南美白對蝦，其中2%劑量的試驗組促進對蝦的生長最明顯，酚氧化酶（PO）和過氧化物酶活性亦大大提高，表明中藥復(fù)方能提高對蝦的非特異性免疫力；在WSSV感染試驗中，免疫保護率更是達(dá)到61.98%，效果極顯著[6]。

馬尾藻多糖（SP）作為海藻中一類具有較高抗病毒活性的硫酸多糖，添加在飼料中，不僅能促進南美白對蝦的生長，而且對甲殼動物的酚氧化酶系統(tǒng)具有激活作用，能提高南美白對蝦酸性磷酸酶（ACP）、 超氧化物歧化酶（SOD）及溶菌酶（LSZ）活性，并且在感染W(wǎng)SSV后，使免疫保護率從28%提高到74%[7]。脂質(zhì)體是將藥物包封于類脂質(zhì)雙分子層而制成的一種超微型球狀藥物載體制劑，結(jié)構(gòu)類似生物膜，和靶細(xì)胞之間可通過內(nèi)吞、融合、接觸釋放、吸附、脂質(zhì)交換等方式起作用，具有減少藥物治療劑量、降低藥物毒性、減輕變態(tài)反應(yīng)和免疫反應(yīng)、延緩釋放、靶向給藥等優(yōu)點[8]。多糖脂質(zhì)體作為免疫增強劑在提高對蝦的非特異性免疫，增強對病毒性疾病的抵抗力方面，目前國內(nèi)外都未見報道。馬尾藻多糖脂質(zhì)體納米制劑（SPL）是將溶解的馬尾藻多糖包封于磷脂雙層膜中，形成穩(wěn)定的球形納米乳劑。本試驗通過在南美白對蝦飼料中添加SPL，測定對蝦血淋巴液上清中總蛋白（TP）含量，酚氧化酶、溶菌酶、堿性磷酸酶（ALP）和酸性磷酸酶的活性，探討SPL對南美白對蝦非特異性免疫功能的調(diào)節(jié)作用；而后人工感染W(wǎng)SSV和TSV，觀察SPL對南美白對蝦抗病力的影響，評價SPL作為免疫增強劑在對蝦養(yǎng)殖中的作用，為SPL的進一步推廣應(yīng)用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1藥物0.5%馬尾藻多糖脂質(zhì)體納米制劑，由廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院制備。對照藥：鹽酸左旋咪唑+黃芪多糖可溶性粉，湖南湘大獸藥有限公司生產(chǎn)，商品名為瘟毒清，生產(chǎn)批號為20110680。

1.1.2試驗動物SPF南美白對蝦的幼蝦500尾，取自廣西水產(chǎn)研究所南美白對蝦企沙養(yǎng)殖基地，暫養(yǎng)7 d后量體長、稱質(zhì)量，體長為（4.5±0.55） cm，體質(zhì)量為（0.69±0.31） g，挑選規(guī)格基本一致的用于試驗。

1.1.3飼料對蝦飼料為豆粕、魚粉、面粉、蝦粉、魚油、麥麩、多維多礦、大豆磷酯組成的對蝦基礎(chǔ)飼料，試驗組按不同劑量將SPL噴涂于飼料上。

1.1.4病毒對蝦白斑病綜合征病毒、桃拉綜合征病毒均由廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)研究所保存，二者的TCID50均為10-6。

1.2試驗方法

1.2.1試驗分組及處理將72尾SPF南美白對蝦分為2組——對照組和SPL組。對照組飼喂基礎(chǔ)飼料，SPL組飼料添加SPL 50 mL/kg，連續(xù)飼喂7 d。2組分別飼養(yǎng)于150 cm×80 cm×60 cm的水族箱內(nèi)，上午、下午各投料1次（按對蝦體質(zhì)量的5%投料），常溫下喂養(yǎng)。

1.2.2血淋巴液制備用藥后8 d，用帶5號針頭的1 mL注射器自蝦的頭胸甲后插入心臟取血淋巴液0.3 mL，置于 Eppendorf 管中，4 ℃冷藏，3 000 r/min 離心10 min，取上清用于免疫指標(biāo)測定。

1.2.3免疫指標(biāo)測定用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定對蝦血淋巴液上清中總蛋白含量，以及溶菌酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活力；酚氧化酶活性用改進的Ashida方法[9]，以L-dopa為底物，反應(yīng)時間6 min，測定490 nm下的吸光度。

1.2.4攻毒保護試驗將360尾SPF南美白對蝦分成2大組，分別做SPL對WSSV和TSV的攻毒保護試驗。將每大組的180尾SPF南美白對蝦隨機分為6組， 每組30尾，分別是空白對照組、病毒陽性對照組、藥物對照組以及多糖脂質(zhì)體納米制劑的高（200 mL/kg）、中（100 mL/kg）、低（50 mL/kg）劑量組，分別飼養(yǎng)于150 cm×80 cm×60 cm的水族箱內(nèi)。上午、下午各投料1次（按對蝦體質(zhì)量的5%投料），在常溫下喂養(yǎng)7 d，飼喂8 d時按100倍TCID50的病毒量進行攻毒試驗。攻毒后觀察7 d，記錄發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)，計算相對保護率：相對保護率=（1-試驗組死亡率/病毒對照組死亡率）×100%。

1.2.5數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 16.0 進行數(shù)據(jù)的顯著性檢驗，免疫指標(biāo)用獨立性t檢驗，抗病毒保護試驗用χ2檢驗。

2結(jié)果與分析

2.1SPL對南美白對蝦相關(guān)免疫指標(biāo)的影響

SPL對SPF南美白對蝦免疫指標(biāo)的影響結(jié)果見表1。添加SPL的試驗組總蛋白含量與對照組差異不顯著，而其余的相關(guān)免疫酶活性均有較大的改變，其中酸性磷酸酶活性極顯著降低（P<0.01），酚氧化酶、溶菌酶和堿性磷酸酶活性極顯著升高（P<0.01）。

2.2SPL對人工感染W(wǎng)SSV的南美白對蝦的抗感染保護作用

在對蝦飼料中添加SPL后，高、中、低劑量組與病毒對照組相比都降低了發(fā)病率和死亡率。其中藥物對照組和SPL中劑量組的死亡數(shù)顯著減少（P<0.05），SPL高劑量組死亡數(shù)極顯著減少（P<0.01），相對保護率最高，達(dá)到16.67%（表2）。

2.3SPL對人工感染TSV的南美白對蝦的抗感染保護作用

由表3可見，在飼料中添加中、高劑量的SPL能顯著提高南美白對蝦對TSV的抵抗力，使發(fā)病數(shù)顯著降低（P<0.05）。SPL組的相對保護率均高于藥物對照組，其中高劑量組最高，達(dá)到26.93%。

3討論

對蝦屬于甲殼動物，其免疫防御系統(tǒng)由基本防御屏障（甲殼和表皮）、細(xì)胞防御屏障（血淋巴細(xì)胞免疫）和生理防御屏障（體液免疫）3個部分組成。對蝦的體液免疫包含水解和氧化等酶類、凝集素、抗菌肽、溶菌酶等體液免疫因子，它們在甲殼動物的體液免疫過程中發(fā)揮著很大的作用，使得甲殼動物能識別非己物質(zhì)，抵抗病原體的侵襲。

對蝦的酚氧化酶系統(tǒng)（proPO）作為一種非特異性識別體系是先天性體液免疫的重要組成之一，無論從組成、激活方式還是免疫功能上，都非常類似于高等動物的補體系統(tǒng)，主要是通過酚氧化酶原激活系統(tǒng)、抗菌肽和凝集素等的作用達(dá)到抗病抑菌及消除異物的目的。本研究發(fā)現(xiàn)，在對蝦飼料中添加50 mL/kg 劑量的SPL可以極顯著增強南美白對蝦血淋巴上清中的PO活性，與對照組相比PO活性提高2倍以上，說明SPL能夠有效刺激大顆粒細(xì)胞脫顆粒，從而釋放出酚氧化酶原激活系統(tǒng)的各種組分，參與免疫識別及免疫防御反應(yīng)。

溶菌酶是對蝦血細(xì)胞吞噬異物后分泌的一些堿性蛋白質(zhì)，主要水解細(xì)菌細(xì)胞壁的糖苷鍵，引起細(xì)菌細(xì)胞裂解死亡，破壞和消除侵入體中的異物。本試驗結(jié)果顯示，飼喂含SPL的飼料7 d后，LSZ的活力極顯著升高。與劉小玲等研究的樺褐孔菌多糖以及覃振林等研究的馬齒莧對對蝦非特異性免疫的效果[10-11]一致。

磷酸酶可以催化磷酸單脂的水解反應(yīng)和磷酸基團的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，從而將表面帶有磷酸單酯的異物破壞降解。依據(jù)它們起催化作用的最適pH值不同，分為堿性磷酸酶和酸性磷酸酶。在本試驗中，同時測定了對蝦血淋巴上清液中ALP與ACP的活性，與對照組相比均有極顯著差異，說明SPL影響了磷酸酶的分泌和活性。其中ALP是極顯著升高，與大多數(shù)相關(guān)的研究結(jié)果[10，12]一致，而ACP的含量卻是極顯著降低，這可能與飼喂時間以及對蝦的生長期有關(guān)。李桂英等在對蝦飼料中添加腸道益生菌后發(fā)現(xiàn)，根據(jù)飼喂的時間不同，ACP的活性在各個時間點有較大的差異，在第10天達(dá)到最高，之后就下降了[13]；王新霞用β-葡聚糖飼喂幼蝦，在第9天的時候活性明顯升高，而在第14天測定時活性就下降了，甚至低于對照組[14]。除了時間因素外，還可能與脂質(zhì)體的主要組成是磷脂和膽固醇有關(guān)，因為磷脂可被磷酸酶水解，二者之間可以發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。所以，本研究測定的ACP含量降低的原因還需要進一步探討。

病毒感染對蝦之后，會引起對蝦的免疫防御反應(yīng)[15-16]。WSSV可感染對蝦顆粒細(xì)胞，使超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和誘導(dǎo)性一氧化氮合成酶的活性顯著降低[17]；WSSV也能使對蝦的酚氧化酶體系明顯上調(diào)，對蝦痊愈后其酚氧化酶活性降到正常值[18]，暗示病毒也會激活酚氧化酶體系，進而啟動對蝦的免疫反應(yīng)。在TSV感染2～3 d后，對蝦總淋巴細(xì)胞數(shù)、透明細(xì)胞數(shù)、半顆粒細(xì)胞數(shù)及顆粒細(xì)胞數(shù)都有大幅度下降，SOD、PO活性分別下降了約 25%、68%，這表明TSV可能通過降低對蝦血液學(xué)免疫力而實現(xiàn)其高致病性[19]。Chang等研究發(fā)現(xiàn)，多糖類物質(zhì)（如β-葡聚糖、脂多糖、肽聚糖等）能有效激活對蝦的酚氧化酶系統(tǒng)，進而提高對蝦自身的免疫水平，抑制體內(nèi)病毒擴增，阻止未帶毒個體染病，從而預(yù)防控制WSSV感染[20]。本研究利用具有抗病毒活性的馬尾藻硫酸多糖制成的脂質(zhì)體納米制劑作為免疫增強劑，觀察對WSSV和TSV感染后對蝦的保護作用發(fā)現(xiàn)，SPL高劑量組可以極顯著減少病死蝦的數(shù)量，對WSSV感染后保護率達(dá)1667%，對TSV感染后保護率達(dá)26.93%。

本試驗結(jié)果顯示，飼料添加SPL 50 mL/kg，能顯著提高南美白對蝦的酚氧化酶、溶菌酶、堿性磷酸酶活性，對對蝦的非特異性免疫具有免疫促進作用。在人工感染W(wǎng)SSV和TSV后，高、中、低劑量的SPL對南美白對蝦均有一定的保護作用，效果優(yōu)于對照藥物瘟毒清，其中高劑量組保護效果最好。說明脂質(zhì)體作為一種新型的藥物制劑，可以增強甲殼類動物的免疫活性，提高其抗病毒能力，有作為綠色免疫增強劑開發(fā)的潛力。

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