尹燕超，蘇　濤，趙　剛，于　靜，王艷艷，王佳琦

(佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154007)

?

臭氧水對口腔潰瘍的實驗研究①

尹燕超，蘇濤，趙剛，于靜，王艷艷，王佳琦

(佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154007)

摘要：目的：探討大鼠口腔潰瘍模型在臭氧水溶液的影響下，頰黏膜上皮中β-防御素-2(BD-2)的表達及變化。方法：利用冰醋酸燒灼黏膜的方法建立大鼠的口腔潰瘍模型，并設立空白組、自愈組及實驗組，分別于第3天、第6天、第9天時，取各組大鼠的口腔潰瘍處的黏膜組織，制備組織切片，并采用免疫組化的方法檢測β-防御素-2在上皮中的表達，記錄愈合時間。結果：BD-2在各組中均發(fā)生表達，臭氧水組BD-2的表達率高于自愈組，對照組BD-2的表達率最低；臭氧水組愈合時間短于自愈組。結論：臭氧水可以促進潰瘍的愈合，縮短其愈合時間，增強BD-2的表達。

關鍵詞:口腔潰瘍;β-防御素-2;口腔黏膜;臭氧水溶液

復發(fā)性口腔潰瘍(recurrent oral ulceration，ROU)目前發(fā)病機制尚不清楚,認為與免疫、遺傳、環(huán)境等因素有關,口腔黏膜免疫系統(tǒng)可能起重要作用?？谇火つた梢灾苯赢a生免疫效應分子對抗病原微生物,或通過信號轉導方式引發(fā)黏膜獲得性免疫反應, 直接或間接介導黏膜的保護。而β-防御素(bate-defensins，BDs)是上皮分泌的小分子抗微生物多肽，對口腔上皮系統(tǒng)形成天然免疫防御作用，對病原體特別是 G-菌和真菌，有直接殺傷作用，還和其他蛋白酶有協(xié)同作用，是口腔黏膜上皮化學屏障的重要組成部分。BD-2是β-防御素家族中具有代表性的多肽，而據(jù)文獻記載其表達隨炎癥程度或外來刺激的變化而改變，但在口腔黏膜中的表達方式及其與外來因素的關系尚不明確，本研究傳統(tǒng)冰醋酸燒灼的方法建立ROU模型，檢測在臭氧說溶液的影響下BD-2的表達變化，從分子水平探討其在口腔潰瘍發(fā)展過程中的作用。

1　材料和方法

1.1實驗動物、主要試劑與儀器

純種雄性Wistar 大鼠(長春市億斯實驗動物技術有限責任公司)57只，體重為(280±10)g；臭氧水溶液、防御素β2抗體(上海江萊生物科技有限公司)、SP二抗試劑盒(上海魯汶生物科技有限公司)、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋有限公司)、多聚防脫載玻片、多聚賴氨酸、PBS磷酸鹽緩沖液、枸緣酸緩沖液、水合氯醛、冰醋酸、 甲醛溶液 ；光學顯微鏡和多功能照相顯微鏡(奧林巴斯，日本)、超薄石蠟切片機、電熱恒溫水箱(上海醫(yī)療器械七廠)。

1.2實驗方法

Wistar 大鼠57只，利用SPSS軟件隨機分為3組：正常對照組15只；自愈組20只；臭氧水組20只，另有2只用于口腔潰瘍模型鑒定(提供潰瘍組織標本和正常組織)。動物分籠飼養(yǎng)，自由攝食飲水。適應性喂養(yǎng)一周后，用100mL/L水合氯醛(350mg/kg)腹腔麻醉，正常對照組不作處理，自愈組和臭氧水組用蘸有體積分數(shù)為40%冰醋酸的(直徑5mm，厚1mm，圓形)濾紙片貼在大鼠兩側口角偏下唇處，放置60s，生理鹽水沖洗1min。24h后觀察口角黏膜約形成5mm 直徑的潰瘍，表面覆蓋黃白色假膜,其邊緣充血水腫。臭氧水組每日局部擦拭給藥，早中晚各一次，每次用量2mL(棉簽蘸取10次左右)，空白組及自愈組每日給等容量生理鹽水。各實驗組分別于給藥的第3天，第6天，第9天隨機抽取5只大鼠觀察潰瘍愈合情況并處死迅速切取6mm×6mm×5mm潰瘍的口腔黏膜組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定，行HE染色組織病理學檢查和免疫組織化學分析，其它大鼠記錄愈合日期。

1.3統(tǒng)計學方法

采用 SPSS13.0 統(tǒng)計軟件進行分析，以均數(shù)±標準差表示。計量資料用單因素方差分析進行組間比較，檢驗水準為α=0.05，P<0.05表示有統(tǒng)計學差異。

2　結果

2.1口腔潰瘍動物模型的建立鑒定

肉眼觀察:24h 后冰醋酸處理的大鼠相應黏膜處形成直徑5mm的圓形缺損，表面覆蓋黃白色假膜，略凹陷，邊緣較整齊，周邊紅腫充血。(圖1-A) 組織形態(tài)學觀察 ：(1)正常黏膜組織：上皮完整連續(xù)，角化層、顆粒層、棘層、基底層細胞排列有序，胞漿胞核清晰未見異型性表現(xiàn)，上皮下固少有層炎性細胞，上皮釘突短并且整齊(圖1-B)；(2)潰瘍黏膜組織：上皮層連續(xù)性被破壞，破潰溶解脫落,表面有壞死組織覆蓋,黏膜下方有大量的炎細胞浸潤,多數(shù)為中性粒細胞和淋巴細胞(圖1-C)。

2.2HE鏡下觀察

第3天時，自愈組：黏膜上皮完整性破壞，形成潰瘍，表層覆有由壞死的上皮細胞、纖維性滲出物和炎性細胞構成的假膜，上皮層及黏膜下層可見大量炎細胞浸潤，主要為中性粒細胞和淋巴細胞(圖2-A)；臭氧水組：黏膜尚且完整，黏膜下充血水腫，可見密集的炎癥細胞浸潤，其程度輕于自愈組(圖2-B)。

第6天時，自愈組組：黏膜已經(jīng)形成典型潰瘍，表面覆有大量壞死細胞、炎性細胞及纖維性滲出物，周圍組織有少量成纖維細胞, 充血不明顯(圖2-D)；臭氧水組：病灶下方及周圍可見較多的成纖維細胞長入，上皮出現(xiàn)修復反應，但其下方仍有炎癥細胞浸潤，潰瘍缺損表面未見纖維性滲出物(圖2-E)。

第9天時，自愈組：黏膜潰瘍面未愈合，表面可見炎癥細胞浸潤，纖維性滲出物，周圍見有成纖維細胞長入(圖2-G)；臭氧水組：上皮愈合，但層次紊亂，厚度不一(圖2-H)。 對照組各時間點均可見上皮連續(xù)，層次清晰，未見炎癥細胞浸潤(圖2-C,F,I)。

圖1　大鼠口腔潰瘍模型鑒定肉眼觀察及組織學鑒定

圖2　大鼠口腔潰瘍愈合不同時間頰黏膜上皮HE染色(×100)

( A.第3天自愈組，B.第3天臭氧水組，C.第3天對照組，D.第6天自愈組，E.第6天臭氧水組,F第6天對照組，G.第9天自愈組，H.第9天臭氧水組,I第9天對照組)

2.3BD-2免疫組化染色

BD-2在口腔黏膜中的表達情況：BD-2陽性染色呈黃色或棕黃色，位于細胞胞漿和胞膜，胞核無染色，強染色區(qū)域呈片狀或帶狀散在分布，在棘層細胞染色最強，主要表達于口腔黏膜上皮棘層和顆粒層，基底層細胞未見明顯染色。

第3、6、10天時，BD-2陽性表達率臭氧水組高于對照組(P<0.01)，自愈組高于對照組(P<0.01)，臭氧水組高于自愈組(P<0.05)；在各時間點，對照組BD-2成極其微弱的表達，陽性表達率無明顯變化(P>0.05)，自愈組同臭氧水組陽性表達率逐漸增加后趨于穩(wěn)定。

2.4自愈組和臭氧水組大鼠口腔潰瘍愈合時間比較

臭氧水組平均愈合時間為(9.0±0.7)d，短于自愈組平均愈合時間(10.4±1.14)d，組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，可以認臭氧水先于自愈組愈合。

圖3　大鼠口腔潰瘍愈合不同時間頰黏膜上皮BD-2免疫組化染色(×400)

3　討論

以往研究多采用體外上皮細胞培養(yǎng)，該方法不能模擬口腔潰瘍時口腔環(huán)境的復雜變化。對口腔潰瘍發(fā)展過程中BD-2在組織的表達至今尚不清楚，動物模型取材不受部位或時間點的限制，且大鼠口腔潰瘍模型建立方法成熟。本實驗通過40%冰醋酸建立大鼠口腔潰瘍模型[1]，可誘發(fā)口腔黏膜炎癥和充血,導致口腔潰瘍的發(fā)生,成功建立口腔潰瘍的動物模型。BD是口腔黏膜中化學屏障的抗菌肽，由上皮組織分泌可以直接殺傷病原體，或者通過化學途徑同溶菌酶等的協(xié)同作用殺菌。有學利用原位雜交技術檢測，發(fā)現(xiàn)在口腔，呼吸道，胃腸道，包皮等上皮組織中 BD-2呈少量表達，而當這些部位受到炎性刺激時，BD-2 則會大量表達，認為BD-2是誘導型防御素[2,3]。本研究結果顯示: BD-2在正常組、自愈組和臭氧水炎組的口腔齦上皮組織中均有表達，在自愈組和臭氧水組呈高表達，這與其他學者研究結果(誘導性表達)一致。在對照組中呈微弱表達Fn為常見的口腔共生菌，在正常狀態(tài)下口腔內也可大量存在，細胞實驗也證明:培養(yǎng)的上皮細胞中加入一定量的Fn細胞壁提取物，能夠上調BD-2的表達，因此，在存在大量口腔共生菌時，健康組織也可有BD-2的表達。本研究結果提示BD-2在牙齦口腔上皮中的表達具有組成性和誘導性表達兩種方式[4,5]。

在同一時間點，正常組BD-2有較弱表達，提示BD-2在正?？谇火つぶ杏幸欢ǖ奶烊环烙饔?；在自愈組BD-2表達強度中等，說明在上皮病損時分泌炎性因子可以激發(fā)其表達；臭氧水組表達強度最強，愈合最快，表示臭氧水本身可能作為一種外界干擾，調控BD-2的表達，使上皮的防御能力增強，同時，加快了潰瘍的愈合。

機體潰瘍面愈合是一個精準的調控過程，在該過程中有極多免疫細胞和免疫因子參與，參與機體整體和局部的細胞再生、組織重建過程[6]。內源性因子BD-2 ,在潰瘍面愈合過程中起到非常重要的作用，實驗證明臭氧水對BD-2因子的影響有利于潰瘍面的抗炎以及再生修復。

臭氧水有強氧化性，可以短時間內殺滅和抑制口腔內原有以及外來菌群，降低局部感染率和局部壞死的發(fā)生。此外，臭氧水可增強局部氧供，使口腔環(huán)境保持平衡，促進口腔黏膜上皮修復[10~11]。口腔黏膜內有密集的神經(jīng)末梢，發(fā)生潰瘍時，末梢會釋放P物質及磷脂酶A等致痛物質從而產生疼痛感覺，臭氧水可直接作用在神經(jīng)末梢，刺激抑制性中間神經(jīng)元釋放腦啡肽等物質，起到鎮(zhèn)痛作用[7~9]。

本試驗表明5%臭氧水可以有效減輕口腔潰瘍,縮短口腔潰瘍持續(xù)時間。目前有關臭氧水漱口治療口腔潰瘍的研究很少，本研究結果還有待更多的臨床試驗進一步證實。①BD-2在正?？谇火つぶ杏幸欢ǖ奶烊环烙饔茫仔砸蜃涌梢约ぐl(fā)其表達，臭氧水本身可能作為一種外界干擾，調控BD-2的表達。②臭氧水可以促進潰瘍的愈合，縮短其愈合時間。③在臭氧水的干擾下，BD-2的表達成都增強，且在上皮愈合后仍有一定的表達。

參考文獻:

[1]彭玉梅.口腔潰瘍動物實驗模型的建立[J]．北京口腔醫(yī)學,2008，16(2):85-86

[2]Abiko Y,Mitmura J,Nishimura M,et al.Pattern of expression of beta-defensins in oral squamous cell carcionima [J]．Cancer Lett,1999,143(1):37-43

[3]Bissll J,Joly S,Johnson GK, et al.Pattern of expression of beta-defensins ingingival health and in Periodontal disease [J].J Oral Pathol Med,2004，33(5):278-285

[4]Krisanaprakonkit S,Kimball JR,Weinberg A,et al.Inducible expression of human beta-defensin 2 by Fusobacterium nucleatum in oral epithelial cell:multiple singnaling pathways and role commensal bacteria in innate immunity and the epithelial barrier[J]．Infect Immun,2000,68(5):2907-2915

[5]李雅靈.齦溝液HBD-2及IL-1β水平與慢性牙周炎關系初步研究[D]．優(yōu)秀碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫,2007

[6]余斌,黃華軍,林慶榮,等. 臭氧水對感染性創(chuàng)面內源性細胞因子含量的影響[J].實用醫(yī)學雜志，2010,26(10):1719-1722

[7]易曉彤.臭氧水對感染性創(chuàng)面抗炎修復的作用[J]．亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2012,8(4):331-350

[8]張維,傅志儉,王梅英,等.醫(yī)用臭氧與疼痛臨床 [J]．國際麻醉學與復蘇雜志,2007,28(4):331-334

[9]Wainstein J,Feldbrin Z,Boaz M,et al.efficacy of ozone-oxygen therapy for the treatment of diabetic foot ulcers[J]．Diabetes Technol Ther,2011,13(12):1255-1260

[10]姜威,顏玉,鄭強,等. 潰瘍性結腸炎Toll樣受體表達和NF-κB變化及益生菌的作用研究[J]． 黑龍江醫(yī)藥科學, 2013,36(5):34-35

[11]李維善,朱建華,姜景紅.防御素HBD-2在口腔白斑病損中表達的研究[J]．黑龍江醫(yī)藥科學, 2013,36(1):24-25

中圖分類號：R781.5

文獻標識碼：B

文章編號：1008-0104(2015)06-0134-03

作者簡介：①尹燕超(1988~)女，黑龍江佳木斯人，在讀碩士研究生。

通訊作者：趙剛(1975~)男，黑龍江佳木斯人，碩士，副教授，碩士研究生導師。E-mail:yyc612448@163.com。

(收稿日期：2014-11-12)