姜廣宇,董　航 ,張文輝, 顧志成,劉勁睿

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003)

?

腦挫裂傷后水通道蛋白-4與血腦屏障通透性的相關(guān)性①

姜廣宇,董航 ,張文輝, 顧志成,劉勁睿

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003)

摘要：目的：旨在探討腦挫裂傷急性期水通道蛋白4 (AQP4)在腦水腫發(fā)生發(fā)展中的作用，了解該病理生理過(guò)程中血腦屏障的損傷及通透性增加趨勢(shì)，并試圖揭示出其相關(guān)性。方法：免疫組化檢測(cè)顱內(nèi)神經(jīng)組織在腦挫裂傷后AQP4的表達(dá)，腦挫裂傷標(biāo)本來(lái)源：36例腦挫裂傷病人急診手術(shù)時(shí)所獲得的腦挫裂傷灶周圍組織；對(duì)照組標(biāo)本來(lái)源：8例原發(fā)性癲癇病人，手術(shù)時(shí)所獲近似正常腦組織，并分析血腦屏障(BBB)指數(shù)。結(jié)果：腦挫裂傷早期AQP4呈現(xiàn)高表達(dá)，且明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；早期損傷后血腦屏障結(jié)構(gòu)即發(fā)生改變，繼之血腦屏障結(jié)構(gòu)明顯的損害，24h、72血腦屏障破壞是最為嚴(yán)重。結(jié)論：腦挫裂傷后AQP4高表達(dá)和BBB損傷導(dǎo)致通透性增加，二者可能存在相關(guān)性，對(duì)腦水腫而言意義重大。

關(guān)鍵詞：水通道蛋白4；腦水腫；血腦屏障；腦挫裂傷

腦水腫是腦挫裂傷后最常見(jiàn)的病理生理過(guò)程，研究表明，水通道蛋白在腦水腫過(guò)程中擔(dān)當(dāng)重要角色，調(diào)節(jié)水的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和水平衡[1]。本研究就不同時(shí)段腦挫裂傷病人的腦組織中，水通道蛋白4的水平進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)檢測(cè)BBB指數(shù)，通過(guò)檢測(cè)血腦屏障的損傷，提示腦組織損傷程度，試圖探討腦挫裂傷后相關(guān)因素對(duì)腦水腫發(fā)生的作用的理解。

1　資料與方法

1.1一般資料

佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科入院手術(shù)治療的腦挫裂傷病人(2011-01～2012-12)，急診手術(shù)時(shí)所獲腦挫裂傷組織，單純硬膜外、硬膜下血腫病例未入組，藥物治療方案基本一致。實(shí)驗(yàn)入組病人36例，傷后6～48h，男25例，女11例；年齡25～55歲，平均37.3歲。統(tǒng)計(jì)患者顱腦損傷原因:交通事故22例,暴力打擊3例,高空墜落9例,摔倒2例,排除其他系統(tǒng)復(fù)合嚴(yán)重受傷,減少干擾。術(shù)前依據(jù)Glasgow評(píng)分(GCS)，將此36例腦挫裂傷病人分為3組：輕中型組(GCS：9～15分)11例，重型組(GCS：6～8分)13例，特重型組(GCS：3～5分)15例。并依據(jù)創(chuàng)傷后的時(shí)間段長(zhǎng)短再次分為3組:傷后≤12h組、12～24h組、24～48h組。對(duì)照組織來(lái)源：8例原發(fā)性癲癇病人術(shù)中所獲，即相對(duì)正常腦組織,男5例,女4例,平均38歲。該實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)認(rèn)證通過(guò)。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本處理: 標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定48h，再經(jīng)石蠟包埋，5μm切片備用。

1.2.2電鏡觀察組織超微結(jié)構(gòu)：標(biāo)本經(jīng)3%戊二醛溶液固定6h，再經(jīng)4℃下1%鋨酸固定2h后進(jìn)行脫水包埋，超薄切片，電鏡觀察。

1.2.3檢測(cè)AQP4蛋白表達(dá)：依次行石蠟包埋，切片，脫蠟，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。圖片中免疫組化所示平均灰度定量AQP4蛋白，灰度值高，物質(zhì)表達(dá)含量低，反之亦然。

1.2.4BBB 通透性測(cè)定：腦室穿刺或腰椎穿刺后行腦脊液檢查，并對(duì)抽取病人靜脈血血清白蛋白進(jìn)行檢測(cè)。樣本來(lái)源：病人靜脈血清及腦脊液(CSF)，同時(shí)滴定樣本中白蛋白及總蛋白，依據(jù)二者含量計(jì)算BBB指數(shù)，方法依據(jù)王擁軍[3]等提出BBB指數(shù)計(jì)算公式：BBB指數(shù)=腦脊液白蛋白(Albcsf)/血清白蛋白(Albs)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1超微結(jié)構(gòu)觀察

顯微觀察見(jiàn)對(duì)照組微血管內(nèi)、皮外基底膜完好，內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)形態(tài)異常，無(wú)水腫，血-腦屏障結(jié)構(gòu)完整。腦挫裂傷組織的微血管內(nèi)皮細(xì)胞見(jiàn)腫脹變形，血-腦屏障損傷，出現(xiàn)"泡沫"改變。毛細(xì)管壁襯砌結(jié)構(gòu)缺陷，并可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接受損。神經(jīng)元及膠質(zhì)胞體增大，水腫，胞漿增多，胞核固縮，可見(jiàn)染色質(zhì)崩解，電子密度高 ，見(jiàn)圖1~3。

圖1　對(duì)照組腦組織超微結(jié)構(gòu)×10000

圖2　創(chuàng)傷組腦組織超微結(jié)構(gòu)×10000

圖3　血管周圍間隙增寬周邊空泡樣變×10000

2.2AQP4的檢測(cè)

腦挫裂傷患者病理，傷后6h即見(jiàn)AQP4表達(dá)，統(tǒng)計(jì)顯示，傷后≤12h組、12～24h組、24～48h組3個(gè)組急性期48h內(nèi)，時(shí)間與AQP4表達(dá)呈正相關(guān)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.783，P<0.05)。與此同時(shí)，不同程度的腦挫裂傷(特重型，重型，輕中型)，傷情越重，AQP4表達(dá)量越高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(F=3.572，P<0.05)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果提示：48h內(nèi)，腦挫裂傷嚴(yán)重程度與AQP4表達(dá)量正相關(guān)；傷后時(shí)間與AQP4表達(dá)正相關(guān)，見(jiàn)圖4~5。

圖4　對(duì)照組AQP4陽(yáng)性產(chǎn)物(×200)

圖5　腦挫裂傷周圍AQP4高表達(dá)(×200)

≤12h12~24h24~48h輕中型0.183±0.030﹡0.196±0.029﹡0.23±0.022﹡重型0.21±0.021﹡0.232±0.017﹡0.268±0.024﹡特重型0.222±0.040﹡0.242±0.034﹡0.275±0.042﹡對(duì)照組0.15±0.0260.15±0.0260.15±0.026

注：觀察組與對(duì)照組比較均﹡P<0.05。

2.3BBB通透性檢測(cè)

不同組腦挫裂傷BBB指數(shù)均增加，12h、24h、48h各時(shí)段BBB指數(shù)均較對(duì)照組明顯升高(P<0.01)，其中24-72h達(dá)到高峰(P<0.01)72h后BBB指數(shù)開(kāi)始有所下降;但仍高于對(duì)照組 (P<0.01)。

表2　腦挫裂傷后不同時(shí)段病人的BBB指數(shù)±s)

注：觀察組與對(duì)照組比較均﹡P<0.01。

3　討論

水通道蛋白(aquaporin)的發(fā)現(xiàn),提供了水分子跨膜的全新膜蛋白分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。共計(jì)于哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)13種膜嵌入蛋白 (majorintrinsicpro-tein，Mm)家族。研究發(fā)現(xiàn)AQP4的亞型：M1、M23聚集狀態(tài)決定了其亞細(xì)胞分布和功能，其分布有相對(duì)的組織特異性，在成熟大腦中AQP4的分布最為廣泛。

AQP4在室管膜、蛛網(wǎng)膜、微血管周圍膠質(zhì)以及滲透壓感受區(qū)高表達(dá)。應(yīng)起調(diào)節(jié)神經(jīng)組織水鹽代謝作用[4，5]。AQP4蛋白在神經(jīng)細(xì)胞的分布體現(xiàn)出明顯的極性趨勢(shì)，神經(jīng)元集中區(qū)域如核團(tuán)或神經(jīng)層的胞體表現(xiàn)高表達(dá)，推測(cè)AQP4參與與水分子同向轉(zhuǎn)運(yùn)[6]。近來(lái)，Jin等[7]的結(jié)果提示AQP4可影響細(xì)胞外容積調(diào)節(jié)K+的攝取，且K+的攝取可能是AQP4依賴性的，AQP4可能協(xié)同調(diào)節(jié)水和K+穩(wěn)態(tài)，影響神經(jīng)元電信號(hào)水平。實(shí)驗(yàn)中觀察腦挫裂傷后AQP4的表達(dá)動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，證實(shí)顱腦損傷后，AQP4表達(dá)隨時(shí)間變化逐漸增加，并且與路腦損傷程度呈正相關(guān)性。這與Taya等[8]的研究結(jié)果相符合。

BBB是神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)界面，使神經(jīng)系統(tǒng)處于相對(duì)隔絕的環(huán)境，血管源性腦水腫的主要原因就是BBB的損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，腦挫傷后神經(jīng)細(xì)胞AQP4的表達(dá)與BBB指數(shù)在48h內(nèi)變化呈正相關(guān)。其結(jié)果提示BBB破壞是腦損傷后早期腦水腫的主要原因之一，細(xì)胞毒性腦水腫則可能是亞急性期腦水腫的主要原因之一[9]。調(diào)控腦挫裂傷時(shí)AQP4的表達(dá)，減少BBB的損傷和通透性，可能對(duì)繼發(fā)性腦損傷的治療提供新的臨床思路。雖然該研究結(jié)果類似于其他實(shí)驗(yàn)。本研究只觀察病人在腦挫裂傷后急性期(48h內(nèi))AQP4的變化特性，由于就診時(shí)間、交通情況、病人術(shù)前準(zhǔn)備時(shí)間等條件約束，未能就傷后2h內(nèi)和72h后的各種因子特性相類似的探討。也因樣本個(gè)體差異，比如年齡、性別、手術(shù)操作和病理

標(biāo)本部位等限制，無(wú)法就不同的時(shí)段在同一患者顱腦損傷后AQP4檢測(cè)進(jìn)行比較，筆者認(rèn)為，AQP4在腦挫裂傷后BBB指數(shù)的改變，及其影響腦挫裂傷后腦水腫的機(jī)制，由于不同的研究方法、手段和觀測(cè)時(shí)段，結(jié)論可能存在差，需要擴(kuò)大樣本采集時(shí)間，改進(jìn)研究方法，降低個(gè)體差異(如性別、年齡、身體狀況等)，進(jìn)一步詳細(xì)的觀察不同時(shí)間點(diǎn)，應(yīng)可得到更加可靠和客觀依據(jù)，進(jìn)一步深入研究，預(yù)期提高顱腦損傷病人的預(yù)后。

參考文獻(xiàn)：

[1] Magni F，Sarto C，Ticozzi D，et al. Proteomic knowledge of human aquaporins [J]．Proteomics，2006，6(20)：5637-5686

[2]王擁軍．神經(jīng)病學(xué)實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)[M]．北京：科技文獻(xiàn)出版社，1998：395-398

[3]Agre P，King LS, Yasui M，et al. Aquaporin water channels-from atomic structure to clinical medicine[J]．Physiol，2002，542(1)：3-16

[4]Jin BJ，Zhang H，Binder DK，et al. Aquaporin-4-dependent K+and water transport modeled in brain extracellular space following neuroexcitation[J].Gen Physiol，2013，141 (1)：119-132

[5]廉嘵宇,張秀峰,宣兆博,等.水通道蛋白4mRNA在大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦水腫中的表達(dá)及尼莫地平對(duì)其表達(dá)的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2009,32(6):7-8

[6]張帆,許國(guó)英.水通道蛋白-4與缺血性腦水腫[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2005,28(6):80-81

[7]Yang B，Zador Z，Verkman AS．Glial cell aquaporin-4 overexpression in transgenic mice accelerates cytotoxic brain swelling[J]．J Biol Chem，2008，283(22)：15280-15286

[8]Taya K，Marmarou CR，Okuno K，et al．Effect of secondary insults upon aquaporin -4 water channels following experimental cortical contusion in rats[J]． J Neurotrauma，2010，27 (1):229-239

[9]劉永剛,姜鳳,姜堯佳.高血壓性腦出血周圍腦組織超微結(jié)構(gòu)及腦水腫發(fā)生機(jī)制研究[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2015,38(2):142-145

中圖分類號(hào)：R642

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0104(2015)06-0027-02

基金項(xiàng)目：①黑龍江省衛(wèi)計(jì)委科研課題，編號(hào)：2013-259。

作者簡(jiǎn)介：姜廣宇(1981～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，主治醫(yī)師。

通訊作者：董航(1979～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主治醫(yī)師。E-mail:donghang1006@sina.com。

(收稿日期：2015-09-20)