宋振宇，關(guān)　鍵 ，關(guān)　宏

(1.佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯154007；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161000)

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大鼠雪旺細(xì)胞培養(yǎng)純化與鑒定①

宋振宇1，關(guān)鍵1，關(guān)宏2

(1.佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯154007；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161000)

摘要：目的：通過Wistar大鼠坐骨神經(jīng)取材，體外預(yù)變性與組織塊貼壁方法，培養(yǎng)出大量高純度可以滿足臨床應(yīng)用條件的雪旺細(xì)胞。方法：取200～250g成年大鼠，脫頸處死，完全浸泡在75%酒精消毒10min，俯臥位取雙側(cè)坐骨神經(jīng)，體外預(yù)變性兩周，之后加入雙酶消化，EGTA試劑純化雪旺細(xì)胞，通過免疫熒光鑒定雪旺細(xì)胞純度。結(jié)果：此研究描述一種新穎有效雪旺細(xì)胞培養(yǎng)提純的方法。利用EGTA對雪旺細(xì)胞分離比成纖維細(xì)胞快的原理提純，需要大約21d完成。該方法具有操作簡單，速度快的優(yōu)勢，比其他先前描述的方法更有效。結(jié)論：該實(shí)驗(yàn)通過體外預(yù)變性獲得的雪旺細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，活性好，易貼壁，而且純化方法簡單易行，在較短的時(shí)間內(nèi)獲得高純度雪旺細(xì)胞。

關(guān)鍵詞：雪旺細(xì)胞；Forskolin；EGTA

雪旺細(xì)胞在周圍神經(jīng)再生中起到?jīng)Q定性作用，是其核心組成。周圍神經(jīng)損傷后，其迅速大量增值，與巨噬細(xì)胞協(xié)同，分泌神經(jīng)生長因子[1]，同時(shí)吞噬變性壞死碎片以及促進(jìn)軸突再生。因此，雪旺細(xì)胞的研究，對周圍神經(jīng)再生起到主導(dǎo)作用[2]。因?yàn)槌衫w維細(xì)胞要比雪旺細(xì)胞的增殖快，兩者的分離提純成為一個(gè)復(fù)雜的過程。采用預(yù)變性的方法要比完整的神經(jīng)取材要更容易獲得活性好和高濃度、高純的雪旺細(xì)胞。目前，組織工程學(xué)中，把高濃度的雪旺細(xì)胞移植到生物材料人工神經(jīng)管道內(nèi)來修復(fù)神經(jīng)損傷促進(jìn)神經(jīng)再生有重要突破[3]。

1　材料與方法

1.1材料

主要試劑、材料：黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基、p75NTR的抗體、胎牛血清、二抗FITC、胰蛋白酶、DAPI、膠原酶Ⅳ號、Forskolin、牛腦垂體提取物、成纖維細(xì)胞生長因子、EGTA。

1.2方法

①神經(jīng)的預(yù)處理：取成年約200～250g 的Wistar大鼠，在無菌條件下麻醉，剝離雙側(cè)20~25mm長度的坐骨神經(jīng)。放到PBS緩沖液中，盡量剝除神經(jīng)外膜，用剪刀將組織剪成2~4mm的神經(jīng)段。把坐骨神經(jīng)片段放入到培養(yǎng)基中2周以體外預(yù)變性。成纖維細(xì)胞可從神經(jīng)組織爬出，培養(yǎng)基DMEM加入了10%(v/v)胎牛血清FBS與1%(W/V)青霉素/鏈霉素。同時(shí)，為了提高雪旺細(xì)胞的增值，加入2 M forskolin作為雪旺細(xì)胞特異性的有絲分裂原。

②神經(jīng)消化分離處理 ：經(jīng)過兩周，將預(yù)處理的坐骨神經(jīng)碎片，加入0.125%的膠原酶IV號與1.25 U/mL的中性蛋白酶混合酶各2mL，再放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育20h[4]。之后在室溫2000r/min離心3min棄上清液，得混合雪旺細(xì)胞與成纖維細(xì)胞?；鞈肄D(zhuǎn)移到2g/mL多聚賴氨酸的培養(yǎng)皿中。24h之后，更換含有2 M Forskolin、10ng/mL FGF和5g/mL牛腦垂體提取物，阻止成纖維細(xì)胞的增值分裂。

③雪旺細(xì)胞提純：5~6d之后，細(xì)胞鋪培養(yǎng)皿底部70%左右。為得到大量雪旺細(xì)胞，用2mL不含Ca2+和Mg2+的PBS溶液和2mL 1 Mm EGTA沖洗。在顯微鏡觀察3~4min，細(xì)胞收縮分離，漂浮起來的是雪旺細(xì)胞，收集懸液，2000r/min離心3min，棄上清，加入1mL DMEM培養(yǎng)基混懸，重復(fù)離心去上清，用DMEM培養(yǎng)基混懸，轉(zhuǎn)移培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3雪旺細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定

①雪旺細(xì)胞形態(tài)：顯微鏡下見，雪旺細(xì)胞呈胞體凸起，并發(fā)出兩個(gè)長觸角呈梭形或發(fā)出三個(gè)觸角呈三角形；而成纖維細(xì)胞，呈較大扁平的不規(guī)則形態(tài)[5]。

②免疫熒光染色：雪旺細(xì)胞接種在多聚賴氨酸(15 g/mL)涂覆的蓋玻片上，放入到4%多聚甲醛與PBS中，固定30min，再PBS沖洗。加入10%(v/v)山羊血清和1mg BSA/mL的PBS中1h。首先加入由3%(v/v)山羊血清和1mgBSA/mL PBS稀釋的抗體p75NTR 2h或4℃過夜。拿出沖洗細(xì)胞加入二抗，羊抗兔IgG共軛熒光素異硫氰酸酯(FITC)在37℃ 45min。沖洗再加入DAPI， 2min后細(xì)胞核被染色，用熒光顯微鏡觀察。

③流式細(xì)胞儀分析：收集的細(xì)胞直接流式細(xì)胞儀分析后直接染色，通過測量熒光強(qiáng)度的p75NTR陽性細(xì)胞的分?jǐn)?shù)比例，得出雪旺細(xì)胞的百分比。胰蛋白酶消化后用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)后流式細(xì)胞儀檢測，達(dá)到106個(gè)雪旺是細(xì)胞的純度有意義。

2　結(jié)果

2.1原代培養(yǎng)和雪旺細(xì)胞增殖

見圖1。離體坐骨神經(jīng)組織經(jīng)過兩周預(yù)處理后圖片,膠原酶和中性蛋白酶消化后平均得到(4.0±0.8)×106個(gè)細(xì)胞/皿。24h大量懸浮細(xì)胞貼壁生長，兩種細(xì)胞形態(tài)完全不同。以扁平的不規(guī)則形態(tài)和一個(gè)卵圓形細(xì)胞核呈現(xiàn)的為成纖維細(xì)胞；雪旺細(xì)胞一般為體積小的、明亮的、兩極的梭形或三極的三角形，有比較長的觸須樣形態(tài)，見圖2。細(xì)胞的純度為(64.1±0.7)%。換加入2 M Forskolin、10ng/mL FGF和5g/mL牛腦垂體蛋白提取物培養(yǎng)基之后，成纖維細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，見圖3。對照組成纖維細(xì)胞比例高，未用做進(jìn)一步研究。用EGTA處理后，見圖4，大部分雙極和三極的細(xì)胞收縮、分離、被懸浮釋放；而扁平的不規(guī)則形態(tài)的細(xì)胞則沒有發(fā)生這種變化。收集漂浮細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至另一新培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。24h細(xì)胞貼壁后，圖5。7d后，雪旺細(xì)胞純度可達(dá)到(99.2±0.4)%。見圖6～8，顯示細(xì)胞免疫熒光染色，之后流式細(xì)胞儀檢測，顯示大于99%的細(xì)胞對p75NTR標(biāo)記陽性，為雪旺細(xì)胞。

圖1　預(yù)處理兩周(×10)　　　圖2　消化后培養(yǎng)24h(×10)　　　圖3　換培養(yǎng)基后(×10)

圖4　培養(yǎng)后用EGTA純化過程(×10)　　　　圖5　EGTA純化后貼壁24h(×10)

圖6　加入抗體后染色(×20)　　圖7　細(xì)胞核染色(×20)　　　圖8　合成后效果圖(×20)

3　討論

這項(xiàng)研究敘述了一個(gè)比較高效的提純和獲得大量雪旺細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)程序。當(dāng)與未經(jīng)處理的神經(jīng)相比[6]，體內(nèi)和體外采用預(yù)變性處理而得到活性雪旺細(xì)胞是一種簡單有效增加細(xì)胞產(chǎn)量的方法。當(dāng)暴露于Forskolin兩周預(yù)變性后雪旺細(xì)胞產(chǎn)量、純度和細(xì)胞增值率增加，所以我們采用這個(gè)方法。這個(gè)新的研究方法涉及到加入EGTA試劑后，雪旺細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分離的不同，雪旺細(xì)胞可以攣縮呈橢圓狀以至分離漂浮，這要可以純化雪旺細(xì)胞。這種方法的關(guān)鍵點(diǎn)在于一個(gè)合適的細(xì)胞外基質(zhì)的應(yīng)用，一個(gè)理想的基質(zhì)可以讓雪旺細(xì)胞和成纖維細(xì)胞差動(dòng)分離。因此，在本研究中我們測試了不同濃度的層黏連蛋白或多聚賴氨酸作為細(xì)胞外基質(zhì)。我們觀察得到，使用2g/mL多聚賴氨酸，分離雪旺細(xì)胞與成纖維細(xì)胞效果更明顯。其一，細(xì)胞接種密度過大，雪旺細(xì)胞與成纖維細(xì)胞重疊影響分離。本研究認(rèn)為的密度為7.5×104個(gè)/cm2，這低于之前研究的雪旺細(xì)胞和成纖維細(xì)胞混合的密度。其二，細(xì)胞增殖不同，在第一個(gè)48h內(nèi)，雪旺細(xì)胞增殖要比成纖維快，但72h后成纖維細(xì)胞會(huì)迅速的增值，把雪旺細(xì)胞覆蓋。為了解決這個(gè)問題，我們要換加入抑制成纖維細(xì)胞增殖試劑的培養(yǎng)基。此外，用能分離雪旺細(xì)胞的EGTA試劑處理，成纖維細(xì)胞密度過大將影響分離效果。在細(xì)胞特征結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，細(xì)胞純度可以達(dá)到99%。根據(jù)文獻(xiàn)差速貼壁分離和膠原酶處理等方法，通過實(shí)踐沒有達(dá)到這個(gè)純度。總之，使用EGTA對兩種細(xì)胞分離處理，是在短時(shí)間內(nèi)，獲得高純度雪旺細(xì)胞的方法之一。為雪旺細(xì)胞的臨床研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

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[4]李陳, 肖玉周. 施萬細(xì)胞培養(yǎng)與純化研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)綜述, 2014, (08): 1371-1373

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[6]姜葉. 乳鼠坐骨神經(jīng)雪旺細(xì)胞體外培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究[D]. 青島大學(xué), 2014

中圖分類號：R338.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號：1008-0104(2015)06-0050-02

(收稿日期：2015-06-08)