張武圣河南省中醫(yī)院，河南　鄭州　450006

HPLC法測定維C銀翹片中牛蒡苷和連翹苷的含量

張武圣
河南省中醫(yī)院，河南鄭州450006

【摘要】目的:建立測定維C銀翹片中牛蒡苷和連翹苷的含量測定方法.方法:采用高效液相法，色譜柱為Diamonsil C18柱( 250nm×4. 6mm，5μm)，以乙腈∶0. 2%磷酸水( 30∶70)為流動相，檢測波長: 207nm，流速: 1. 0ml/min;運(yùn)用外標(biāo)法對其進(jìn)行測定.結(jié)果:牛蒡苷線性回歸方程為Y = 67716X－264370，在95. 4ng～1980ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好( r = 0. 9995)，連翹苷性回歸方程為Y = 96437X－716504，在21. 18ng～423. 6ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好( r = 0. 9991)，牛蒡苷和連翹苷加樣回收率99. 66%、99. 48%，RSD分別為0. 90%和0. 94%.3批維C銀翹片牛蒡苷平均含量分別為10. 17、10. 06、10. 21mg/g，連翹苷平均含量1. 97、1. 84、2. 03mg/g.結(jié)論:該方法準(zhǔn)確、簡便、重復(fù)性好、靈敏度高，可用于對維C銀翹片的質(zhì)量評價(jià)及質(zhì)量控制.

【關(guān)鍵詞】維C銀翹片;牛蒡苷;連翹苷;高效液相色譜法

維C銀翹片是常用的中成藥，由金銀花、連翹、牛蒡子等多味藥物制成，具有疏風(fēng)解表、清熱解毒等功效，常用于外感風(fēng)熱所致的流行性感冒及發(fā)熱、頭痛、咳嗽、口干、咽喉疼痛等癥.該藥功效明確，且連翹、牛蒡子在復(fù)方中均起到重要作用.研究表明，牛蒡苷為牛蒡子的有效成分，具有改善糖尿病微血管病變[1]、抑制腎小球纖維化[2]和抗癌[3]等作用;連翹苷為連翹的主要成分，具有抗氧化[4]、抑制甲型流感病毒NP基因轉(zhuǎn)染后表達(dá)[5]和退熱作用[6]等.本文測定維C銀翹片中牛蒡苷和連翹苷的含量，建立通過HPLC對其質(zhì)量控制的方法，為以后維C銀翹片的研究提供依據(jù).

1　儀器與試藥

1. 1儀器Waters2695高效液相色譜儀(配Waters2998紫外檢測器，Empower色譜工作站) ; CPA2P－F電子分析天平(東方嘉儀電子科技有限公司) ; DL－360A超聲清洗機(jī)(上海之信儀器有限公司) ; SHZ－D (Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司) ; HH－6雙列六孔數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海博珍儀器設(shè)備制造廠) ; EYELA N－1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司).

1. 2試藥維C銀翹片(批號: 110503、110602、110901，廣西盈康藥業(yè)) ;牛蒡苷對照品(批號: 110819－201108)、連翹苷(批號: 110821－201112)由中國藥品生物制品檢定所提供;乙腈(色譜純，Grace Company INC) ;甲醇(分析純，天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司) ;水為超純水;其他試劑均為分析純.

2　方法與結(jié)果

2. 1色譜條件色譜柱: Diamonsil C18柱( 250 nm× 4. 6mm，5μm) ;柱溫: 25℃;流動相:乙腈－0. 2%磷酸水( 30∶70) ;檢測波長: 207nm，理論塔板數(shù)按連翹苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2000.

2. 2對照品溶液的制備取牛蒡苷和連翹苷適量，精密稱定，分別加50%甲醇將其制備成濃度為0. 2118mg/ml的連翹苷對照品溶液和0. 954mg/ml的牛蒡苷對照品溶液.制備的對照品溶液各取1ml置10ml定量瓶中，加50%甲醇定制刻度，即得混合對照品溶液.

2. 3供試品溶液的制備取本品數(shù)片，去除包衣，碾磨混勻，精密稱取5g置具塞錐形瓶中，加甲醇25ml，稱量質(zhì)量，超聲處理30min，放冷，補(bǔ)足失重，搖勻過濾，取續(xù)濾液10ml，加置中性氧化鋁柱( 100～120目，2g，內(nèi)徑0.9cm)上，用50%甲醇洗脫，收集洗脫液置25ml定量瓶中，即得.

2. 4陰性對照溶液的制備按處方量制備不含牛蒡子和連翹的陰性對照藥材，按“2.3”方法進(jìn)行處理，得陰性對照溶液.

2. 5專屬性試驗(yàn)精密吸取對照品、供試品及陰性對照溶液各10μl，注入高效液相色譜儀進(jìn)行測試，結(jié)果陰性對照色譜中，在與對照品和藥材出峰時(shí)間處沒有相應(yīng)的色譜峰，表明其他組分對牛蒡苷和連翹苷無干擾，結(jié)果見圖1.

圖1　牛蒡苷和連翹苷的HPLC圖

2. 6線性關(guān)系考察按以上色譜條件，分別用自動進(jìn)樣器進(jìn)1、2、4、8、10、20μl，按以上色譜條件下進(jìn)行測定，以峰面積為縱坐標(biāo)，以對照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，得到線性回歸方程牛蒡苷: Y = 67716X－264370，r = 0. 9995，說明牛蒡苷對照品在95. 4ng～1980ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;連翹苷: Y = 96437X－716504，r = 0. 9991，說明連翹苷對照品在21. 18ng～423. 6ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

2. 7精密度試驗(yàn)取同一對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次10μl，分別記錄牛蒡苷和連翹苷的峰面積，計(jì)算其精密度的RSD分別為1. 61%、1. 84%，表明儀器的精密度良好.

2. 8重復(fù)性試驗(yàn)取維C銀翹片樣品5份，按“2. 3”項(xiàng)方法將其制備成供試品并按照上述色譜條件測定牛蒡苷和連翹苷的含量，記錄牛蒡苷和連翹苷的峰面積，計(jì)算RSD值分別為2. 01%和2. 14%，表明重復(fù)性良好.

2. 9加樣回收率試驗(yàn)取已知含量(含10. 17mg/g牛蒡苷和1. 97mg/g連翹苷)的維c銀翹片約0. 5g，共9份，精密稱定，分為3組，每組分別精密加入質(zhì)量濃度已知的牛蒡苷對照品和連翹苷對照品0. 8、1. 0、1. 2倍，按照以上供試品的制備方法制備供試品以及按上述色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果顯示牛蒡苷和連翹苷的加樣回收率的RSD分別為0. 90%和0. 94%，見表1、2.2. 10樣品的含量測定取3批維C銀翹片品( 110503、110602、110901)，每批取6份，按照以上制備方法及色譜條件測定，記錄色譜峰面積并計(jì)算，測定結(jié)果見表3.

表1　牛蒡苷的加樣回收率結(jié)果( n =9)

表2　連翹苷的加樣回收率結(jié)果( n =9)

表3　維C銀翹片樣品中牛蒡苷和連翹苷的含量測定結(jié)果

3　討論

3. 1流動相的考察實(shí)驗(yàn)中對不同系統(tǒng)的流動相進(jìn)行了篩選考察，包括乙腈－水溶液、乙腈－0. 2%磷酸水溶液、甲醇－水溶液，結(jié)果表明:把乙腈－0. 2%磷酸水作為流動相時(shí)效果最佳，色譜峰峰型及分離度均良好，且保留時(shí)間適宜，故選擇乙腈－0. 2%磷酸水作為流動相.

3. 2提取方法的考察維C銀翹片為中藥復(fù)方制劑，本實(shí)驗(yàn)主要對其進(jìn)行了超聲法和回流法進(jìn)行對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲法與回流法對二者含量影響不大，但由于超聲法操作簡便，故選其為提取方法.

3. 3吸收波長的考察維C銀翹片中牛蒡苷[6]在208、224、280nm處均有最大吸收，連翹苷[7]在205、288、277nm處有吸收，通過綜合考察，發(fā)現(xiàn)其二者在207nm處峰形較好，雜質(zhì)干擾少，故選擇波長為207nm.

3. 4層析柱的選擇因維C銀翹片中待測成分的含量較低，故選擇過層析柱以防止其他成分干擾致使其含量測定不準(zhǔn)確，本實(shí)驗(yàn)通過對聚酰胺、大孔吸附樹脂、中性氧化鋁等填充料進(jìn)行選擇，從測得含量高、雜質(zhì)干擾少的角度，最終選擇中性氧化鋁為填充料的層析柱進(jìn)行試驗(yàn).

維C銀翹片是中藥制劑，因其良好的療效而受到廣泛的應(yīng)用.本次實(shí)驗(yàn)通過HPLC法對維C銀翹片中牛蒡苷和連翹苷進(jìn)行含量測定，從而更科學(xué)合理的對維C銀翹片中兩種成分進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制，且本實(shí)驗(yàn)設(shè)定的方法靈敏度高，專屬性好，可以為維C銀翹片中牛蒡苷和連翹苷的含量測定提供方法依據(jù).

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收稿日期:( 2014. 11. 12)

【文章編號】1007－8517 ( 2015) 04－0028－02

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【中圖分類號】R284. 1