張　鑫　郝玉琴

·綜述·

靶向survivin shRNA在腫瘤治療中的研究進(jìn)展

張鑫郝玉琴

生存素在細(xì)胞凋亡抑制中起重要作用，越來越多的研究者將其作為腫瘤基因治療的理想靶點。應(yīng)用RNA干擾技術(shù)靶向抑制生存素的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生成、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對放化療的敏感性。

生存素； shRNA； 腫瘤

生存素（survivin）是凋亡抑制基因家族中分子量最小而抗凋亡作用最強(qiáng)的成員，在正常成人組織很少表達(dá)，而在各種惡性腫瘤中高度表達(dá)，生存素具有抑制細(xì)胞凋亡，參與細(xì)胞周期調(diào)控，促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖，促進(jìn)血管增生等多種生物學(xué)功能。生存素在腫瘤組織中的特異性表達(dá)和功能，使其成為腫瘤研究的新靶點。RNA干擾技術(shù)是一項高特異性和高效率的基因沉默技術(shù)，在腫瘤相關(guān)基因的功能研究和基因治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

1　生存素概述

生存素是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族成員之一，位于染色體17q25，全長14.7kb包含4個外顯子和3個內(nèi)含子，是分子量最小但抗凋亡活性最強(qiáng)的成員。生存素蛋白分子量很小，氨基酸末端僅包含有一個含有半胱氨酸、組氨酸的桿狀病毒lAP重復(fù)（baculoviral IAP repeat，BIR）序列，其在抑制細(xì)胞的凋亡方面起重要作用［1］。生存素的表達(dá)具有特異性，主要表達(dá)于人的胚胎組織和各種腫瘤組織。生存素表達(dá)與IAPs家族其他成員的最大區(qū)別就是其除子宮內(nèi)膜、胎盤組織和胸腺組織中存在不同程度表達(dá)外，在其他大多數(shù)組織不表達(dá)，而其余的lAPs則能夠廣泛表達(dá)于正常成人組織中［2］。由此可見，生存素的表達(dá)分布具有明顯的組織細(xì)胞選擇性，即主要表達(dá)于胚胎及未分化成熟的組織中。生存素的表達(dá)具有細(xì)胞周期依賴性，主要表現(xiàn)為只在細(xì)胞有絲分裂的G2/M期表達(dá)，G1期幾乎不表達(dá)，在有絲分裂G2/M期，生存素可與有絲分裂紡錘體的微管特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂［3］。生存素在癌細(xì)胞中的過度表達(dá)可能促進(jìn)其跳過細(xì)胞周期檢查點通過有絲分裂而促進(jìn)癌細(xì)胞分裂增殖［4］。由于生存素啟動子在正常組織細(xì)胞中基本靜止，而在腫瘤組織細(xì)胞中過度表達(dá)，所以其被公認(rèn)為是腫瘤相關(guān)基因［5］。研究發(fā)現(xiàn)生存素具有抑制細(xì)胞凋亡，參與細(xì)胞周期調(diào)控，促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖，促進(jìn)血管增生等多種生物學(xué)功能［6，7］。

2　RNA干擾技術(shù)作用機(jī)制及應(yīng)用

2.1RNA干擾機(jī)制 當(dāng)外源性基因隨機(jī)整合到細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時，常會產(chǎn)生一些雙鏈RNA（double strands RNA，dsRNA）。宿主細(xì)胞胞質(zhì)中的核酸內(nèi)切酶（Dicer）將dsRNA切割成多個具有特定長度和結(jié)構(gòu)的小片段即RNA干擾相關(guān)效應(yīng)分子（small interfering RNA，siRNA）。siRNA在細(xì)胞內(nèi)RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，反義siRNA再與體內(nèi)一些酶（包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等）結(jié)合形成 RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC），RISC與外源性基因表達(dá)的mRNA的同源區(qū)進(jìn)行特異性結(jié)合。具有核酸酶的功能RISC，在結(jié)合部位切割mRNA，切割位點即是與siRNA中反義鏈互補(bǔ)結(jié)合的兩端，被切割后的斷裂mRNA隨即降解，導(dǎo)致了該mRNA轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)無法合成，出現(xiàn)了該mRNA轉(zhuǎn)錄的基因不能表達(dá)的現(xiàn)象即基因沉默現(xiàn)象［8］。

2.2RNA干擾技術(shù)的應(yīng)用 RNA干擾技術(shù)是先確定靶基因的結(jié)構(gòu)，利用dsRNA進(jìn)入細(xì)胞后特異性降解細(xì)胞內(nèi)同源信使RNA（mRNA），從而阻斷特定基因表達(dá)，其作用相當(dāng)于基因敲除。目前RNA干擾的方法最常用的就是直接轉(zhuǎn)染siRNA和構(gòu)建shRNA載體。但是化學(xué)合成siRNA成本大且作用時間短，使其應(yīng)用受到限制。

shRNA是一段具有緊密發(fā)卡環(huán)的RNA序列，通過載體將克隆其編碼的DNA導(dǎo)入細(xì)胞，在細(xì)胞中，shRNA被加工成siRNA，發(fā)揮抑制特異mRNA表達(dá)的作用，這種裝載了shRNA的載體可以通過篩選，穩(wěn)定傳遞到子代細(xì)胞中去［9］。載體介導(dǎo)shRNA表達(dá)技術(shù)能長期和穩(wěn)定地抑制靶基因的表達(dá)，因此可用來構(gòu)建理想的實驗細(xì)胞模型，與化學(xué)合成siRNA法相比具有更大的應(yīng)用潛力，因此shRNA表達(dá)載體技術(shù)成為腫瘤基因治療的強(qiáng)大工具。

3　靶向survivin-shRNA在腫瘤治療中的作用機(jī)制

靶向survivin-shRNA在腫瘤治療中具有多重作用，可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞分裂增殖，抑制腫瘤血管生成及增加放化療等敏感性。

3.1抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡 Gou等［10］通過建立survivin-shRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染膀胱癌T24細(xì)胞和BJ細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）來評估膀胱癌細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示大多數(shù)T24細(xì)胞和BJ細(xì)胞在G2/M期被阻滯，顯著抑制了T24細(xì)胞和BJ細(xì)胞的增殖，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞凋亡。

Zhen等［11］構(gòu)建了靶向survivin-shRNA載體并轉(zhuǎn)染神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，體外實驗將對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于24孔板，連續(xù)7天收集，用Coulter計數(shù)器測定細(xì)胞數(shù)，并繪制生長曲線。結(jié)果顯示7天后實驗組U251-SR細(xì)胞比對照組減少（72.0±4.0）%。菌落形成實驗將細(xì)胞接種到六孔板，培養(yǎng)12天后甲醇固定吉姆薩染色，實驗組U251-SR菌落形成率明顯低于對照組。FCM分析顯示G1期細(xì)胞增加，S期細(xì)胞減少，且U251-SR組異常細(xì)胞較對照組明顯增加，細(xì)胞有絲分裂發(fā)生障礙，凋亡較對照組明顯增加。該作者通過建立U251裸鼠移植瘤模型，用survivin-shRNA進(jìn)行干預(yù)，定期觀察并測量腫瘤大小，3周后U251 -SR組腫瘤體積和重量均明顯低于對照組。

Xing等［12］用靶向survivin-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染卵巢癌SKOV3細(xì)胞，F(xiàn)CM分析結(jié)果顯示，survivin-shRNA 組G1/G2期細(xì)胞數(shù)增多、S期細(xì)胞數(shù)減少，透視顯微鏡（TEM）及TUNEL染色結(jié)果顯示靶向survivin-shRNA促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制了腫瘤細(xì)胞增殖。

Liu等［13］用surviving-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前列腺癌DU145細(xì)胞，F(xiàn)CM分析結(jié)果顯示：實驗組Psi-svv細(xì)胞凋亡數(shù)為（10.31±1.23）%，對照組細(xì)胞凋亡數(shù)為（1.89±0.16）%，明顯促進(jìn)了前列腺癌細(xì)胞凋亡。該作者通過建立前列腺癌裸鼠移植瘤，并用survivinshRNA干預(yù)，70天后處死裸鼠，測量腫瘤的重量和體積。結(jié)果顯示：實驗組salmonella-psi-svv腫瘤重量為（2.04±0.71）g、腫瘤體積為（671.36±165.11）mm3，對照組腫瘤重量為（6.72±1.53）g、腫瘤體積為（4897.41±1289.37）mm3，可以看出靶向survivin-shRNA明顯的抑制了腫瘤組織的生長。

Zhang等［14］用survivin-shRNA干擾肝癌細(xì)胞生長實驗中，MTT結(jié)果顯示survivin-shRNA可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長和集落形成。FCM分析結(jié)果顯示實驗組G1期細(xì)胞比列增高，G2/M期相應(yīng)減少，說明survivin-shRNA可引起細(xì)胞有絲分裂障礙，使腫瘤細(xì)胞凋亡敏感性增加。該作者將survivin-shRNA腺病毒注射入裸鼠肝癌組織內(nèi)，觀察腫瘤生長情況，結(jié)果顯示靶向survivin-shRNA抑制了腫瘤組織的生長。

還有學(xué)者通過研究發(fā)現(xiàn)，通過對生存素基因的RNA干擾，能使人類宮頸癌細(xì)胞、腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞及乳腺癌細(xì)胞凋亡率顯著增高，增殖速度明顯減低［15］。腫瘤細(xì)胞的無限制增殖與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，因此抑制腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡是腫瘤治療的主要目的。國內(nèi)外學(xué)者的研究結(jié)果充分說明了靶向survivin-shRNA可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而達(dá)到抑制腫瘤生長的作用。

3.2抑制腫瘤血管形成 Zhen等［11］通過建立U251裸鼠移植瘤模型，用survivin-shRNA進(jìn)行干預(yù)，研究發(fā)現(xiàn)，實驗組與對照組相比腫瘤細(xì)胞增殖指數(shù)（proliferation index，PI）和微血管密度（microvessel density，MVD）明顯下降，可以看出靶向survivin-shRNA明顯抑制了腫瘤血管形成。

Zhang等［16］將構(gòu)建好的survivin-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞SGC-7901，定量聚合酶鏈反應(yīng)（Quantitative polymerase chain reaction，qPCR）及蛋白印跡（Western blot）分析顯示血管內(nèi)皮生長因子C（vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C）mRNA水平與survivin mRNA水平呈正相關(guān)，當(dāng)survivin表達(dá)下調(diào)時VEGF-C表達(dá)也下調(diào)。結(jié)果表明VEGF-C的表達(dá)水平受生存素影響，由此可見靶向survivin-shRNA可以抑制腫瘤血管形成。

3.3增加腫瘤對放化療及藥物治療的敏感性 Hu等［17］通過shRNA下調(diào)生存素的表達(dá)來觀察喉鱗癌細(xì)胞對放療的敏感性，實驗通過對荷瘤小鼠進(jìn)行放療治療，每隔4天測量一次腫瘤體積，結(jié)果顯示survivin-shRNA組腫瘤體積明顯小于對照組。這表明靶向survivin的shRNA明顯提高了腫瘤細(xì)胞對放療的敏感性。通過shRNA下調(diào)survivin來提高喉癌放療敏感性的同時也可以減少放療對正常組織的損失，對喉癌的治療有重大意義。

雖然急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）總體預(yù)后較過去幾十年有所改進(jìn)，但ALL的耐藥性復(fù)發(fā)仍然是一個亟待解決的問題。Park等［18］通過靶向survivinshRNA來抑制ALL的耐藥實驗顯示，對照組化療藥物長春新堿（vincristine，V）誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡50%的濃度（IC50）是實驗組survivin-shRNA的7.5倍。實驗通過靶向survivin-shRNA明顯提高了其對化療的敏感性，這對ALL的治療具有潛在的應(yīng)用價值。

Xue等［19］構(gòu)建攜帶靶向 survivin基因的 shRNA質(zhì)粒載體，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染人卵巢癌細(xì)胞株sKOV3和H08910，F(xiàn)CM及MTT結(jié)果顯示suvivin-shRNA與大黃素聯(lián)合應(yīng)用組細(xì)胞的增殖率低于單藥應(yīng)用組，凋亡率高于單藥應(yīng)用組。這一結(jié)果充分說明轉(zhuǎn)染suvivinshRNA后可以明顯提高卵巢癌sKOV3和H08910細(xì)胞對大黃素治療的敏感性。

4　小結(jié)

RNA干擾技術(shù)具有高效率、高特異性、抑制作用迅速、操作簡單、設(shè)備依賴性低等優(yōu)點。生存素靶向治療可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡并抑制其增殖，而對正常組織幾乎沒有不良影響，這是靶向治療所特有的優(yōu)點［20］。RNA干擾在腫瘤治療方面表現(xiàn)出其他治療方案無法比擬的優(yōu)勢。RNA干擾技術(shù)常用的載體有病毒載體和非病毒載體，由于病毒載體具有易于制備、宿主細(xì)胞范圍廣、轉(zhuǎn)染效率高、理化性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點，因此成為基因治療研究中應(yīng)用最為廣泛的載體，但對于病毒載體的安全性有待進(jìn)一步研究。

［1］Nikolovska-Coleska Z，Meagher JL，Jiang S，et al.Interaction of a cyclic，bivalent smac mimetic with the x-linked inhibitor of apoptosis protein［J］.Biochemistry，2008，47（37）：9811-9824.

［2］郝玉琴.Survivin與皮膚病的研究進(jìn)展［J］.中國麻風(fēng)皮膚病雜志，2011，27（4）：261.

［3］郝玉琴.生存素反義寡核苷酸在惡性腫瘤治療中的研究進(jìn)展［J］.中國麻風(fēng)皮膚病雜志，2012，28（5）：339-341.

［4］Vader G，Medema RH，Lens SM.The chromosomal passenger complex：guiding Aurora-B through mitosis［J］.J Cell Biol，2006，173（6）：833-837.

［5］Altieri DC.Survivin，cancer networks and pathway-directed drug discovery［J］.Nat Rev Cancer，2008，8（1）：61-67.

［6］Wang TT，Qian XP，Liu BR.Survivin：potential role in diagnosis，prognosis and targeted therapy of gastric cancer［J］. World J Gastroenterol，2007，13（20）：2784-2790.

［7］Capalbo G，Rodel C，Stauber RH，et al.The role of survivin for radiation therapy.Prognostic and predictive factor and therapeutic target［J］.Strahlenther Onkol，2007，183（11）：593-599.

［8］曾廣麗.RNA干擾技術(shù)在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用前景［J］.醫(yī)學(xué)信息，2013，26（4）：550-552.

［9］Tijsterman M，Ketting RF，Plasterk RH.The genetics of RNA silencing［J］.Annu Rev Genet，2002，36：489-519.

［10］Gou X，Yang HA，He WY，et al.Gene silence-induced downregulation of survivin inhibits bladder cancer cells［J］. Oncol Res，2011，19（12）：535-541.

［11］Zhen HN，Li LW，Zhang W，et al.Short hairpin RNA targeting survivin inhibits growth and angiogenesis of glioma U251 cells［J］.Int J Oncol，2007，31（5）：1111-1117.

［12］Xing J，Jia CR，Wang Y，et al.Effect of shRNA targeting survivin on ovarian cancer［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2012，138（7）：1221-1229.

［13］Liu YB，Zhang L，Guo YX，et al.Plasmid-based Survivin shRNA and GRIM-19 carried by attenuated Salmonella suppresses tumor cell growth［J］.Asian J Androl，2012，14 （4）：536-545.

［14］Zhang R，Ma L，Zheng M，et al.Survivin knockdown by short hairpin RNA abrogates the growth of human hepatocellular carcinoma xenografts in nude mice［J］.Cancer Gene Therapy，2010，17（4）：275-288.

［15］Weng CJ，Hsieh YH，Chen MK，et al.Survivin SNP-carcinogen interactions in oral Cancer［J］.J Dent Res，2012，91（4）：358-363.

［16］Zhang J，Zhu Z，Sun Z，et al.Survivin gene expression increases gastric cancer cell lymphatic metastasis by upregulating vascular endothelial growth factor-C expression levels ［J］.Mol Med Rep，2014，9（2）：600-606.

［17］Hu J，Pan J，Luo Z，et al.Downregulation of survivin by shRNA inhibits Invasion and enhances the radiosensitivity of laryngeal squamous cell carcinoma［J］.Cell Biochem Biophys，2015，72（1）：251-257.

［18］Park E，Gang EJ，Hsieh YT，et al.Targeting survivin overcomes drug resistance in acute lymphoblastic leukemia［J］. Blood，2011，118（8）：2191-2199.

［19］Xue H，Chen Y，Cai X，et al.The combined effect of svvtargeted shRNA and emodin on the proliferation and invasion of ovarian cancer［J］.Anticancer Drugs，2013，24（9）：937-944.

［20］Kanwar RK，Chenug CH，Chang JY，et al.Recent advances in anti-survivin treatments for cancer［J］.Curr Med Chem，2010，17（15）：1509-1515.

（收稿：2015-04-07）

Update of shRNA targeting survivin in the treatment of tumor

ZHANG Xin，HAO Yuqin.
Department of Dermatology，Third Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University，Baotou 014010，China
Corresponding author：HAO Yuqin，E-mail：haoyuqin0472@163.com

［Abstract］Survivin plays an important role in the inhibitor of apoptosis，which is considered as an ideal target for tumor treatment by more and more researchers.shRNA interference technique is targeted on the inhabiting the expression of survivin，so that inhibiting the proliferation of tumor cells，inducing the apoptosis of tumor cells，inhibiting the angiogenesis of tumor and enhancing the sensitivity of tumor cells to radiotherapy and chemotherapy.

surviving；shRNA；tumor

國家自然科學(xué)基金資助項目（編號：81260407）

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院（內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院），包頭，014010

郝玉琴，E-mail：haoyuqin0472@163.com