全可新 綜述 周運(yùn)恒 審校武警上海市總隊(duì)醫(yī)院檢驗(yàn)科（上海 201103）

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脲原體檢測的方法學(xué)研究進(jìn)展

全可新 綜述 周運(yùn)恒 審校
武警上海市總隊(duì)醫(yī)院檢驗(yàn)科（上海 201103）

脲原體（Ureaplasma spp.）是目前發(fā)現(xiàn)能在無生命培養(yǎng)基上生長繁殖的最小微生物，對培養(yǎng)基的營養(yǎng)要求較高，一般是以牛心浸液作基礎(chǔ)，添加10%～20%動物血清及10%新鮮酵母浸液等，生長需要一定的pH值和溫濕度等［1］。在2002年之前，一直認(rèn)為脲原體只有一個種，解脲脲原體，或溶脲脲原體/解脲支原體，之后根據(jù)表型和基因型特征分為兩大生物群共14個血清型［2］。目前，國內(nèi)仍有很多文獻(xiàn)默認(rèn)解脲脲原體為脲原體的唯一個種。脲原體屬于條件致病病原體，可黏附在泌尿生殖道的粘膜及上皮細(xì)胞，是引起性傳播疾病的常見病原體，還可以引起宮頸炎、盆腔炎、不孕不育、不良妊娠、前列腺炎、附睪炎等，致病性最強(qiáng)的是孕婦和新生兒［3-7］。流行病學(xué)調(diào)查提示，成年女性泌尿生殖道脲原體檢出率為40%～80%，男性為20%～58%［8］。其檢出率差別較大，可能與受檢人群和檢測方法等因素有關(guān)。目前，臨床上檢測脲原體的主要方法有液體培養(yǎng)法、固體培養(yǎng)法、免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法等，各種方法均有一定的優(yōu)缺點(diǎn)，現(xiàn)綜述如下。

一、液體培養(yǎng)法

目前國內(nèi)臨床實(shí)驗(yàn)室采用的主要檢測方法是液體培養(yǎng)法。該法操作簡單、僅靠肉眼結(jié)果無需特殊的儀器設(shè)備，商業(yè)化的支原體培養(yǎng)、鑒定、計數(shù)及藥敏一體化試劑盒可以對脲原體進(jìn)行半定量的檢測和對四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮類抗生素進(jìn)行定性藥敏檢測。其主要原理是脲原體可以分解尿素產(chǎn)NH3，根據(jù)培養(yǎng)基內(nèi)的酚紅指示劑顏色變化來判斷是否有脲原體生長。嚴(yán)格地說這種做法是錯誤的，只能算是脲原體分離培養(yǎng)的第一步。但液體培養(yǎng)法可以半定量計數(shù)，凡≥104顏色變化計數(shù)單位（color change units，CCU）/mL鑒定孔試劑變色為支原體陽性，≤104CCU/mL為攜帶者或無致病意義。

目前國內(nèi)生產(chǎn)脲原體試劑盒的廠家眾多，質(zhì)量也參差不齊，檢測的靈敏度和特異性各有差異，而且缺乏質(zhì)控品和統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，因此無法對商品化的試劑進(jìn)行統(tǒng)一評價［9］。該法已經(jīng)在臨床上沿用20年之久，存在雜菌干擾而致的假陽性、假陰性和容易污染使結(jié)果難以判斷等缺點(diǎn)。尤其是女性由于生理結(jié)構(gòu)的原因，棲居較多分解尿素的陰道菌群和宮頸菌群，如金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯、銅綠單胞菌和變形桿菌等。另外標(biāo)本中某些酵母菌和葡萄球菌的污染以及少量堿性標(biāo)本也是液體培養(yǎng)法假陽性增加的原因［10］。據(jù)曹愛國等研究報道液體培養(yǎng)基的假陽性率在20%左右［11］，也有報道用再培養(yǎng)法可以降低假陽性率［12］。

二、固體培養(yǎng)法

固體培養(yǎng)法可以通過顯微鏡觀察支原體特有的如“海膽型”或“油煎蛋樣”菌落，可以同時鑒別多種支原體，靈敏度和準(zhǔn)確性較高，不容易污染，是微生物診斷的金標(biāo)準(zhǔn)［13， 14］。但由于操作麻煩、培養(yǎng)時間長、成本較高以及有效期短等原因，再加上液體和固體法之間的陽性率也有一定的爭議，而且支原體形態(tài)和菌落較難辨認(rèn)以及存在異質(zhì)性等問題，目前國內(nèi)外臨床上固體培養(yǎng)法應(yīng)用甚少。

傳統(tǒng)的支原體分離培養(yǎng)過程應(yīng)有兩部分，肉湯增菌和濾液轉(zhuǎn)種，觀察其菌落形態(tài)，然后進(jìn)行Diense染色和生化反應(yīng)最終報告［15］。美國2010年第10版的《Manual of Clinical Microbiology》和中國2007年第三版的《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》都要求支原體的分離培養(yǎng)都包括肉湯增菌和轉(zhuǎn)種固體平板［16，17］。但這種間接轉(zhuǎn)種法需要將培養(yǎng)陽性的標(biāo)本轉(zhuǎn)種到固體瓊脂上，耗時更長，操作更加繁瑣，陽性率偏低，而且轉(zhuǎn)種的時間選擇不當(dāng)也會對結(jié)果造成影響，比如支原體含量高的標(biāo)本增殖高峰在6～12 h，而支原體含量低的標(biāo)本，增殖的高峰在12～24 h，增菌時間過長轉(zhuǎn)種會導(dǎo)致假陰性培養(yǎng)結(jié)果，如果轉(zhuǎn)種時間過短，小于10 h，可能沒有在支原體的對數(shù)生長期，也會導(dǎo)致陽性率降低［18］。

目前市場上主要用的是支原體選擇性固體瓊脂培養(yǎng)法，各種泌尿生殖道標(biāo)本均可以直接接種，48～72 h觀察結(jié)果，鏡下觀察背景很清晰，利用劃痕能很快找到瓊脂層表面并在劃痕附近找到支原體菌落，有利于菌種分離、純化、保存以做進(jìn)一步研究，還可通過菌落形成單位（colony forming units，CFU）推斷出標(biāo)本中支原體的真實(shí)含量，顯示出比液體培養(yǎng)基更為準(zhǔn)確、定量的優(yōu)點(diǎn)。固體-液體培養(yǎng)法聯(lián)合檢測具有更高的敏感性和特異性，最近吳磊等［19］報道固體培養(yǎng)與液體培養(yǎng)同時接種樣本，明顯縮短了固體培養(yǎng)的檢測周期，超過85%的支原體在24 h以內(nèi)觀察到菌落，而48 h以內(nèi)固體培養(yǎng)與液體培養(yǎng)的陽性率幾乎沒有差別。

三、免疫學(xué)方法

免疫學(xué)方法可通過直接檢測特異性抗原或抗體來判斷是否感染脲原體，可對脲原體的感染做出早期、快速的診斷。其操作簡單，快速，無需特殊設(shè)備，結(jié)果容易判斷，在臨床上可作為脲原體感染的輔助診斷指標(biāo)。常用的是金標(biāo)法，可一次檢測大量標(biāo)本，對脲原體感染的快速診斷及流行病學(xué)的研究調(diào)查具有較大的實(shí)用價值［20］。人體感染脲原體后，能產(chǎn)生特異性IgM類和IgG類抗體。IgM類抗體在感染1周后出現(xiàn)，3～4周達(dá)高峰，當(dāng)患者出現(xiàn)臨床癥狀而就診時，IgM抗體水平一般比較高，因此可作為急性期感染的診斷指標(biāo)。IgG抗體比IgM出現(xiàn)晚，需連續(xù)監(jiān)測觀察，在恢復(fù)期血清抗體效價比急性期血清效價增高4倍以上，才有診斷意義［21］。另一方面，由于健康人群中脲原體檢出率也很高，所以用抗體滴度很難解釋脲原體的感染，血清中抗體含量比較低也會出現(xiàn)假陰性，另外結(jié)果容易受到溶血、脂血的影響，導(dǎo)致免疫學(xué)檢測法的特異性不高，也未標(biāo)準(zhǔn)化，所以目前臨床上未能廣泛應(yīng)用。在脲原體的分型方法學(xué)上，基于抗脲原體血清型單克隆抗體的血清學(xué)分型研究發(fā)展最早，最初采用生長抑制試驗(yàn)或代謝抑制試驗(yàn)判斷菌株血清型別，但由于抗血清制備煩瑣，難得到商品化的各種抗血清，且不同抗血清型的單克隆抗體之間有不同程度的交叉反應(yīng)，缺乏可重復(fù)操作性，在臨床上也無法應(yīng)用［22］。

四、分子生物學(xué)檢測

分子生物學(xué)檢測主要是根據(jù)脲原體的尿素酶基因、多帶抗原基因和16S rRNA-23S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增檢測，應(yīng)用較多的是聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（Polymerase Chain Reaction， PCR），以及在此基礎(chǔ)上的其他PCR技術(shù)。例如，陸春等于2004年用聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象的多態(tài)性技術(shù)（PCR-SSCP）鑒定脲原體生物群和基因型［23］。Vancutsem于2011年用熒光實(shí)時定量PCR進(jìn)行分群［24］。Xiao于2010年建立了多重實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，可以對脲原體的兩群14個型同時進(jìn)行鑒定［25］。近期謝鑫友教授采用多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing， MLST）對脲原體進(jìn)行分群和分型，建立脲原體的MLST數(shù)據(jù)庫，揭示脲原體致病性和主要毒力株的MLST型，發(fā)現(xiàn)主要致病性克隆，為預(yù)防阻斷流行株的傳播和個體化治療提供依據(jù)［26，27］。

分子生物學(xué)方法簡便、快捷、靈敏度高、特異性高、重復(fù)性好、可以定量測定，目前在臨床上廣泛應(yīng)用，但需要嚴(yán)格、規(guī)范的實(shí)驗(yàn)環(huán)境和特殊的儀器設(shè)備，并且不能進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，在基層單位難以開展。另外，PCR方法靈敏度極高，在整個操作過程中PCR產(chǎn)物的污染會產(chǎn)生假陽性；PCR對死細(xì)胞同樣能進(jìn)行擴(kuò)增，能夠檢測出無復(fù)制活性的基因片段而導(dǎo)致假陽性。目前主要用于致病性和分群等方面的研究，研究表明并非所有的脲原體生物型都致病，其致病性可能與生物群或血清型別、宿主免疫力、性伴數(shù)、感染濃度、感染時間和機(jī)體微環(huán)境等多種因素有關(guān)［28，29］。

結(jié)　論

隨著脲原體致病性的深入研究，其檢測方法也在不斷的更新和規(guī)范，目前臨床上使用的各種方法各有優(yōu)勢和不足。液體培養(yǎng)法由于操作簡便、價格低廉、不需特殊設(shè)備、可以觀察藥敏結(jié)果等原因在國內(nèi)尤其是基層醫(yī)院仍會長期使用。為了提高特異性和準(zhǔn)確性，最好用液體培養(yǎng)法和固體培養(yǎng)法一步法聯(lián)合使用，既可對混合支原體進(jìn)行定性和定量檢測，又可進(jìn)行定性藥敏試驗(yàn)。分子生物學(xué)檢測方法可以快速準(zhǔn)確地對脲原體進(jìn)行分群和分型鑒定，為進(jìn)一步研究其分子流行病學(xué)、致病機(jī)制和耐藥機(jī)制提供依據(jù)。分子生物學(xué)和培養(yǎng)法互相補(bǔ)充，可以快速分離、培養(yǎng)和鑒定脲原體，能夠準(zhǔn)確衡量是否需要治療或是否治愈的熒光定量PCR定量技術(shù)將是未來檢測脲原體的研究方向。

致謝：本文由上海市自然科學(xué)基金（13ZR1449700）基金項(xiàng)目資助

關(guān)鍵詞脲原體屬；分子生物學(xué)

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（2015-11-30收稿）

doi：10.3969/j.issn.1008-0848.2016.03.019

中圖分類號R 446.5