一株雞源新城疫病毒的分離鑒定

周靈1，李燕芳2，馬夏利3

( 1.海鹽縣畜牧獸醫(yī)局，浙江海鹽314300; 2.海鹽縣畜牧獸醫(yī)聯(lián)站;3.海鹽縣武原鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)工作站)

摘要:從海鹽縣某雞場發(fā)病雞群采集的拭子樣品中分離到1株病毒，血凝試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果表明，該病毒可與1%雞血紅細(xì)胞發(fā)生凝集，且這種凝集作用可被新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽性血清所抑制。同時(shí)進(jìn)行RTPCR檢測，結(jié)果可擴(kuò)增出目的條帶，進(jìn)而確定該毒株為雞源新城疫病毒。根據(jù)OIE對新城疫病毒毒力的判定標(biāo)準(zhǔn)和方法對該病毒進(jìn)行雞胚平均致死時(shí)間( MDT)、1日齡易感雛雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)( ICPI)和雞胚半數(shù)致死量( ELD50)測定。結(jié)果表明，MDT =55.2 h，ICPI =1.76，ELD50=10－8.3/0.2 mL，最終判定該毒株為新城疫強(qiáng)毒株。

關(guān)鍵詞:新城疫病毒;分離鑒定;毒力測定

中圖分類號(hào):S858.31文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼: A

收稿日期:2014-08-15

新城疫是由新城疫病毒( NDV)引起的一種急性、敗血性傳染病，對養(yǎng)雞業(yè)危害極大。目前針對NDV的診斷技術(shù)，主要有臨床診斷與實(shí)驗(yàn)室診斷。臨床診斷依據(jù)出現(xiàn)典型的臨床癥狀與病理變化作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，但有部分病毒性疾病與ND癥狀相似，所以要借助實(shí)驗(yàn)室才能進(jìn)一步鑒定。實(shí)驗(yàn)室診斷包括采用雞胚分離法、血凝和血凝抑制試驗(yàn)( HA和HI)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)( ELISA)等技術(shù)，同時(shí)可用核酸探針技術(shù)、RT-PCR、RNA指紋圖譜法等分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。區(qū)別NDV毒力的方法很多，包括測定其生物學(xué)特性與根據(jù)其分子生物學(xué)特性建立的診斷方法等。

通過海鹽地區(qū)雞源新城疫病毒病的流行病學(xué)調(diào)查、進(jìn)行病原學(xué)分子流行病學(xué)、快速檢測診斷技術(shù)的研究，為有效防治雞源新城疫病毒病提供了理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

本研究以海鹽地區(qū)病雞組織中分離到的病毒為研究對象，進(jìn)行了病毒分離鑒定，為后期疫苗研制和疫病防控提供了基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料雞口腔拭子樣品采自海鹽縣某雞場發(fā)病雞群，由海鹽縣畜牧獸醫(yī)局實(shí)驗(yàn)室提供; 9～10日齡SPF雞胚購自北京某實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

主要試劑:宿主菌大腸桿菌( E.coli) DH5a由本室保存，質(zhì)粒pMD18-T Vector、Trizol RNA提取試劑、各種限制性內(nèi)切酶、ExTaqDNA聚合酶、DNA Marker膠回收試劑盒、新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、雞禽流感H5、H7、H9，EDS-76標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，1%雞紅細(xì)胞懸液(由本實(shí)驗(yàn)室配制)等。

1.2病毒分離將接種材料經(jīng)尿囊腔接種9日齡SPF雞胚5枚，0.1 mL/枚，37℃孵化，逐日觀察。棄去24 h內(nèi)死胚，每4 h照蛋一次，及時(shí)取出死亡雞胚，置4℃保存，無菌收集24～96 h死胚尿囊液; 96 h活胚置4℃過夜后，無菌收集尿囊液。

用SPF雞胚繼續(xù)傳代至第5代，收集尿囊液，－20℃保存?zhèn)溆?。將病毒分離株命名為HY0920株。

1.3血凝試驗(yàn)( HA)根據(jù)OIE標(biāo)準(zhǔn)選取96孔血凝板進(jìn)行血凝試驗(yàn)，每孔加入生理鹽水25 μL。每排第1孔加入25 μL待檢雞胚尿囊液，充分混勻后，吸取25 μL加入第2孔，充分混勻后，吸取25 μL加入第3孔，依此稀釋，至第11孔。

從第11孔吸取25 μL棄去，第12孔不加待檢尿囊液作為陰性對照。每孔加入濃度為1%的雞紅細(xì)胞懸液25 μL，充分混勻。將充分混勻后的血凝板置于37℃溫箱中，感作30 min，觀察鑒定結(jié)果。

1.4血凝抑制試驗(yàn)( HI) 96孔血凝板，每孔加入生理鹽水25 μL，分別于每排第1孔加入ND、EDS-76.AI( H5、H7、H9)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清25 μL，充分混勻后，吸取25 μL加入第2孔，再充分混勻后吸取25 μL加入第3孔，依此稀釋，至第11孔。

從第11孔吸取25 μL棄去，第12孔不加待檢血清作為對照。每孔加入含4個(gè)血凝單位的病毒液25 μL( 2. 2. 1血凝試驗(yàn)中出現(xiàn)完全凝集的雞胚尿囊液最大稀釋度為1個(gè)血凝單位)。將其充分混勻后置于37℃溫箱感作30 min后，再在每孔中加入濃度為1%的雞紅細(xì)胞懸液25 μL，充分混勻。將充分混勻的血凝板置于37℃溫箱，感作30 min，觀察結(jié)果。

1.5毒力測定

1.5.1雞胚平均致死時(shí)間( MDT)測定將經(jīng)過三次傳代的雞胚尿囊液用滅菌生理鹽水進(jìn)行1∶10稀釋，每個(gè)稀釋倍數(shù)分別接種5枚非免疫雞胚，每胚接種尿囊液0.1 mL，37℃溫箱孵育。棄去24 h內(nèi)死亡雞胚，每12 h照檢一次，連續(xù)觀察7 d，記錄雞胚死亡時(shí)間。

1.5.2易感雛雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)( ICPI)測定將經(jīng)過三次傳代的雞胚尿囊液用滅菌生理鹽水1∶10稀釋，腦內(nèi)接種1日齡易感雛雞，每羽接種尿囊液0.05 mL;另設(shè)對照組5羽，每羽腦內(nèi)接種滅菌生理鹽水0.05 mL;按分組進(jìn)行嚴(yán)格隔離詞養(yǎng)，觀察8 d，每日進(jìn)行記錄打分;死亡計(jì)2分，發(fā)病計(jì)1分，正常計(jì)0分。OIE提供的毒力鑒定分型標(biāo)準(zhǔn): ICPI值0.2～0.5為溫和型，0.5～1.5為中等毒力型，1. 5～2.0為強(qiáng)毒力型。

1.5.3雞胚半數(shù)致死量測定( ELD50)將經(jīng)過三次傳代的雞胚尿囊液用滅菌生理鹽水10倍遞次稀釋，分別接種于9日齡非免疫雞胚尿囊腔，每胚接種0.2 mL，每8枚雞胚為一個(gè)稀釋組，接種后以石蠟封口，置于37℃溫箱孵育;每天照蛋，棄去24 h內(nèi)死亡雞胚，24 h后死亡雞胚置4℃冰箱保存;連續(xù)觀察5 d，按照Reed-Muench方法計(jì)算ELD50。

2　結(jié)果與分析

2.1病毒分離培養(yǎng)與試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雞胚在接種尿囊液后32～72 h全部死亡。

檢查胚體，出血嚴(yán)重，呈透明狀，經(jīng)第三次傳代后死亡雞胚時(shí)間基本穩(wěn)定在42～60 h，死亡雞胚尿囊液清亮，胚體出血，尤以頭部最為嚴(yán)重。

2.2病毒鑒定

2.2.1血凝試驗(yàn)經(jīng)三次傳代的雞胚尿囊液按照OIE標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行血凝試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)雞胚尿囊液可凝集濃度為1%的雞胚紅細(xì)胞，血凝價(jià)為29。

2.2.2血凝抑制試驗(yàn)經(jīng)三次傳代的雞胚尿囊液按照OIE標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽性血清者可以抑制血凝作用，而采用EDS-76、AI( H5、H7、H9)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清者則無抑制凝集作用。

2.3毒力測定

2.3.1雞胚最小致死量平均死亡時(shí)間( MDT)測定

詳見表1。

表1　HY0920分離株MDT測定結(jié)果

由表1可見，可致雞胚全部死亡的最高稀釋倍數(shù)為10－6，MDT =2* 48 +3* 60/5 =55.2 h。

2.3.2易感雛雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)( ICPI)測定詳見表2。

表2　HY0920分離株1日齡雛雞腦內(nèi)接種分離毒后發(fā)病、死亡情況

由表2可見，經(jīng)過三次傳代的雞胚尿囊液對雞胚有很強(qiáng)的致死作用，死亡率很高;對照組注射生理鹽水全部正常存活。ICPI =141/80 =1.76。

2.3.3雞胚半數(shù)致死量測定( ELD50)詳見表3。

表3　HY0920分離株ELD50測定

由表3可見，測定的ELD50在8～9之間，按照Reed-Muench計(jì)算ELD50，ELD50=10－8.3/0.2 mL，即將病毒懸液作10－8.3稀釋后，接種非免疫雞胚，可使50%非免疫雞胚死亡;每0.2 mL病毒含量為10－8.3ELD50。

3　小結(jié)與討論

研究表明，本次海鹽地區(qū)分離到的一株病毒( HY0920)為雞源新城疫強(qiáng)毒株，血凝效價(jià)為29。MDT =55.2 h，ICPI =1.76，ELD50=10－8.3/0.2 mL。

目前區(qū)別NDV強(qiáng)弱毒的方法:一是根據(jù)NDV的生物學(xué)特性鑒定法評定，包括雞胚平均死亡時(shí)間( MDT)測定，腦內(nèi)接種致病指數(shù)( ICPI)測定，靜脈接種致病指數(shù)( IVPI)測定等;二是依據(jù)NDV強(qiáng)弱毒株F基因的裂解位點(diǎn)差異而建立的各種RT-PCR鑒定法，按照OIE標(biāo)準(zhǔn)測定NDV毒力標(biāo)準(zhǔn)所得結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但工作費(fèi)時(shí)、且有散毒危險(xiǎn)。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，國內(nèi)外學(xué)者對NDV各個(gè)基因序列的研究表明，NDV F蛋白氨基酸基序與毒力密切相關(guān)，強(qiáng)弱毒株在裂解位點(diǎn)的氨基酸序列有一定差異。本研究參照Genbank中的NDV強(qiáng)、弱毒株F基因序列及其F基因的保守序列，應(yīng)用DNA Star軟件Meg Align程序分析及在線軟件Primer Explorer V3，根據(jù)強(qiáng)弱毒株的堿基差異與保守性設(shè)計(jì)了3套能區(qū)別NDV強(qiáng)弱毒株的LAMP引物，用以區(qū)分NDV強(qiáng)弱毒株。

農(nóng)業(yè)部領(lǐng)導(dǎo)要求堅(jiān)定不移地推動(dòng)病死畜禽無害化處理機(jī)制建設(shè)

農(nóng)業(yè)部新聞辦公室消息:最近，農(nóng)業(yè)部在浙江省嘉興市召開病死畜禽無害化處理機(jī)制建設(shè)現(xiàn)場會(huì)議，總結(jié)病死豬無害化處理長效機(jī)制試點(diǎn)工作，分析當(dāng)前形勢，研究部署病死畜禽無害化處理機(jī)制建設(shè)有關(guān)工作。農(nóng)業(yè)部領(lǐng)導(dǎo)強(qiáng)調(diào)，有效解決病死畜禽無害化處理問題刻不容緩。

各地要進(jìn)一步總結(jié)推廣試點(diǎn)工作經(jīng)驗(yàn)和做法，加強(qiáng)病死畜禽無害化處理體系建設(shè)和監(jiān)管工作，堅(jiān)決杜絕隨意拋棄、經(jīng)營、屠宰加工病死畜禽等違法行為，確保病死畜禽基本實(shí)現(xiàn)無害化處理。

一是進(jìn)一步完善試點(diǎn)工作，把試點(diǎn)區(qū)域建設(shè)成示范區(qū)域。

二是大力推廣試點(diǎn)經(jīng)驗(yàn)，全面推動(dòng)病死畜禽無害化處理工作的順利開展。

三是嚴(yán)格落實(shí)國辦意見精神，確保各項(xiàng)政策落實(shí)到位。

四是因地制宜，合理規(guī)劃建設(shè)無害化收集處理體系。

五是履職盡責(zé)，全面強(qiáng)化病死畜禽無害化處理監(jiān)管。

春季是病死畜禽多發(fā)期，做好病死畜禽無害化處理工作尤為關(guān)鍵，各地要迅速部署，抓好落實(shí)，努力確保不發(fā)生亂拋病死畜禽危害環(huán)境和食品安全的現(xiàn)象。

專題論述