張國(guó)英，　鈕曉紅，　徐衛(wèi)平，　夏　廈

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗(yàn)科,江蘇 南京 210014)

淋巴結(jié)核患者外周血CD4+CD25highFoxP3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞以及血漿IFN-γ和IL-10水平及其臨床意義

張國(guó)英，鈕曉紅，徐衛(wèi)平，夏廈

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗(yàn)科,江蘇 南京 210014)

摘要：目的研究淋巴結(jié)核患者外周血CD4+CD25highFoxP3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)和干擾素γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素10(IL-10)水平的變化及臨床意義。方法采用流式細(xì)胞儀對(duì)100例淋巴結(jié)核患者及30名正常人外周血CD4+CD25highFoxP3+Treg和IFN-γ、IL-10水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果淋巴結(jié)核患者組與正常對(duì)照組比較，外周血CD4+CD25highFoxP3+Treg和IL-10水平均升高(P<0.05)，而IFN-γ水平則降低(P<0.05)。在干酪樣型、增殖型和混合型3種類(lèi)型的淋巴結(jié)核病之間各指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論淋巴結(jié)核患者細(xì)胞免疫功能明顯異常。CD4+CD25highFoxP3+Treg和IFN-γ、IL-10在淋巴結(jié)核的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

關(guān)鍵詞：CD4+CD25highFoxP3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞；干擾素γ；白細(xì)胞介素10；淋巴結(jié)核

中圖分類(lèi)號(hào)：

文章編號(hào)：1673-8640(2015)01-0031-05R446.63

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.01.008

Abstract:ObjectiveTo study the changes of peripheral blood CD4+CD25highFoxP3+regulatory T lymphocytes (Treg) and interferon gamma (IFN-γ), interleukin 10 (IL-10) levels of patients with lymph tuberculosis and their clinical significance. MethodsThe levels of peripheral blood CD4+CD25highFoxP3+Treg, IFN- γ and IL-10 of 100 lymph tuberculosis patients and 30 healthy subjects were determined by flow cytometry. ResultsCompared with the healthy controls, the levels of peripheral blood CD4+CD25highFoxP3+Treg and IL-10 levels in lymph tuberculosis group increased with statistical significance (P<0.05), while IFN-γ level decreased (P<0.05). Among the caseous, proliferation and mixed types of lymph tuberculosis, there was no significant difference (P>0.05). ConclusionsCellular immune function is significantly abnormal in patients with lymph tuberculosis. CD4+CD25highFoxP3+Treg, IFN- γ and IL-10 play important roles in the onset process of lymph tuberculosis.

基金項(xiàng)目：南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展項(xiàng)目(QYK11146)

作者簡(jiǎn)介：張國(guó)英，女，1978年生，碩士，副主任技師，主要從事微生物與免疫學(xué)研究。

收稿日期：(2014-01-21)

Levels of CD4+CD25highFoxP3+regulatory T lymphocytes in peripheral blood and plasma IFN-γ, IL-10 of patients with lymph tuberculosis and their clinical significanceZHANGGuoying,NIUXiaohong,XUWeiping,XIAXia.(DepartmentofClinicalLaboratory,NanjingHospitalofIntegratedTraditionalandWesternMedicine,NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,JiangsuNanjing210014,China)

Key words: CD4+CD25highFoxP3+regulatory T lymphocyte; Interferon gamma; Interleukin 10; Lymph tuberculosis

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染引起的慢性傳染病，其中，淋巴結(jié)核病是指發(fā)生于全身淋巴結(jié)的結(jié)核病，如頸部淋巴結(jié)核、腸系膜淋巴結(jié)核等，約占結(jié)核病的10%。對(duì)這類(lèi)結(jié)核病的研究，目前仍相對(duì)較少。臨床上因此漏診率、誤診率較高[1]。

結(jié)核分枝桿菌為胞內(nèi)寄生菌，機(jī)體的免疫清除作用主要依賴(lài)于分泌干擾素γ(interferon gamma，IFN-γ)的CD4+和CD8+效應(yīng)性T細(xì)胞。CD4+CD25highFoxP3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(regulatory T lymphocyte，Treg)是SAKAGUCHI等首先描述的在胸腺內(nèi)發(fā)育成熟的抑制自身免疫和移植排斥反應(yīng)的一群細(xì)胞，占CD4+T細(xì)胞總數(shù)的5%~10%[2]，能夠分泌白細(xì)胞介素10(interleukin 10，IL-10)等抑制因子，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[3]。

本研究分別采用流式細(xì)胞術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)淋巴結(jié)核患者外周血CD4+CD25highFoxP3+Treg和IFN-γ、IL-10水平，并探討其臨床意義。

材料和方法

一、研究對(duì)象

淋巴結(jié)核組：選取2012年4月至2013年4月在南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院住院就診的淋巴結(jié)核患者100例，男39例，女61例，年齡(44±17)歲，根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)2005年《臨床診療指南·結(jié)核病分冊(cè)》關(guān)于淋巴結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]確診，并排除由瘰疬分枝桿菌等引起的非結(jié)核性分枝桿菌淋巴結(jié)炎患者。其中干酪樣型21例、增殖型32例、混合型47例。正常對(duì)照組：選取健康體檢者30名，其中男16名，女14名，年齡(37±19)歲。

二、標(biāo)本采集

采集外周靜脈血5 mL，肝素鋰抗凝。分成2管，一管2 mL用于CD4+CD25highFoxP3+Treg檢測(cè)，另一管及時(shí)分離血漿，貯存于-80 ℃冰箱，用于檢測(cè)IFN-γ、IL-10水平。

三、方法

1. CD4+CD25highFoxP3+Treg的檢測(cè)在2 mL肝素抗凝血中加入2 mL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)稀釋全血，將全血混合液緩慢加至2 mL Ficoll液上，使其分層。1 000×g離心20 min，吸取中間白膜層單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，并用PBS洗滌1次(600×g離心5 min)。每管加入100 μL制備好的PBMC(1×106/mL)，并加入20 μL CD4-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocynate,FITC)/CD25-藻紅蛋白(phycoerythrin,PE)混合液，4 ℃下避光孵育30 min；經(jīng)流式染色緩沖液洗滌后加入1 mL Fixation/Permeabilization緩沖液，4 ℃下避光孵育45 min破膜。用破膜緩沖液洗滌2次后加入20 μL FoxP3-藻紅蛋白-菁藍(lán)色素?zé)晒馑?phycoerythrin cyanine 5,PECy5)(同型對(duì)照管加入20 μL IgG2a-PECy5)，于4 ℃避光孵育30 min。經(jīng)破膜緩沖液洗滌2次后用500 μL 流式染色緩沖液重懸，上流式細(xì)胞儀(FACS Canto Ⅱ型，美國(guó)BD公司)檢測(cè)。

2. IFN-γ、IL-10的檢測(cè)用ELISA進(jìn)行檢測(cè)，試劑盒購(gòu)自法國(guó)DIACLONE公司，用BIO-RAD EVOLIS全自動(dòng)酶免疫分析儀進(jìn)行測(cè)定。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果

一、 淋巴結(jié)核患者外周血CD4+CD25highFoxP3+Treg和IFN-γ、IL-10水平

與正常對(duì)照組比較，淋巴結(jié)核患者外周血CD4+CD25highFoxP3+Treg和IL-10水平均升高(P<0.05)，而IFN-γ水平則降低(P<0.05)。 見(jiàn)表1、圖1和圖2。

二、不同類(lèi)型淋巴結(jié)核患者外周血CD4+CD25highFoxP3+Treg和IFN-γ、IL-10水平

干酪樣型、增殖型和混合型淋巴結(jié)核患者外周血CD4+CD25highFoxP3+Treg、IFN-γ和IL-10水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表1淋巴結(jié)核組及正常對(duì)照組外周血CD4+CD25highFoxP3+Treg和IFN-γ、IL-10的水平比較

組別 例數(shù)CD4+CD25highFoxP3+Treg(%)IFN-γ(pg/mL)IL-10(pg/mL)淋巴結(jié)核組1002.32±0.2916.62±1.6316.74±2.21正常對(duì)照組302.01±0.4919.07±2.8514.50±1.56

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05

圖1　淋巴結(jié)核患者外周血CD4+CD25highFoxP3+Treg的流式圖

圖2　正常對(duì)照組外周血CD4+CD25highFoxP3+Treg的流式圖

組別 例數(shù)CD4+CD25highFoxP3+Treg(%)IFN-γ(pg/mL)IL-10(pg/mL)干酪樣型組212.29±0.5216.28±0.7517.05±2.13增殖型組322.36±0.1417.19±3.3516.01±2.45混合型組472.31±0.3016.51±1.6216.95±2.09

討論

MTB是一種胞內(nèi)寄生菌。機(jī)體在抵抗MTB感染的過(guò)程中，細(xì)胞免疫應(yīng)答發(fā)揮著重要作用，對(duì)結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸具有決定性意義[5]。而決定細(xì)胞免疫強(qiáng)弱的主要因素是血液中T淋巴細(xì)胞亞群及相關(guān)細(xì)胞因子的水平[6]。

CD4+CD25highFoxP3+Treg是一群具有免疫抑制效應(yīng)的T細(xì)胞亞群[7-9]，在調(diào)節(jié)自身反應(yīng)性T細(xì)胞的功能，維持機(jī)體免疫平衡和自身耐受，防止自身免疫性疾病發(fā)生過(guò)程中起著重要作用。其數(shù)量和功能缺陷會(huì)導(dǎo)致自身免疫性疾病，而數(shù)量和功能過(guò)度，則會(huì)抑制效應(yīng)T細(xì)胞的功能而導(dǎo)致腫瘤等疾病的發(fā)生[8]。 本研究分析了100例淋巴結(jié)核患者外周血中CD4+CD25highFoxP3+Treg的水平，發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比，淋巴結(jié)核患者的CD4+CD25highFoxP3+Treg明顯升高，提示淋巴結(jié)核患者由于CD4+CD25highFoxP3+Treg的數(shù)量增加，抑制了體內(nèi)T效應(yīng)細(xì)胞的功能，從而使CD4+CD25highFoxP3+Treg參與淋巴結(jié)核病的發(fā)生。

IFN-γ是一個(gè)由輔助T細(xì)胞(help T cell, Th)1分泌的重要細(xì)胞因子[10-11]，能激活巨噬細(xì)胞，增加它們對(duì)MTB的殺菌能力，在局部抗結(jié)核感染的防御機(jī)制中起重要作用[12]。IL-10對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用主要表現(xiàn)為2個(gè)方面，一方面具有抑制細(xì)胞免疫的作用，即通過(guò)對(duì)Th發(fā)揮作用，抑制T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的分泌[13]。另一方面，IL-10還能促進(jìn)Th0向Th2轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞增殖分化，介導(dǎo)體液免疫。Th2的增高可下調(diào)Th1反應(yīng)，抑制IFN-γ產(chǎn)生[14]。因此，IL-10可抑制細(xì)胞介導(dǎo)的抗MTB感染免疫反應(yīng)[15]。本研究通過(guò)檢測(cè)淋巴結(jié)核患者外周血IFN-γ、IL-10的水平發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，淋巴結(jié)核患者的IFN-γ水平顯著下降，而IL-10的水平顯著上升。提示在淋巴結(jié)核患者體內(nèi)，CD4+CD25highFoxP3+Treg通過(guò)分泌IL-10等抑制性細(xì)胞因子，間接抑制IFN-γ等的水平，進(jìn)而發(fā)揮免疫抑制功能，導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞免疫功能下降，引起MTB在體內(nèi)的慢性持續(xù)感染。

淋巴結(jié)核按病理學(xué)分型可分為3種類(lèi)型：干酪樣型、增殖型和混合型。本研究分別對(duì)3種類(lèi)型的淋巴結(jié)核患者進(jìn)行外周血CD4+CD25highFoxP3+Treg和IFN-γ、IL-10水平的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)3種類(lèi)型之間無(wú)明顯差異。進(jìn)一步表明在淋巴結(jié)核病的發(fā)病過(guò)程中，CD4+CD25highFoxP3+Treg和IFN-γ、IL-10發(fā)揮了重要作用。本研究因檢測(cè)例數(shù)不多，故未按不同的病程、治療方案等分組進(jìn)行比較，今后仍需進(jìn)一步收集資料進(jìn)行研究。

綜上所述，通過(guò)對(duì)淋巴結(jié)核患者外周血CD4+CD25highFoxP3+Treg以及血漿IFN-γ和IL-10水平的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)核患者的細(xì)胞免疫功能明顯異常，在MTB感染引起淋巴結(jié)核的過(guò)程中，CD4+CD25highFoxP3+Treg和細(xì)胞因子IFN-γ、IL-10發(fā)揮了重要作用。

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(本文編輯：姜敏)