朱英華　 李晶晶　 郭倩囡

端粒酶催化亞基hTERT調(diào)控乳腺癌細胞自我更新能力的探討

朱英華 李晶晶 郭倩囡

【摘要】目的球囊培養(yǎng)富集乳腺癌干性樣細胞并檢測hTERT的表達，進一步通過RNA干擾的方法探討其對乳腺癌細胞自我更新能力的影響。方法 球囊培養(yǎng)富集乳腺癌干性樣細胞，檢測乳腺癌干性細胞與分化細胞中hTERTmRNA及蛋白的表達，小分子RNA干擾敲低hTERT的蛋白表達水平。結果 乳腺癌干性細胞中hTERT表達升高，敲低其表達后乳腺癌細胞自我能力下降。結論 高表達的hTERT促進了乳腺癌細胞的自我更新能力。

【關鍵詞】端粒酶催化亞基hTERT；乳腺癌干性細胞

作者單位： 510120 廣東省廣州市中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院醫(yī)學研究中心基金項目：國家自然科學基金項目（編號：c002015010）

High Expressed hTERT Regulating the Self-renewal Ability of Breast Cancer Stem Cell

ZHU Yinghua LI Jingjing GUO Qiannan, Medical Research Center, Sun Yat-Sen Memorial Hospital Affiliated to Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510120, China

[Abstract]Objective To investigate the expression of hTERT and the effect of hTERT on the self-renewal ability of breast cancer stem cell. Methods Detecting the expression of hTERT by RT- PCR and Western Blot. Knockdown the expression of hTERT by RNA interference. Results We finded out that hTERT is high expressed in breast cancer stem cell, and reduced the expression of hTERT suppressed the self-renewal ability of breast cancer cell. Conclusion High expressed hTERT enhanced the selfrenewal ability of breast cancer stem cell.

[Key words]hTERT, Breast cancer stem cell

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，近年來已成為威脅女性健康的頭號殺手，乳腺癌的傳統(tǒng)治療方法包括外科手術摘除腫瘤、放療、化療、內(nèi)分泌治療等方法。雖然大多數(shù)乳腺癌患者從以上治療中獲益，但仍有不少的乳腺癌病人出現(xiàn)復發(fā)轉移[1]。大量研究證實了乳腺癌干細胞的存在，研究表明乳腺癌干細胞具有較強的自我更新能力、多向分化潛能以及多藥耐藥和放化療抵抗特性[2-4]。大量文獻已證明端粒酶在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[5-7]。因此，我們推測乳腺癌干細胞的存在是乳腺癌治療失敗的主要原因之一，而乳腺癌干細胞的發(fā)生形成機制并沒有研究透徹，本研究重點探討了端粒酶催化亞基hTERT對乳腺癌干細胞自我更新能力的影響，為乳腺腫瘤的臨床治療提供新的方向。

[1]薛宏宇. 凋亡通路蛋白表達對過氧化氫誘導PC12多細胞凋亡的影響[J]. 宿州學院學報，2011（5）：12-35.

[2] 焦鳳有. 左旋多巴聯(lián)合地昔帕明治療帕金森患者抑郁癥狀的效果研究[J]. 熱帶醫(yī)學雜志，2012(11)：8-13.

[3] Jean-Francois Trempe， Edward A. Fon. Structure and function of Parkin， PINK1， and DJ-1， the three musketeers of neuroprotection[J]. Frontiers in neurology，2013(4)：1-11.

[4] 李冬梅，盧幸明，叢志強. 多巴胺受體激動劑治帕金森病的臨床研究進展[J]. 國外醫(yī)學神經(jīng)病學神經(jīng)外科學分冊，2004(6)：16-20.

1　材料與方法

1.1材料

MCF7細胞使用DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；siRNA由吉瑪公司合成；RT-PCR kit購自invitrogen公司；轉染試劑購自invitrogen公司；hTERT抗體購買自ABCAM公司，GAPDH抗體購自PTG公司。

1.2球囊培養(yǎng)

將MCF7細胞胰酶消化成單細胞懸液并計數(shù)，然后將細胞種入球囊培養(yǎng)基中，最終細胞密度為1 000/毫升，懸浮狀態(tài)下培養(yǎng)兩周收獲球囊。

1.3RNA干擾實驗

轉染前24小時，將MCF7細胞鋪入培養(yǎng)板中，24小時后細胞密度達到50%，按照轉染試劑說明將轉染試劑和siRNA混合后靜置15分鐘后，將混合物轉入細胞中，6小時換新鮮培養(yǎng)基，48小時后收獲細胞。

1.4RT-PCR

Trizol法提取細胞總RNA，逆轉錄試劑盒將RNA反轉為cDNA，反應條件參照試劑盒說明書，然后于PCR方法檢測基因表達并以GAPDH作為內(nèi)參進行相對定量。

2　結果

2.1hTERT在乳腺癌球囊細胞中高表達

將乳腺癌細胞MCF7貼壁細胞進行懸浮球囊培養(yǎng)后，分別抽提mRNA和蛋白，利用半定量PCR及免疫印跡法檢測hTERT在貼壁細胞及球囊細胞中的表達。實驗結果顯示乳腺癌球囊細胞中hTERT在mRNA水平（圖1, A）和蛋白水平（圖1, B）均有升高。

2.2降低hTERT的表達影響了乳腺癌細胞的球囊形成能力

本研究利用RNA干擾的方法敲低hTERT的表達進而研究其對球囊形成能力的影響。MCF7細胞中hTERT的表達被敲低后（圖2, A），其球囊形成能力明顯下調(diào)（圖2, B），這提示hTERT可能參與調(diào)控了乳腺癌細胞的球囊形成能力。

圖1　RT-PCR和western 檢測乳腺癌細胞中hTERT的表達情況

圖2　hTERT調(diào)控了乳腺癌細胞的球囊形成能力

3　討論

端粒酶主要由端粒酶RNA組分（telomerase RNA, TR），端粒酶相關蛋白和端粒酶催化亞基（telomerase reverse transcriptase, TERT）三部分組成，其主要功能是通過防止染色體復制時端粒的丟失進而維護細胞的有絲分裂增殖能力[8-10]。正常人體細胞在體外培養(yǎng)過程中由于染色體不完全復制，染色體末端端粒序列隨著有絲分裂次數(shù)的增加逐漸縮短，直到某個臨界點，端粒不能保護染色體末端的重組和降解，細胞退出增殖周期以至衰老。而端粒酶最主要的功能便是防止染色體復制導致的端粒丟失進而維持細胞的有絲分裂增殖能力。近年來，大量研究證實了腫瘤干細胞的存在，腫瘤干細胞像正常干細胞一樣通過相同的調(diào)控因子調(diào)控細胞的自我更新功能和多向分化潛能，腫瘤干細胞的存在被認為是腫瘤復發(fā)、轉移以及放化療失敗的因素之一。因此，探討端粒酶在乳腺癌干細胞中的作用機制顯得尤為必要。在本研究中，我們通過球囊培養(yǎng)的方法富集乳腺癌干細胞，發(fā)現(xiàn)乳腺干細胞中端粒酶催化亞基hTERT高表達，敲除hTERT后球囊形成能力明顯下降。這提示端粒酶調(diào)控了乳腺癌干細胞的自我更新功能，為乳腺癌的臨床治療提供了新的靶標。

參考文獻

[1]隋曉英. 乳腺癌臨床病理資料分析[J]. 中國繼續(xù)醫(yī)學教育，2015，7(4)：172-173.

[2] YuanY，ShenH，F(xiàn)ranklinDS，et al. Invivosel-frenewing divisions of haematopoietic stem cells are increased in the absence of the early G1-phase inhibitor p18INK4C[J]. Nature Cell Biology， 2004(6)：436-442.

[3] Yang YM， ChangJW. Current status and issues in cancer stem study[J]. Cancer Investigation， 2008(26)：741-755.

[4] Soltysova A，A ltanerova V，A ltaner C. Cancer stem cells[J]. Neoplasma，2005，52(6)：435-440.

[5] Pooley KA，Sandhu MS，Tyrer J，Shah M，Driver KE Luben RN，et al. Telomere length in prospective and retrospective cancer case-control studies[J]. Cancer Res，2010，70(8)：3170-3176.

[6] Jones AM，Beggs AD，Carvajal-Carmona L，F(xiàn)arrington S，Tenesa A，Walker M，et al. TERC polymorphisms are associated both with susceptibility to colorectal cancer and with longer telomeres[J]. Gut，2012，61(2)：248-254.

[7] Engelhardt M，Drullinsky P，Guillem J，Moore MA. Telomerase and telomere length in the development and progression of premalignant lesions to colorectal cancer[J]. Clin Cancer Res，1997，3(11)：1931-1941.

[8] Meeker AK，Hicks JL，Iacobuzio-Donahue CA，Montgomery EA，Westra WH，Chan TY，et al. Telomere length abnormalities occur early in the initiation of epithelial carcinogenesis[J]. Clin Cancer Res，2004，10(10)：3317-3326.

[9] Pampalona J，Soler D，Genesca A，Tusell L. Whole chromosome loss is promoted by telomere dysfunction in primary cells[J]. Genes Chromosomes Cancer ，2010，49(4)：368-378.

[10] Zou Y，Misri S，Shay JW，Pandita TK，Wright WE. Altered states of telomere deprotection and the two-stage mechanism of replicative aging[J]. Mol Cell Biol，2009，29(9)：2390-2397.

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2015.25.043

【文章編號】1674-9308（2015）25-0063-02

【文獻標識碼】B

【中圖分類號】R737.9