嚴(yán)陶陶

Parkin基因在帕金森疾病中的作用機(jī)制

嚴(yán)陶陶

【摘要】目的以原代細(xì)胞和PC12細(xì)胞為載體，考察Parkin基因在帕金森疾病中的作用機(jī)制。方法 對(duì)比Parkin基因正常表達(dá)與基因沉默時(shí)神經(jīng)細(xì)胞被MPP+誘導(dǎo)凋亡過(guò)程中的差異。結(jié)果 使用MPP+進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜通透性變大，表明了MPP+確實(shí)誘導(dǎo)大量細(xì)胞凋亡。 結(jié)論P(yáng)arkin蛋白無(wú)法正常表達(dá)可能引起帕金森疾病。

【關(guān)鍵詞】1-甲基-4-苯基-吡啶；Parkin基因；基因沉默；帕金森病

作者單位： 116024 大連理工大學(xué)

Parkin Gene Mechanisms in Parkinson's Disease

YAN Taotao, Dalian University of Technology, Dalian 116024, China

[Abstract]Objective In order to the original generation cells and PC12 cells as the carrier, to explore the role of Parkin gene in Parkinson's disease mechanism. Methods compare the normal Parkin gene expression and gene silencing of nerve cells was the differences in the process of MPP+induced apoptosis. Results Parkinson's disease is caused by parkin protein innormal expression. Conclusion In order to reveal the genetic type of the molecular mechanism of Parkinson's disease to make a certain contribution.

[Key words]1-methyl-4-phenyl-pyridine, Parkin gene, Gene silencing, Parkinson's disease

1 原代神經(jīng)細(xì)胞中Parkin基因?qū)ε两鹕Y的影響

1.1實(shí)驗(yàn)方法

1.1.1全腦、中腦及海馬細(xì)胞的培養(yǎng) 將小鼠全腦、中腦及海馬部位的神經(jīng)細(xì)胞置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～15天，培養(yǎng)基是DMEM補(bǔ)加10%滅活胎牛血清、130 mg/L青那霉素。

1.1.2MPP+對(duì)細(xì)胞的損傷 獲取全腦、中腦及海馬神經(jīng)細(xì)胞，取處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，向細(xì)胞中加入劑量分別為0.1 μM、1 μM、10 μM的MPP+，與細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)，收集細(xì)胞。通過(guò)免疫組化染色，觀察三個(gè)部位神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。同時(shí)，通過(guò)MTT比色法，向上述中收集的經(jīng)MPP+處理過(guò)的細(xì)胞中加入MTT，使其終濃度為0.5 mg/ml，再將96孔板置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3小時(shí)。然后將MTT連同培養(yǎng)基一同用移液槍吸取棄去，并向每孔中加入200 μl二甲基亞砜（DMSO）溶解藍(lán)紫色結(jié)晶物，用酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)定吸收度，計(jì)算細(xì)胞活力。

1.1.3Caspase-3,9活性的檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)下的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。向細(xì)胞中加入劑量為10 μM的MPP+[1]，與細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)，收集細(xì)胞，并檢測(cè)Caspase-3，9活性。將收集到的細(xì)胞用冷PBS沖洗三次，并重懸在裂解液中，于冰上放置40分鐘。然后將懸液離心5分鐘。分別以AC-DEVD-AMC、ACLEHD-AFC為熒光底物，將含有50 μg蛋白的裂解物與100 μM底物在37℃孵育1小時(shí)。然后用7620型熒光分光光度計(jì)檢測(cè)光密度，即可間接

反應(yīng)Caspase-3的活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的比值作為Caspase的活性指標(biāo)，對(duì)比各組間的差別。

1.1.4Western blotting檢測(cè)Parkin的表達(dá) 向全腦、中腦及海馬腦組織中分別加入劑量為10 μM的MPP+培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，均加入適當(dāng)細(xì)胞裂解液。用Lowery法測(cè)定樣品中的蛋白濃度，取等量蛋白做十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳到預(yù)定位置后，用DYCP半干式轉(zhuǎn)膜儀將蛋白條帶印跡到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜前，將PVDF膜浸在甲醇中1分鐘，然后在轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5分鐘；印跡后的膜用含5%小牛血清的TBS（20 mmol/ml Tris-HCl緩沖液，pH 7.5，150 mmol/mL NaCl）封閉2 h(室溫)，然后加入β-actin抗體、parkin抗體搖床4℃孵育過(guò)夜（12～24 h)。次日，用加0.1%Tween-20 的TBS洗膜三次，每次5分鐘；接著用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG孵育1小時(shí)，洗膜后用DAB控制顯色，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析斑點(diǎn)面積。

1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.2.1MPP+對(duì)全腦、中腦及海馬細(xì)胞的形態(tài)學(xué)的影響 在顯微鏡下觀察MPP+對(duì)各部位細(xì)胞的損傷程度[2]，可以得出，海馬細(xì)胞與全腦細(xì)胞形態(tài)均無(wú)太大變化，而中腦細(xì)胞形態(tài)變化較大，即已受到很大損傷，說(shuō)明中腦細(xì)胞對(duì)MPP+等神經(jīng)性藥物更為敏感。

1.2.2 MTT檢測(cè)細(xì)胞活力 對(duì)細(xì)胞應(yīng)用MTT比色法，檢測(cè)細(xì)胞的存活與生長(zhǎng)，對(duì)比不同劑量的MPP+作用48小時(shí)后的細(xì)胞存活數(shù)據(jù)可以看出，同種細(xì)胞的損傷程度隨MPP+呈劑量依賴性。而觀察加入相同劑量的MPP+時(shí)，三種細(xì)胞的損傷程度始終是中腦細(xì)胞最嚴(yán)重，進(jìn)一步證明了1.2.1的結(jié)論即中腦細(xì)胞對(duì)MPP+等神經(jīng)性藥物更為敏感，中腦部位腦組織在MPP+劑量為10 μM時(shí)活性下降了34.8%。

1.2.3MPP+對(duì)半胱氨酸酶凋亡通路活性的影響 在MPP+的作用下，三個(gè)部位細(xì)胞中的Caspase-3,9均被顯著激活，且中腦細(xì)胞中酶活性上升最為顯著，說(shuō)明MPP+參與激活Caspase凋亡通路而引起細(xì)胞大規(guī)模凋亡。

1.2.4MPP+對(duì)Parkin表達(dá)量的影響 與正常細(xì)胞Parkin蛋白含量相比，在加入MPP+后，全腦和海馬細(xì)胞中Parkin表達(dá)均有少量減弱但并不是非常明顯，中腦細(xì)胞中Parkin含量驟降，這表明MPP+對(duì)中腦影響最大，且影響Parkin的正常表達(dá)。

2　PC12細(xì)胞中Parkin基因?qū)ε两鹕Y的影響

2.1實(shí)驗(yàn)方法

2.1.1PC12細(xì)胞的培養(yǎng) 將PC12細(xì)胞在37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基是DMEM補(bǔ)加10%滅活胎牛血清、100 U/ml 青霉素，100 mg/l鏈霉素。隔天換液。

2.1.2誘導(dǎo)基因沉默 用小細(xì)胞培養(yǎng)瓶（底面積為10 cm2）培養(yǎng)細(xì)胞[3]至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將Parkin蛋白的小干擾RNA分別通過(guò)lipo2 000轉(zhuǎn)入正常培養(yǎng)且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞內(nèi)，48小時(shí)后，收集細(xì)胞，檢測(cè)小RNA干擾后的細(xì)胞中Parkin蛋白含量。

2.1.3乳酸脫氫酶（LDH）的釋放 用10μM的MPP+處理基因沉默后的PC12細(xì)胞，培養(yǎng)48小時(shí)。使用LDH檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中的代謝物乳酸脫氫酶的釋放率。

2.1.4凋亡小體的檢測(cè) 觀察MPP+處理48小時(shí)前后細(xì)胞的形態(tài)變化。將MPP+處理48小時(shí)后的PC12細(xì)胞用Hoechst33258進(jìn)行染色，在熒光顯微鏡下觀察檢測(cè)凋亡小體。將實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組細(xì)胞中的熒光反應(yīng)相對(duì)比，觀察熒光強(qiáng)弱以及是否出現(xiàn)熒光強(qiáng)的凋亡小體。

2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1Parkin基因沉默 對(duì)比Parkin蛋白的條帶能夠發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)入小干擾RNA的細(xì)胞中的Parkin蛋白含量與未轉(zhuǎn)入小干擾RNA的細(xì)胞相比明顯減少，說(shuō)明小干擾RNA已經(jīng)成功致使Parkin基因沉默無(wú)法正常轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

圖1　MPP+對(duì)Parkin基因沉默的PC12細(xì)胞的影響

圖2　MPP+對(duì)Parkin基因沉默后細(xì)胞的LDH釋放的影響

圖3　MPP+對(duì)凋亡小體形成的影響

2.2.2MTT檢測(cè)細(xì)胞活力 在經(jīng)過(guò)MTT比色法檢測(cè)后，我們

發(fā)現(xiàn)與陰性對(duì)照組細(xì)胞相比，基因沉默后的PC12細(xì)胞活力更低，說(shuō)明Parkin基因無(wú)法正常表達(dá)時(shí)，MPP對(duì)細(xì)胞活力的影響更大。在加入MPP+劑量為100 μM時(shí)基因沉默PC12細(xì)胞的細(xì)胞活性下降了81.4%。而對(duì)比加入不同劑量MPP+，基因沉默后的PC12細(xì)胞的細(xì)胞活力隨MPP+劑量的升高而下降，即細(xì)胞受損程度與MPP+呈現(xiàn)劑量依賴性，劑量越高受損越嚴(yán)重（圖1）。

2.2.3LDH釋放量檢測(cè) 對(duì)Parkin基因沉默后的細(xì)胞進(jìn)行MPP+處理后，檢測(cè)細(xì)胞液中LDH含量，LDH含量與MPP+呈現(xiàn)劑量依賴性并隨之升高，同時(shí)LDH含量與陰性對(duì)照組細(xì)胞相比有所上升，說(shuō)明細(xì)胞膜通透性變大（圖2）。

2.2.4凋亡小體的檢測(cè) 在光學(xué)顯微鏡下可觀察MPP+處理48小時(shí)后，部分細(xì)胞表現(xiàn)出凋亡的特征：細(xì)胞皺縮，胞體由梭型漸漸變圓。用Hoechst33258進(jìn)行染色后，通過(guò)對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)高劑量MPP+對(duì)基因沉默的PC12細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)，熒光明顯增多，即凋亡小體大量出現(xiàn)，表明MPP+加速了細(xì)胞凋亡（圖3）。

3　總結(jié)

在Parkin基因[4]正常表達(dá)時(shí)，不同劑量MPP+會(huì)對(duì)同種細(xì)胞造成不同程度的損傷，且細(xì)胞的損傷程度隨MPP+呈劑量依賴性、劑量增大而增大。加入相同劑量的MPP+時(shí)，三種細(xì)胞的損傷程度總是中腦細(xì)胞最嚴(yán)重，即中腦細(xì)胞對(duì)MPP+等神經(jīng)性藥物更為敏感。

在Parkin基因正常表達(dá)時(shí)，加入MPP+處理細(xì)胞，與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的半胱氨酸酶（Caspase）活性大幅上升，以富含多巴胺能神經(jīng)元的中腦神經(jīng)細(xì)胞中Caspase活性上升最為明顯。MPP+參與激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，可以加速細(xì)胞凋亡和裂解。同時(shí)，Parkin含量在MPP+處理后大量減少，說(shuō)明MPP+影響了Parkin的正常表達(dá)。

在Parkin基因沉默的狀態(tài)下，加入MPP+后，細(xì)胞中乳酸脫氫酶（LDH）的釋放量及凋亡小體含量均呈上升趨勢(shì)，Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)被激活，細(xì)胞活力明顯下降，細(xì)胞凋亡通路激活。Parkin基因的沉默表達(dá)可能引發(fā)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而引起帕金森癥的發(fā)病。

參考文獻(xiàn)

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2015.25.042

【文章編號(hào)】1674-9308（2015）25-0061-03

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B

【中圖分類號(hào)】R741.02