陳　笑，富志軍

(中國(guó)藥科大學(xué)中藥制劑教研室，南京　210009)

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超聲結(jié)合回流提取對(duì)蓮心總堿得率的影響

陳笑，富志軍*

(中國(guó)藥科大學(xué)中藥制劑教研室，南京210009)

摘要：目的考察超聲結(jié)合回流提取法對(duì)蓮子心中總生物堿得率的影響。方法以總堿得率為指標(biāo)，在對(duì)影響超聲及回流提取因素進(jìn)行單因素考察的基礎(chǔ)上，采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化超聲結(jié)合回流提取工藝，并與單一回流提取工藝比較。結(jié)果正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲時(shí)間對(duì)蓮心總堿得率影響極為顯著，其次為超聲功率，超聲結(jié)合回流提取蓮心總堿的平均得率可達(dá)10.06 mg·g-1，而單一回流提取總堿得率僅為7.14 mg·g-1。 結(jié)論與單一回流提取法相比，新技術(shù)超聲強(qiáng)化提取確能提高總堿得率，減少總生物堿受熱時(shí)間，從而保護(hù)其不受破壞，為蓮心總堿的提取提供了高效新穎的方法，也為新技術(shù)超聲強(qiáng)化提取含不穩(wěn)定有效成分中藥材進(jìn)行了有益的探索。

關(guān)鍵詞：蓮心總堿；超聲強(qiáng)化；回流提??；正交實(shí)驗(yàn)

蓮子心是睡蓮科植物蓮NelumbonuciferaGaertn.的成熟種子中的干燥幼葉及胚根，性苦、寒，歸心、腎經(jīng)，具有清心安神、交通心腎、澀精止血的功效[1]?，F(xiàn)代研究表明，蓮子心中含有生物堿、黃酮、谷甾醇、揮發(fā)油和微量元素等化學(xué)成分。其中生物堿是主要藥效成分，也是目前研究最廣的成分，主要包括蓮心堿、甲基蓮心堿、異蓮心堿等，具有降血壓、抗心律失常、抗血小板聚集、抗脂質(zhì)過(guò)氧化及清除自由基、抗癌等藥理作用[2]。關(guān)于蓮子心生物堿的提取方法，文獻(xiàn)報(bào)道的有回流法[3]、酸液滲漉法[4]、超聲法[5]、半仿生提取法[6]、超聲-微波協(xié)同萃取法[7]等?；亓鞣ㄒ蚬に嚭?jiǎn)單，對(duì)設(shè)備要求低而被廣泛采用，但其最大的缺點(diǎn)是提取溫度高，在提取過(guò)程中，結(jié)構(gòu)中具有多個(gè)酚羥基的蓮心總堿[8]易被氧化降解；超聲波提取法可提高提取效率，縮短提取時(shí)間，無(wú)需加熱，因而能最大限度地保護(hù)有效物質(zhì)的生物活性，是強(qiáng)化提取的重要手段之一[9-10]。本實(shí)驗(yàn)旨在熱回流提取的基礎(chǔ)上，結(jié)合超聲波強(qiáng)化處理來(lái)提取蓮心總堿以探討超聲對(duì)于回流提取蓮心總堿的強(qiáng)化作用，提高提取率，為蓮心總堿的開(kāi)發(fā)利用提供高效的提取方法。

1儀器與試藥

1.1儀器LC-2010A HT高效液相色譜儀(島津)；Hedera ODS-2色譜柱(江蘇漢邦科技有限公司)；恒溫水浴鍋B260，RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；萬(wàn)分之一電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；FA/JA型電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)；KH-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；D2F6090真空干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2試藥蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿對(duì)照品(中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所,質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%，批號(hào)分別為MUST-12022203，MUST-14022204，MUST-14022205)；藥材蓮子心購(gòu)自湖南省高圣中藥飲片有限公司，經(jīng)中國(guó)藥科大學(xué)生藥教研室鑒定為睡蓮科植物蓮NecumbonuciferaGaertn.的成熟種子中的干燥幼葉及胚根；甲醇(江蘇漢邦科技有限公司)；無(wú)水乙醇、三乙胺(上海泰坦化學(xué)有限公司)；氫氧化鈉、硫酸(南京化學(xué)試劑有限公司)；娃哈哈純凈水(南京娃哈哈飲料有限公司)；甲醇為色譜純;其他化學(xué)試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1蓮心總堿含量測(cè)定

2.1.1色譜條件色譜柱為漢邦Hedera ODS-2色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-0.5 mL·L-1三乙胺水溶液(72.5∶27.5)；流速為1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量為20 μL。見(jiàn)圖1。

2.1.2對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取蓮心堿對(duì)照品4.9 mg、異蓮心堿對(duì)照品4.8 mg、甲基蓮心堿對(duì)照品6.9 mg，分別置于5 mL量瓶中，加適量甲醇超聲溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得0.98 mg·mL-1的蓮心堿對(duì)照品溶液、0.96 mg·mL-1的異蓮心堿對(duì)照品溶液和1.36 mg·mL-1的甲基蓮心堿對(duì)照品溶液。分別精密吸取以上3種對(duì)照品溶液各2.0 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得含蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿分別為196，192和272 μg·mL-1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，避光，4 ℃冷藏，備用。

圖1HPLC圖

A.混合對(duì)照品；B.總堿提取物；1.蓮心堿；2.異蓮心堿；3.甲基蓮心堿

Fig.1 HPLC chromatograms

A. mixed control substances; B. total alkaloids extract;

1. liensinine; 2. isoliensinine; 3. neferine

2.1.3線性關(guān)系考察精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1，0.3，0.5，0.7，1.0，2.0和3.0 mL，分別置于5 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得一系列濃度梯度的對(duì)照品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，分別以蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿對(duì)照品的質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)(X)，進(jìn)行回歸分析，得各生物堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。蓮心堿：Y=10 181X-2 695，r=0.999 9；異蓮心堿：Y=12 083X-4 322，r=0.999 9；甲基蓮心堿：Y=13 065X-6 143，r=0.999 9。3種生物堿分別在3.92～117.60，3.84～115.20和5.44～163.20 μg·mL-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.1.4供試品溶液的制備取實(shí)驗(yàn)室自制蓮心總堿提取物約10 mg，精密稱(chēng)定，置于10 mL量瓶中，加適量甲醇超聲溶解并定容，精密移取1 mL,用甲醇稀釋至10 mL，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。

2.1.5樣品含量測(cè)定按2.1.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1.1項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定峰面積，并用以下公式計(jì)算蓮子心提取物中各生物堿含量、總堿含量和總堿得率。

總堿含量(%)=蓮心堿(%)+異蓮心堿(%)+甲基蓮心堿(%)

C：生物堿質(zhì)量濃度/μg·mL-1;W0：藥材質(zhì)量/g;

W1：總堿提取物/g;W2：供試品量/mg

2.2蓮心總堿提取工藝篩選

2.2.1超聲結(jié)合回流提取方法取藥材蓮子心粗粉，加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇，浸泡30 min，超聲處理一段時(shí)間之后，置于水浴中回流提取，重復(fù)數(shù)次。提取液合并，減壓回收乙醇至近干，加適量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的硫酸溶液溶解，過(guò)濾，濾液用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100 g·L-1的氫氧化鈉溶液調(diào)pH為7～9，沉淀，放置，過(guò)濾并用少量冷水洗滌沉淀3～4次，將所得沉淀置于40 ℃條件下真空干燥(約4 h)，得蓮心總堿提取物。

2.2.2單因素實(shí)驗(yàn)以總堿得率為指標(biāo)，考察了以下各因素對(duì)蓮心總堿得率的影響：粉碎度(完整飲片，不加篩粉碎，20和60目)；提取次數(shù)(1，2，3和4次)；回流溫度(50，60，70，80和90 ℃)；乙醇體積分?jǐn)?shù)(70%，75%，80%，85%和90%)；乙醇體積(4，6，8，10和12倍)；回流時(shí)間(60，90，120，150和180 min)；超聲時(shí)間(15，30，45和60 min)及超聲功率(60，70，80，90和100 W)。結(jié)果表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)、回流時(shí)間、超聲時(shí)間、超聲功率對(duì)提取效果的影響較大。4個(gè)因素總堿得率的變化均先增加后減少，分別在乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%、回流時(shí)間為150 min、超聲功率為90 W、超聲時(shí)間為30 min時(shí)達(dá)到最大值。綜合考慮提取效果、時(shí)間及成本，其他條件的最優(yōu)值分別為：藥材粒度20目，提取次數(shù)2次，回流溫度80 ℃，乙醇體積10倍量。

2.2.3正交實(shí)驗(yàn)(1)正交實(shí)驗(yàn)因素水平表通過(guò)以上單因素實(shí)驗(yàn)，篩選出對(duì)蓮心總堿得率影響較大的4個(gè)因素：乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、回流時(shí)間(B)、超聲時(shí)間(C)、超聲功率(D)，每個(gè)因素3個(gè)水平，建立正交實(shí)驗(yàn)L9(34)表，如表1所示。

表1 因素水平表

Tab.1 The factors and levels of the extraction process

水平因素A.乙醇體積分?jǐn)?shù)/%B.回流時(shí)間/minC.超聲時(shí)間/minD.超聲功率/W1701201580275150309038018045100

(2)正交實(shí)驗(yàn)安排表及實(shí)驗(yàn)結(jié)果稱(chēng)取9份蓮子心藥材粉末(20目)，每份20.0 g，按L9(34)正交表安排實(shí)驗(yàn)，以蓮心總堿得率為指標(biāo)，并同時(shí)考察各生物堿單體在總堿提取物中的含量隨因素水平的變化情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果及方差分析見(jiàn)表2～6。

由直觀分析中各因素的極差可知，對(duì)總堿得率影響因素的主次順序?yàn)锳>C>D>B，即乙醇體積分?jǐn)?shù)>超聲時(shí)間>超聲功率>回流時(shí)間。

表2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及直觀分析

Tab.2 Orthogonal experimental results and intuitive analysis

實(shí)驗(yàn)號(hào)A.乙醇體積分?jǐn)?shù)/%B.回流時(shí)間/minC.超聲時(shí)間/minD.超聲功率/W蓮心堿含量/%異蓮心堿含量/%甲基蓮心堿含量/%Y.總堿得率/mg·g-1111117.1613.4840.766.62212228.0514.9243.937.33313338.4615.6546.347.95421237.1214.1544.677.96522318.1515.4246.688.57623127.9314.8446.098.02731326.8713.0842.917.34832136.1211.6638.456.22933215.8211.4936.465.97蓮心堿含量K17.8907.0507.0707.043K27.7337.4406.9977.617K36.2707.4037.8277.233R1.6200.3900.8300.574異蓮心堿含量K114.68313.57013.32713.463K214.80314.00013.52014.280K312.07713.99314.71713.820R2.7260.4301.3900.817甲基蓮心堿含量K143.67742.78041.76741.300K245.81343.02041.68744.310K339.27342.96345.31043.153R6.6400.2403.6233.010總堿得率K17.3007.3076.9537.053K28.1837.3737.0877.563K36.5107.3137.9537.377R1.6730.0661.0000.510

表3總堿得率方差分析

Tab.3 Variance analysis of the yield

方差來(lái)源SSMSFPA4.2042.102525.500<0.01B(誤差)0.0080.0041.000C1.7690.885221.125<0.01D0.3990.20049.875<0.05

注：F0.05(2,2)=19.00，F(xiàn)0.01(2,2)=99.00(表4,5,6同)。

表3方差分析結(jié)果表明，A和C因素對(duì)總堿得率具有極顯著影響，D因素有顯著影響，B因素?zé)o顯著影響。進(jìn)一步確定影響蓮子心生物堿得率的最關(guān)鍵因素是A(乙醇體積分?jǐn)?shù))，其次為C(超聲時(shí)間)，再次為D(超聲功率)，B因素(回流時(shí)間)的影響較小，可能是由于實(shí)驗(yàn)誤差所致，故作為誤差項(xiàng)。

分析表2～6中各生物堿單體含量的變化，發(fā)現(xiàn)蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿在總堿提取物中的含量隨各因素水平變化的情況基本一致，影響因素主次順序均為A>C>D>B。對(duì)于蓮心堿來(lái)說(shuō)，最佳因素水平組合為A1B2C3D2；異蓮心堿為A2B2C3D2；甲基蓮心堿為A2B2C3D2；總堿得率為A2B2C3D2。說(shuō)明各生物堿單體純度的變化趨勢(shì)與總堿得率的變化趨勢(shì)基本平行。由于甲基蓮心堿含量最高，對(duì)總堿提取結(jié)果的影響最為顯著、直接。因此，影響總堿得率各因素的顯著性分析情況(表3)與影響甲基蓮心堿含量各因素的顯著性分析情況(表6)最為相似。此結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了以總堿得率為指標(biāo)的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的合理性和正確性。

結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)直觀分析和方差分析結(jié)果得出蓮心總堿的最佳提取工藝為：將藥材粉碎成20目粉末，加入10倍量體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇，浸泡30 min，90 W超聲處理45 min，再于80 ℃條件下加熱回流150 min，重復(fù)提取2次。

表4蓮心堿含量方差分析

Tab.4 Variance analysis of liensinine

方差來(lái)源SSMSFPA4.7902.39517.230>0.05B(誤差)0.2780.1391.000C1.2670.6344.558>0.05D0.5120.2561.842>0.05

表5異蓮心堿含量方差分析

Tab.5 Variance analysis of isoliensinine

方差來(lái)源SSMSFPA14.2447.12239.132<0.05B(誤差)0.3640.1821.000C3.4011.7019.343>0.05D1.0060.5032.764>0.05

表6甲基蓮心堿含量方差分析

Tab.6 Variance analysis of neferine

方差來(lái)源SSMSFPA66.72633.363709.851<0.01B(誤差)0.0940.0471.000C25.69012.845273.298<0.01D13.8336.917147.160<0.01

(3)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)按照上述最佳工藝條件，進(jìn)行5次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表7。

結(jié)果表明,該超聲結(jié)合回流提取工藝穩(wěn)定，結(jié)果可靠。

表7驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.7 The verification of extraction process

批號(hào)藥材量/g總堿提取物/g蓮心堿含量/%異蓮心堿含量/%甲基蓮心堿含量/%總堿含量/%總堿得率/mg·g-1平均得率/mg·g-1RSD/%1411060120.8500.29748.6514.9245.5669.149.8610.062.701411060219.9060.27467.9415.2950.5373.7610.181411060319.6770.26038.8715.7749.0473.689.751411060420.1570.260110.3517.3953.1680.9010.441411060520.7660.253710.3717.6754.5682.6010.09

2.3不同方法提取蓮心總堿結(jié)果比較見(jiàn)表8。

表8不同方法提取蓮心總堿結(jié)果比較

Tab.8 Comparison of the yields of Lianzixin total alkaloids by different extraction methods

(n=3)

結(jié)果表明，超聲結(jié)合回流提取所得總堿得率明顯高于單一回流提取法和超聲提取法(P<0.05)。

3討論

表8顯示，單純使用超聲提取，在得率上不如回流提取法，其原因可能是：首先，由于超聲波在加速總堿擴(kuò)散的同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生很多具有較強(qiáng)活性的自由基，與抗氧化物質(zhì)反應(yīng)，破壞活性成分[11]；其次，超聲提取是在室溫下進(jìn)行，提取溫度低，而適當(dāng)?shù)卦黾犹崛囟扔欣诔煞值臒徇\(yùn)動(dòng)，加速擴(kuò)散。因而，盡管超聲提取本身有許多優(yōu)勢(shì)，但單一使用超聲法提取蓮心總堿的效果并不理想。

從表8可看出，在回流時(shí)間相同(均為150 min)及總提取時(shí)間(均為195 min)相同的情況下，超聲結(jié)合回流工藝提取蓮心總堿得率均高于單一回流工藝且有顯著性差異；而單一回流195 min的總堿得率相較于150 min不增反減，是由于受熱時(shí)間延長(zhǎng)反而加速不穩(wěn)定生物堿的降解所致。這一結(jié)果說(shuō)明，超聲結(jié)合回流提取能有效提高總堿得率。

本實(shí)驗(yàn)中超聲結(jié)合回流提取提高總堿得率的可能機(jī)制是：利用超聲波產(chǎn)生強(qiáng)烈的空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)，增大介質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)速度和介質(zhì)的穿透力，使植物細(xì)胞迅速破壁，加速中藥有效成分進(jìn)入溶劑[11]；同時(shí)，利用總堿溶解度最大的體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇為提取溶劑，加熱回流提取，利用適當(dāng)升溫以加速有效成分的熱運(yùn)動(dòng)，利于其擴(kuò)散溶出。在這一工藝中超聲與回流互相取長(zhǎng)補(bǔ)短，從而提高提取效率，縮短提取時(shí)間，在一定程度上減少受熱時(shí)間，使生物堿減少高溫破壞。此外，超聲對(duì)于回流提取的強(qiáng)化作用還可能與超聲破壞了溶液中的多糖大分子、從而降低了溶液黏度、減小了對(duì)生物堿溶出的傳質(zhì)阻力和吸附作用有關(guān)[12]。這一點(diǎn)可由實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的回流195 min的提取液黏度明顯大于超聲結(jié)合回流法提取液黏度這一現(xiàn)象進(jìn)行證明。

對(duì)總堿提取物中各生物堿的含量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)最佳工藝得到的總堿提取物中蓮心堿平均含量約為9%，異蓮心堿約為16%，甲基蓮心堿約為51%。其中，甲基蓮心堿的含量遠(yuǎn)高于蓮心堿和異蓮心堿，造成這一結(jié)果可能的原因：一方面是不同產(chǎn)地不同批次蓮子心所含各成分的量不同，本實(shí)驗(yàn)所用蓮子心購(gòu)自湖南，有文獻(xiàn)[13-14]報(bào)道,湖南產(chǎn)蓮子心中正是以甲基蓮心堿含量較高；另一方面可能是與各成分的結(jié)構(gòu)有關(guān)，甲基蓮心堿只有一個(gè)酚羥基，而蓮心堿和異蓮心堿有2個(gè)酚羥基，從結(jié)構(gòu)上來(lái)看,甲基蓮心堿的穩(wěn)定性高于蓮心堿和異蓮心堿。因此,提取得到的甲基蓮心堿要偏多。

4總結(jié)與展望

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)確定了超聲結(jié)合回流提取的最佳工藝，并通過(guò)與不同提取方法比較，驗(yàn)證了這一工藝的合理性和優(yōu)越性。實(shí)驗(yàn)表明，與單一回流提取法相比，新技術(shù)超聲結(jié)合回流提取能有效提高總堿得率，減少總生物堿受熱時(shí)間，從而保護(hù)其不受破壞，為蓮心總堿提供了一種高效新穎的提取方法，也為新技術(shù)超聲強(qiáng)化提取含不穩(wěn)定有效成分中藥材進(jìn)行了有益的探索。然而，目前國(guó)內(nèi)對(duì)于超聲結(jié)合回流提取天然產(chǎn)物活性物質(zhì)的報(bào)道并不多，超聲提取設(shè)備也僅限于實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模生產(chǎn)階段，雖然工業(yè)中已有結(jié)合了超聲裝置的多功能提取罐，但是如何使該工藝從單味中藥擴(kuò)大應(yīng)用到中藥復(fù)方、從實(shí)驗(yàn)室規(guī)模放大到工業(yè)化生產(chǎn)，仍是今后超聲提取研究的方向之一。

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Effect of ultrasonic combined with reflux extraction on the yield of Lianzixin total alkaloids

CHEN Xiao, FU Zhijun*(Department of Pharmaceutics of Traditional Chinese Medicine, China PharmaceuticalUniversity, Nanjing 210009, China)

Abstract:ObjectiveTo study the reinforcement effect of ultrasonic on reflux extraction rate of Lianzixin total alkaloids.MethodsOn the basis of single factor experiments, the extraction process was optimized by an orthogonal experimental design with alkaloid yield as an index. And then the extracting effect of the optimal process of ultrasonic combined with reflux extraction was compared with that of single reflux extraction. ResultsVariance analysis results of the orthogonal test showed that ethanol concentration and ultrasonic time were the most significant factors, followed by ultrasonic power. The average rate of ultrasonic combined with reflux extraction was up to 10.06 mg·g-1while that of reflux extraction was only 7.14 mg·g-1. ConclusionNew technology of ultrasonic combined with reflux extraction can actually improve the extration rate of Lianzixin total alkaloids and meanwhile protect the active ingredients from destruction by reducing heating time. This study may provide a novel and efficient explorationfor the extraction of Chinese herbal medicine containing unstable active ingredients.

Key words:Lianzixin total alkaloids; ultrasonic-enhanced; reflux extraction; orthogonal test

收稿日期：(2015-04-01)

通信作者：*富志軍，男，副教授，碩士生導(dǎo)師

作者簡(jiǎn)介：陳笑，女，碩士研究生

中圖分類(lèi)號(hào)：R282

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-2407(2016)01-0024-06

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.01.008