朱曉芳 郭曉鴿 張鼎元 楊佳喆 徐善良 王丹麗

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院 寧波大學(xué)應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 寧波 315211)

胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGFs, insulin-like growth factors)因其結(jié)構(gòu)與胰島素原相類似而得名, 它是一種單鏈多肽, 包括IGF-I、IGF-II (Perks et al, 1995)和IGF-Ⅲ(Wang et al, 2008; Li et al, 2011)。IGF-I由 70個(gè)氨基酸組成, 分子量約為7.5kDa (Vong et al, 2003),能通過(guò)選擇性地促進(jìn)有絲分裂發(fā)生分化以及抑制細(xì)胞凋亡, 在生長(zhǎng)、分化和繁殖調(diào)控中起著相當(dāng)大的作用(Reinecke et al, 2005)。自Rinderknecht & Humber于1978年首次闡述了IGF-I的一級(jí)結(jié)構(gòu), 很多脊椎動(dòng)物的IGF-I基因序列已經(jīng)被克隆得到, 同時(shí)對(duì)它們的表達(dá)模式也進(jìn)行了相應(yīng)的研究(Rinderknecht et al,1978)。在魚類中, Cao等于 1989年首次從鮭(Oncorhynchus tshauytscha)中克隆到魚類 IGF-I cDNA(Cao et al, 1989), 隨后, 鯉形目的鯉(Cyprinus carpio) (華益民等, 2001)、草魚(Ctenapharyngodon idellus) (白俊杰等, 2001)、胭脂魚(Myxocyprirms asiaticus) (鄭凱迪等, 2007), 鱸形目的鯛(Sparus aurata) (Tanaka et al, 1998)、大黃魚(Larimichthys crocea) (?？姑赖? 2012)、花鱸(Lateolabrax japonicus)(焜錢等, 2014)等幾十種魚類的IGF-I基因序列相繼得到研究。

銀鯧(Pampus argenteus)隸屬鱸形目(Perciformes),鯧科(Stromateidae), 鯧屬(Pampus), 分布范圍廣泛。迄今, 對(duì)銀鯧的研究涉及分類、資源評(píng)估、生態(tài)和繁殖特性、人工繁殖、營(yíng)養(yǎng)成分分析、體成分分析等諸多方面(施兆鴻等, 2009, 2011; 彭士明等, 2010, 2013;徐善良等, 2012, 2013; 周健愷等, 2014; 王騰飛等,2015; 閆雪梅等, 2015), 目前對(duì)銀鯧分子生物學(xué)方面的研究較少, 對(duì)銀鯧胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)基因的克隆, 國(guó)內(nèi)外尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。作者在本文中采用同源克隆和RACE-PCR方法, 對(duì)養(yǎng)殖銀鯧IGF-I的cDNA全長(zhǎng)進(jìn)行克隆, 采用實(shí)時(shí)熒光定量(Real-Time PCR)技術(shù)檢測(cè)其 mRNA的組織表達(dá)特性和在肝臟中的表達(dá)特性和定位, 以期為研究IGF-I在銀鯧生長(zhǎng)發(fā)育中的調(diào)控機(jī)理提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用銀鯧取自浙江省寧波市象山魚得水水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司的銀鯧養(yǎng)殖池。選擇攝食正常、無(wú)病無(wú)傷、健康的個(gè)體。在養(yǎng)殖的不同階段, 分別撈取體重為 1—5g、5—15g、15—30g、30—50g、50—100g、100—150g、＞150g的7種規(guī)格魚體各15尾。立即在冰盤上用無(wú)菌解剖工具活體摘取肝臟、肌肉、腎臟、腸、垂體、心、嗅球、胃、鰓、卵巢共10種組織樣品, 置于盛有RNA保護(hù)酶的凍存管中, 置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)驗(yàn)期間養(yǎng)殖池水溫25—27℃, pH值為8.21±0.3,鹽度為 20.3±0.8 。 飼料為日本林 傔 株式會(huì)社產(chǎn)“魚寶”5#飼料和新鮮馬鮫魚肉按 1∶1反復(fù)絞碎制成的濕團(tuán)狀料。

1.2 引物設(shè)計(jì)

從 GenBank中獲得已注冊(cè)的花鱸(Lateolabrax japonicus, JN596878.2)、鱖(Siniperca chuatsi,HM164110.1)、斜帶石斑魚(Epinephelus coioides,AY513719.1)、河鱸(Perca fluviatilis, AJ586907.1)和金頭鯛(Sparus aurata, AY996779.2) IGF-I基因的cDNA全長(zhǎng), 運(yùn)用 ClustalX1.83軟件找到IGF-I基因的保守區(qū), 并用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)兼并引物IGF-I-F和 IGF-I-R, 進(jìn)行 PCR擴(kuò)增, 得到一條長(zhǎng)度約為762bp核心片段, 根據(jù)這部分序列設(shè)計(jì) 5′RACE和3′RACE 特 異 性 引 物 IGF-I-5′R1, IGF-I-5′R2,IGF-I-3′F1, IGF-I-3′F2, 擴(kuò)增出 IGF-I全長(zhǎng) cDNA 序列,進(jìn)一步設(shè)計(jì)出實(shí)時(shí)熒光定量 PCR引物 IGF-I-RT-F,IGF-I-RT-R?；阢y鯧18S(AJ564775.1)的cDNA序列,設(shè)計(jì)內(nèi)參基因序列引物18S F和18S R。檢驗(yàn)后, 用一對(duì)內(nèi)參基因引物 18S-F/R 以及一對(duì)特異性引物qIGF-I-F/R來(lái)檢測(cè)銀鯧不同組織和肝臟不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期IGF-I mRNA的表達(dá)情況, 測(cè)序引物用菌體自帶引物M13-R、M13-47-F (表1)。

1.3 總RNA提取以及cDNA第一鏈的合成

采用 RNA提取試劑盒(Axygen, RNA extraction kit)對(duì)同一時(shí)期不同組織和不同生長(zhǎng)階段肝臟總RNA分別進(jìn)行提取。采用 TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)上述RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄, 獲得cDNA。經(jīng)37℃反轉(zhuǎn)錄15min,于85℃滅活反轉(zhuǎn)錄酶5s。將合成得到的cDNA產(chǎn)物保存于-20℃或直接用于PCR。

1.4 對(duì)IGF-I基因cDNA核心片段進(jìn)行克隆

以銀鯧的肝臟 cDNA作為模板, 采用 IGF-I-F/R簡(jiǎn)并引物, 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50μL, 優(yōu)化后的擴(kuò)增條件如下: 94℃預(yù)變性 5min, 94℃變性30s; 55℃退火30s, 于72℃延伸1min, 30個(gè)循環(huán); 再于72℃延伸10min; 在4℃保存。

將PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 并切膠回收目的片段。進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化培養(yǎng), 再根據(jù)電泳檢測(cè)菌液PCR結(jié)果, 取陽(yáng)性克隆菌液, 送上海Sunny生物科技有限公司測(cè)序。

1.5 銀鯧IGF-IcDNA全長(zhǎng)獲取

將測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中, 進(jìn)行 BlastX 對(duì)比分析, 如果測(cè)序所得的IGF-I部分序列與其它物種的 IGF-I同源, 即根據(jù)測(cè)得序列再設(shè)計(jì) 5′RACE 和 3′RACE 的特異性引物IGF-I-5′R1, IGF-I-5′R2, IGF-I-3′F1 和 IGF-I-3′F2, 用于RACE擴(kuò)增。采用SMARTTMRACE cDNA試劑盒(Clontech)進(jìn)行 5′RACE 和 3′RACE, 以獲得全長(zhǎng)cDNA。

1.6 對(duì)IGF-I基因的信息學(xué)分析

采用 Protparam 軟件(http://web.expasy.org/protparam/)對(duì)蛋白的理化特性進(jìn)行預(yù)測(cè); 并利用http://www.ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)站上的 BlastX工具核酸和蛋白序列相似性進(jìn)行比較分析; 采用 NCBI的ORF Finder分析開放閱讀框, 預(yù)測(cè)氨基酸的序列; 用ExPASy-PROSITE網(wǎng)站(http://prosite.expasy.org/)預(yù)測(cè)氨基酸功能域; 采用Signal P4.1 Server對(duì)信號(hào)肽進(jìn)行分析; 功能域的預(yù)測(cè)則采用Smart軟件; 多序列比對(duì)分析則采用 ClustalW 軟件。構(gòu)建進(jìn)化樹采用MEGA5.05軟件中的 M-L(Maximum-Likelihood)法。并采用自展法(Bootstrap)進(jìn)行1000 次重復(fù)檢驗(yàn)。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物及序列Tab.1 Oligonucleotide primers used in the experiments

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

對(duì)體重大于100g的成魚肝臟、肌肉、腎臟、小腸、垂體、嗅球、胃、心臟、鰓、卵巢10種組織以及體重為 1—5g、5—15g、15—30g、30—50g、50—100g、100—150g六個(gè)階段的肝臟組織進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析, 每個(gè)分析樣3個(gè)重復(fù)。熒光定量PCR時(shí), 先優(yōu)化模板濃度, 將各類模板按10倍稀釋5個(gè)濃度梯度, 并用引物分別擴(kuò)增以確定最佳的模板濃度。并優(yōu)化引物退火溫度, 優(yōu)化后反應(yīng)條件為: 95℃預(yù)變性30s; 95℃變性5s, 59℃退火30s, 40個(gè)循環(huán);95℃15s, 60℃ 1min, 95℃ 15s。待反應(yīng)結(jié)束, 確定Real-time PCR 擴(kuò)增曲線及溶解曲線, 在 ABI StepOnePlusTMInstrument上進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和處理。所得數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(M±SD)表示, 采用SPSS17.0軟件對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 用One-Way ANOVA法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn), 多重比較采用Duncan檢驗(yàn)法。本文根據(jù)Livak等(2001)方法進(jìn)行引物效率的檢測(cè), 結(jié)果發(fā)現(xiàn) PCR產(chǎn)物溶解曲線未出現(xiàn)雜峰, 表明產(chǎn)物的特異性較好。采用 2-ΔΔCt法對(duì)qRT-PCR結(jié)果加以分析處理, 將ΔCt定義為: 內(nèi)標(biāo)目的基因IGF-I Ct值與18S Ct值之間的差值。

1.8 原位雜交

根據(jù)已克隆的IGF-I cDNA序列設(shè)計(jì)探針模板引物IGF-I-S和IGF-I-A, PCR擴(kuò)增得到248bp目的序列,經(jīng)電泳驗(yàn)證后連接至pGEM-T載體, 轉(zhuǎn)化后取陽(yáng)性克隆測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果比對(duì)正確后, 擴(kuò)培菌液用Omega質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒。對(duì)重組 pGEM-T質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶NcoI和SpeI分別進(jìn)行單酶切,使得質(zhì)粒線性化。用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物正確后, 用 PCR 純化試劑盒(AxyGen, 美國(guó))回收線性化的模板質(zhì)粒, 采用0.1%的DEPC處理水溶解。將純化質(zhì)粒作為體外轉(zhuǎn)錄的 DNA模板, 以 DIG RNA Labeling Mix為底物, 參照 Riboprobe?System(Promega)的實(shí)驗(yàn)程序, 用 T7聚合酶和 SP6聚合酶(Promega)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄合成DIG標(biāo)記的正反義RNA探針。采用沒(méi)有RNA酶活性DNA酶處理去除DNA模板, 再加入 2.5μL預(yù)冷的 5mol/L氯化鋰(經(jīng) DEPC處理)及75μL冰預(yù)冷的無(wú)水乙醇, -20℃下放置過(guò)夜。用 DEPC水配制的 70%酒精洗沉淀, 吹干后向 RNA沉淀中加入 30μL的 DEPC水, 待其自然溶解后, 取5μL進(jìn)行電泳檢測(cè), 置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

原位雜交步驟主要參照謝碧文(2008)和陳麗麗(2012)。具體調(diào)整方法如下: 為保證細(xì)胞的完整性采用組織切片技術(shù), 為增加細(xì)胞膜通透性采用蛋白酶K于37℃消化30min, 為探針與模板最佳結(jié)合且降低非特異性染色采用 60℃預(yù)雜交 2h, 洗掉預(yù)雜交液無(wú)酶條件干燥后滴加雜交液60℃過(guò)夜孵育(探針∶預(yù)雜交液=1∶100)。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀鯧IGF-I基因cDAN全長(zhǎng)的克隆

以銀鯧cDNA全長(zhǎng)為模板, 用兼并引物IGF-I-F、IGF-I-R擴(kuò)增, 獲得一條762bp的單一條帶, 經(jīng)BlastX分析, 顯示與已登錄的大黃魚(Larimichthys crocea,KKF31429.1)、石斑魚(Epinephelus lanceolatus,ABZ10841.1)、鱖(Siniperca chuatsi, ADO14142.1)、花鱸(Dicentrarchus labrax, AAV67967.1)、軍曹魚(Rachycentron canadum, ABG57072.1)IGF-I氨基酸同源性都達(dá)到了98%以上, 表明該片段是IGF-I基因的一部分。再用特異性引物IGF-I-3'F2擴(kuò)增出190bp的cDNA片段, 測(cè)序后所得序列通過(guò)比對(duì)拼接得到了一條836bp的銀鯧IGF-I cDNA序列(GenBank登錄號(hào):KT210886), 見(jiàn)圖 1。再重新設(shè)計(jì) IGF-I_CDS-F和IGF-I_CDS-R克隆IGF-I全長(zhǎng)序列, 以驗(yàn)證序列的可靠性, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)與拼接結(jié)果一致, 證明了cDNA克隆是成功的。將銀鯧IGF-I基因的cDNA命名為Pampus argenteus insulin-like growth factor-I。

2.2 銀鯧胰島素樣生長(zhǎng)因子IGF-I序列特征分析

銀鯧IGF-I基因cDNA序列以及推導(dǎo)的氨基酸序列見(jiàn)圖 1。該 cDNA全長(zhǎng) 836bp, 含有 128bp的 5'非編碼區(qū)(UTR)、605bp的開放閱讀框(ORF)和92bp的3'-非編碼區(qū)(UTR), 編碼了201個(gè)氨基酸。IGF-I前體肽預(yù)測(cè)的理論等電點(diǎn)(pI)為 9.72, 分子質(zhì)量經(jīng)計(jì)算約為22.00kDa。據(jù)SignalP 4.1Server分析, 該多肽含有一段59個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽序列, 成熟肽B區(qū)31個(gè)氨基酸, A區(qū)19個(gè), C區(qū)10個(gè), D區(qū)7個(gè), E區(qū)75個(gè)。成熟肽存在 CysB6, CysB18, CysA6, CysA7,CysA11及CysA20等6個(gè)半胱氨酸殘基。

銀鯧IGF-I基因ORF中功能位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn), 含有6個(gè)蛋白激酶 C 磷酸化位點(diǎn)(protein kinase C phosphorylation site); 1個(gè) N-糖基化位點(diǎn)(N-glycosylation site); 1個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)(casein kinase Ⅱ phosphorylation site); 以及1個(gè)豆蔻酰化位點(diǎn)(N-myristoylation site) (圖2)。

2.3 不同物種IGF-I氨基酸序列同源性分析

利用ClustalW對(duì)銀鯧IGF-I和其它20種脊椎動(dòng)物 IGF-I的編碼氨基酸序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)(圖 3)。在不同物種中均存在 6個(gè)保守的半胱氨酸(Cys)殘基。由氨基酸序列同源性分析可見(jiàn), 與11種魚類IGF-I氨基酸同源性均在 70.19%以上, 其中銀鯧與河鱸(P.fluviatilis)的同源最高為 91.40%; 與鱸形目魚類的同源性為83.52%—91.40%; 與鰈形目牙鲆(Paralichthys lethostigma)、半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)的同源性分別為 90.86%、83.96%; 與鯔形目鯔魚(Mugil cephalus)的同源性為 86.02%; 鮭形目大西洋鮭魚(Salmo salar)的同源性為81.82%; 與鰻鱺目日本鰻鱺(Anguilla japonica)的同源性為 73.75%; 與鯉形目的同源性為 70.19%—71.43%; 各個(gè)功能區(qū)域間對(duì)比發(fā)現(xiàn), B區(qū)和A區(qū)保守性較高, C區(qū)次之, 而D區(qū)和E區(qū)保守性較差(圖3)。

通過(guò) MEGA5.05軟件, 對(duì) 21個(gè)物種的IGF-I氨基酸進(jìn)行了分子系統(tǒng)進(jìn)化分析, 并在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹基礎(chǔ)上, 研究銀鯧 IGF-I和其它物種的進(jìn)化關(guān)系,見(jiàn)圖 4。由圖 4可知, 所有物種聚為兩大亞群, 銀鯧與硬骨魚類聚為一大亞群, 即銀鯧先與河鱸(P.fluviatilis)、牙鲆(P. lethostigma)、金頭鯛(S. aurata)、點(diǎn)帶石斑魚(E. coioides)、鱖(S. chuatsi)、加州鱸(M.salmoides)、花鱸(L. japonicus)、鯔魚(M. cephalus)聚為一支, 然后與紅鰭笛鯛(L. erythropterus)、半滑舌鰨(C. semilaevis)、尼羅羅非魚(O. niloticus)、大西洋鮭(S. salar)聚類, 最后與鯉魚(C. carpio)、鯽魚(Carassius auratus)和日本鰻鱺(A. japonica)聚為一個(gè)大的亞群; 另一個(gè)亞群中, 人(Homo sapiens)、野豬(Sus scrofa)、金倉(cāng)鼠(Mesocricetus auratus)三種哺乳類先聚為一支, 再與鳥類原雞(Gallus gallus)和爬行類中華鱉(Pelodiscus sinensis)聚為一大亞群。

圖1 銀鯧IGF-I基因cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 The cDNA sequence of P. argenteus IGF-I and deduced amino acids sequence

圖2 銀鯧IGF-I基因ORF中功能位點(diǎn)示意圖Fig.2 The functional sites in ORF of IGF-I from P. argenteu

通過(guò)進(jìn)化關(guān)系圖可見(jiàn), 銀鯧與同一鱸形目的河鱸(P. fluviatilis)、金頭鯛(S. aurata)、點(diǎn)帶石斑魚(E.coioides)等親緣關(guān)系最近; 與鰈形目和鯔形目親緣關(guān)系較近; 與鯉形目和鰻鱺目等淡水魚類較遠(yuǎn), 與哺乳類、鳥類和爬行類的進(jìn)化距離最遠(yuǎn)。

2.4 銀鯧不同組織的IGF-I mRNA的表達(dá)

采用半定量 RT-PCR和 Quantitative Real-time PCR方法檢測(cè)了IGF-I基因在銀鯧肝臟、肌肉、腎臟等10個(gè)不同組織中的表達(dá)情況(圖5)。IGF-I基因在銀鯧 10個(gè)不同組織中均有表達(dá), 尤其是在肝臟中表達(dá)量最高, 顯著高于其它組織(P＜0.05, n=3), 其次為腎臟、心臟、肌肉、腦等, 在嗅球和胃中表達(dá)較低。

2.5 銀鯧不同生長(zhǎng)階段肝臟IGF-I mRNA的表達(dá)

通過(guò)半定量 RT-PCR和 Quantitative Real-time PCR方法檢測(cè)銀鯧IGF-I基因在不同生長(zhǎng)階段的表達(dá)情況(圖6)。銀鯧幼魚在體重小于30g時(shí), IGF-I表達(dá)略有下降, 在體重 30—50g時(shí)顯著性增高(P＜0.05),且達(dá)最高峰值, 約為體重 1—30g階段表達(dá)量的2.5—5倍; 到體重 50—100g時(shí)表達(dá)量顯著下降(P＜0.05), 僅為體重30—50g時(shí)表達(dá)量的1/2; 此后表達(dá)量趨于平穩(wěn), 維持在中等水平。

圖3 脊椎動(dòng)物IGF-I的氨基酸序列比對(duì)Fig.3 Multiple-sequence alignment of vertebrate IGF-I amino acids sequence

圖4 利用不同物種推導(dǎo)的IGF-I氨基酸序列構(gòu)建的M-L進(jìn)化樹Fig.4 The maximum-likelihood tree reconstructed based on putative IGF-I amino acids residues

圖5 銀鯧IGF-I mRNA在不同組織中的表達(dá)水平Fig.5 Levels of IGF-I mRNA transcription of different tissues with 18S acted housekeeping gene

2.6 銀鯧IGF-I原位雜交結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組為DIG標(biāo)記的反義RNA探針, 對(duì)照組為DIG標(biāo)記的正義RNA探針, 同時(shí)用H.E染色作為對(duì)照組。從圖7可見(jiàn), 肝細(xì)胞呈板狀排列, 血竇在肝細(xì)胞索(肝板)之間, 肝細(xì)胞索的形狀呈現(xiàn)彎曲、分支及吻合(圖7, A1, A2, C1, C2)。肝臟原位雜交結(jié)果顯示,地高辛標(biāo)記的IGF-I反義RNA陽(yáng)性雜交反應(yīng)信號(hào)遍布于肝細(xì)胞中, 且雜交信號(hào)主要存在于細(xì)胞質(zhì)中, 靠近細(xì)胞邊緣處信號(hào)較強(qiáng)(圖7, A3, A4); 正義探針對(duì)照組(圖7, B1, B2)沒(méi)有檢測(cè)到IGF-I mRNA的雜交陽(yáng)性信號(hào)。

圖6 銀鯧IGF-I mRNA在不同生長(zhǎng)階段表達(dá)水平Fig.6 Levels of IGF-I mRNA transcription in different growth stages with 18S acted housekeeping gene

圖7 胰島素樣生長(zhǎng)因子-I原位雜交及H.E染色結(jié)果Fig.7 In situ hybridization of P. argenteus, showing the location of insulin-like growth factor-I mRNA in liver

3 討論

3.1 IGF-I mRNA序列分析

本文首次克隆得到了銀鯧IGF-I cDNA全長(zhǎng)序列,與斜帶石斑魚(Pedroso et al, 2006)、鱖(劉俊等, 2011)、花鱸(焜錢等, 2014)的IGF-I前體蛋白結(jié)構(gòu)相同, 銀鯧的IGF-I前體蛋白也由信號(hào)肽、成熟肽和E肽三部分組成, 而成熟肽則由B, C, A, D四個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。與人和其它脊椎動(dòng)物的IGF-I一樣, 銀鯧IGF-I的成熟肽含6個(gè)極端保守的半胱氨酸(Cys)殘基, 其中2個(gè)位于B結(jié)構(gòu)域, 另外4個(gè)位于A結(jié)構(gòu)域, 其參與形成的二硫鍵對(duì)蛋白質(zhì)的正常折疊、空間結(jié)構(gòu)的維持及生理作用的發(fā)揮具有重要意義(Hober et al, 1992; Magee et al, 1999)。

由氨基酸序列同源性分析可見(jiàn), 銀鯧IGF-I與其它魚類氨基酸同源性在 70.19%以上, 與哺乳動(dòng)物的同源性在44.62%以上, 可見(jiàn)IGF-I在進(jìn)化過(guò)程中是一個(gè)演變過(guò)程較慢的蛋白分子, 可以成為魚類分類中的一個(gè)重要參考標(biāo)記; B區(qū)和 A區(qū)同源性分別為89.66%—100%和90.48%—100%, 結(jié)構(gòu)域保守性很高,它們包含與IGF-IR和IGFBPs結(jié)合的序列(Zhang et al,1994; Magee et al, 1999), 可能與IGF-I的功能維持相關(guān); 而 C 區(qū)(50.00%—100%)、D 區(qū)(37.50%—100%)和E區(qū)(25.68%—97.3%)在不同物種中存在一定差異。目前已發(fā)現(xiàn)的IGF-I存在著4種不同的剪接體(Cao et al, 1989; Shamblott et al, 1993; Hashimoto et al, 1997),根據(jù)E肽氨基酸大概長(zhǎng)度分別命名為含35個(gè)氨基酸的Ea-1型, 含47個(gè)氨基酸的Ea-2型, 含62個(gè)氨基酸的 Ea-3型, 以及含 74個(gè)氨基酸的 Ea-4型。銀鯧IGF-I E肽序列長(zhǎng)為 75個(gè)氨基酸, 屬于 Ea-4型。Duguay等(1992)報(bào)道大麻哈魚(Oncorhynchus keta)的心、腦、腎、脾及卵巢等組織中主要表達(dá) Ea-4型的IGF-I。同樣, Chen等(1998)報(bào)道黑鯛(Acathopagrus schlegeli)的肝等組織也主要表達(dá)Ea-4型的IGF-I, 而Hashimoto等(1997)的研究表明鯉魚(C. carpio)各組織主要表達(dá)Ea-2型的IGF-I。本研究得出的系統(tǒng)進(jìn)化樹基本反映了脊椎動(dòng)物的系統(tǒng)分類關(guān)系, 與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和生化特征分類基本一致。

3.2 IGF-I mRNA在不同組織中的表達(dá)分析

本章采用半定量RT-PCR和quantitative real-time PCR方法檢測(cè)了IGF-I基因在銀鯧肝臟、肌肉、腎臟等 10種組織中的表達(dá)情況, 結(jié)果與日本白鯽(Carassius cuvieri)(陶敏等, 2012)完全相同, 均在肝臟組織中的表達(dá)量最高, 這是因?yàn)镮GF-I絕大部分由肝合成(Sj?gren et al, 1999)。大量研究表明, IGF-I在魚體各組織的表達(dá)呈多樣性。郁建鋒等(2012)采用半定量 RT-PCR 方法以鳡(Elopichthys bambusa)β-actin基因?yàn)閮?nèi)參照, 檢測(cè)了IGF-I基因mRNA鳡在的6個(gè)不同組織的表達(dá)情況, 發(fā)現(xiàn)IGF-I基因mRNA在肝臟中表達(dá)量最高, 心臟中未見(jiàn)其明顯表達(dá), 腎臟、腸、心臟和肌肉中的表達(dá)量較肝臟明顯偏低; 焜錢等(2014)和胡健(2012)分別檢測(cè)花鱸(L. japonicus)和大菱鲆(Scophthalmus maximus)IGF-I mRNA在不同組織的表達(dá)水平, 發(fā)現(xiàn)肝臟 IGF-I的表達(dá)水平最高, 肌肉中表達(dá)量相對(duì)較高, 在腎臟中表達(dá)量偏低; Otteson等則報(bào)道了在金魚(Carassius auratus)視網(wǎng)膜中發(fā)現(xiàn)了IGF-I的表達(dá)(Hitchcock et al, 2001)。大量研究表明,肝臟IGF-I mRNA表達(dá)水平不但與物種、體重、年齡、營(yíng)養(yǎng)條件, 環(huán)境溫度還有鹽度有關(guān), 也與個(gè)體所處的生長(zhǎng)階段有關(guān)(Duan et al, 1998; Metón et al, 2000;Larsen et al, 2001; Gabillard et al, 2003)。研究表明IGF-I在肝外組織可以分別以自分泌和旁分泌方式作用于相應(yīng)器官, 發(fā)揮特定的生理功能(Reinecke et al,1998; Roith et al, 2001)。

3.3 IGF-I mRNA在不同生長(zhǎng)階段的表達(dá)分析

通過(guò)半定量RT-PCR和quantitative real-time PCR檢測(cè)銀鯧IGF-I基因在不同生長(zhǎng)階段的表達(dá)情況, 銀鯧幼魚在體重小于30g前, IGF-I表達(dá)雖稍有降低, 但變化幅度不大。至體重30—50g時(shí)表達(dá)量顯著性增高(P＜0.05), 這與此時(shí)銀鯧進(jìn)入快速生長(zhǎng)階段完全相吻合, 夏末初秋水溫在23—28℃范圍, 正是銀鯧最佳的生長(zhǎng)期。隨后因銀鯧進(jìn)入越冬期(體重50—100g)生長(zhǎng)減緩, IGF-I基因表達(dá)隨之下跌過(guò)半, 翌年春天銀鯧體重達(dá)到 100—150g, 由于性腺發(fā)育迅速, 生長(zhǎng)反而受到影響, 故此時(shí)呈現(xiàn)IGF-I基因的表達(dá)量增幅不大的現(xiàn)象(Wen et al, 2002)。有關(guān)IGF-I調(diào)節(jié)魚類生長(zhǎng)發(fā)育的研究不多, Shamblott等(1993)檢測(cè)虹鱒(Oncorhynchus mykiss)成魚和幼魚組織IGF-I mRNA的表達(dá)水平, 發(fā)現(xiàn)成魚肝組織IGF-I mRNA水平約為幼魚表達(dá)量的兩倍; 而Duan等(1998)發(fā)現(xiàn)銀大馬哈魚肝組織IGF-I mRNA水平隨著年齡的增長(zhǎng)而顯著下降。

3.4 IGF-I基因在肝臟中的定位分析

IGF-I介導(dǎo)生長(zhǎng)激素(GH)的功能, 對(duì)機(jī)體組織和個(gè)體發(fā)育有非常重要的作用, 關(guān)于IGF-I的原位雜交研究主要集中在脊椎動(dòng)物的整體原位雜交和組織原位雜交(李艷梅, 2008; 郭斌, 2008; Patruno et al,2008)。本研究用DIG標(biāo)記的RNA探針檢測(cè)到IGF-I mRNA在肝臟細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中有大量表達(dá), 與Patruno等(2008)在肝臟中的表達(dá)結(jié)果相似。Patruno等(2008)采用經(jīng)DIG標(biāo)記的RNA探針和熒光原位雜交技術(shù), 檢測(cè)到花鱸孵化后第一周有較強(qiáng)的 IGF-I mRNA表達(dá), 在幼魚和成魚的肝臟中也有 IGF-I mRNA大量表達(dá); 但也有學(xué)者在肝臟中并未發(fā)現(xiàn)IGF-I基因的表達(dá), 如郭斌(2008)運(yùn)用 DIG 標(biāo)記的RNA探針檢測(cè)IGF-I mRNA在成體文昌魚不同組織中的表達(dá), 發(fā)現(xiàn)IGF-I mRNA只在肝盲囊和后腸中表達(dá)。

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