司開學 夏長革 王朝陽 張迪駿 何 珊 周 君 張紅燕韓姣姣 崔晨茜 董麗莎 蘇秀榕①

(1. 寧波大學海洋學院 寧波 315211; 2. 吉林省長春市新立城水庫管理局 長春 130119)

放線菌是一類具有分枝狀菌絲體的革蘭陽性菌,是生理活性物質尤其是天然藥物的重要來源(劉睿等, 2006; 林親雄等, 2006; 王海雁等, 2010)。過去的幾十年里抗生素及藥物篩選一直來源于土壤微生物,其數量及抑菌活性已達到瓶頸。而海洋微生物在極端環(huán)境下, 可能會通過調整其次生代謝途徑產生具有抑菌作用的生物活性物質。如放線菌產生鹵化酶催化的生物活性物質能顯著提高其抑菌活性。當今臨床和農業(yè)上使用的抗生素 75%由放線菌產生(Bérdy, 2005)。由于陸地放線菌已經被長期研究和篩選, 近十多年來, 日本、美國、德國、英國等一些國家和國內的研究機構及制藥廠逐步把研究方向轉向海洋放線菌。它廣泛分布于淺灘、近岸、海洋動植物體內、深海沉積物、海水以及結核礦區(qū)、海底冷泉區(qū)等。隨著海洋經濟的推進, 陸源污染物包括工業(yè)廢水、城鎮(zhèn)生活污水、農藥和化肥等, 主要通過河川徑流入海和沿岸的排污口直排入海, 大氣污染還可以通過氣體干濕沉降進入海洋。85%以上的海洋污染物都來自于陸源污染, 其成分很復雜, 主要為重金屬、難降解有機物和微生物代謝物等, 這也使陸源排污口變成了一個獨特的生態(tài)圈, 這里生存的大量微生物也就非常具有研究價值。因此, 研究陸源排污口的放線菌多樣性意義重大。本文利用454測序技術研究陸源排污口的放線菌的時空分布, 以期為進一步開發(fā)利用放線菌、預防和治療放線菌引起的病害奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

選取寧波沿海2個重點陸源排污口和8個一般排污口作為采樣點(表1)。其中S4、S6、S8和S9為綜合排污口, S1、S3、S5、S7和S10為工業(yè)排污口, S2為市政排污口(陳麗萍等, 2013)。

分別于2011年3月、5月、8月、10月在排污口處與排污口50m處采集水樣5L, 用0.2μm微濾膜過濾后提取DNA(王中華等, 2014)。

表1 寧波沿海10個陸源排污口相關信息Tab.1 Information of ten land-based sewage outlets in Ningbo

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 取約2 L的海水, 以0.22μm的微孔濾膜富集微生物, 利用試劑盒提取基因組DNA(美國Omega生物技術公司)(Wanget al, 2014a, b)。

1.2.2 PCR擴增 根據細菌16S rRNA的保守序列,利用Primer Premier 5.0設計擴增引物: 16S F (5′-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-3′)和16S R (5′-CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG-3′)。

20μL 擴增反應體系: 10×buffer 2μL, 2 μL MgCl2,2 μL dNTP, 上游引物和下游引物各 25μL, 0.2 μL Taq DNA聚合酶和1 μL DNA模版。PCR擴增產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

PCR擴增條件: 94°C預變性4 min, 94°C變性30 s,退火溫度從65°C到55°C, 退火30s, 20個循環(huán); 72°C延伸30 s, 94°C變性30 s, 55°C退火30 s, 72°C延伸30 s,35個循環(huán); 最終72°C延伸10 min(劉兵等, 2009)。

1.2.3 測序與分析 將純化后的 PCR產物進行454焦磷酸測序(Margulieset al, 2005), 結果用羅氏軟件2.5.3進行信號處理分析。根據放線菌在文庫中出現的頻次數量, 進一步用R For Window 2.15.2、SPSS等進行統(tǒng)計分析。

2 結果與討論

2.1 排污口放線菌種類

利用 454高通量測序技術, 從寧波沿海10個陸源排污口20個站點4個檢測月份80個海水樣品, 共成功鑒定出了放線菌目5158個, 酸微菌目481個, 紅蝽桿菌目232個, 雙棲桿菌目62個, Euzebiales 9個,紅色桿菌目 9個, 土壤紅桿菌目 8個。也鑒定出 39個科, 83個屬和84個種, 有些種是首次發(fā)現。

2.2 排污口放線菌的整體分布

由圖 1可知, 象山石浦水產加工園區(qū)排污口(S4)、北侖三山排污口(S6)和寧海顏公河入海排污口(S9)排污口放線菌門檢測頻次較高, 分別為 1480、1243和1275次, S9站點50m處檢測到放線菌門頻次高達831次; 象山石浦水產加工園區(qū)排污口(S3)、象山墻頭綜合排污口(S5)、寧海西店崔家綜合排污口(S7)、奉化市下陳排污口(S8)和余姚黃家埠排污口(S10)放線菌門被檢頻次分別為 522、846、601、536和404次; 象山爵溪西塘排污口(S1)和象山水桶岙垃圾場滲透液排污口(S2站)點檢測頻次較低, 分別為326次和137次, 其中S2站點排污口處取樣檢測結果顯示被測頻次僅為3次, 說明放線菌在該條件下生長受到了一定的抑制作用, 不適合其繁殖生長?？傮w上看, 距排污口50m以外處檢出頻次要高于排污口處。

2.3 不同季節(jié)放線菌的分布特點

圖1 不同月份不同站點放線菌總體分布Fig.1 The distribution of Actinomycetales in different sewage outlets and months

從圖2可知, 3月份檢出頻次為1212/ 16.44%, 5月份檢出頻次為 3197/ 43.37%, 8月份檢出頻次為1631/ 22.13%, 10月份檢出頻次為1330/ 18.04%。從各月份排污口放線菌門頻次變化情況來看, 5月份放線菌被檢頻次最高, 8月份次之, 是放線菌門繁殖最佳的季節(jié); 而3月份和10月份檢出頻次最低, 故推測放線菌的繁殖數量與季節(jié)的變化存在一定的相關性。Allgaier等(2006)在調查德國東北部四大湖泊中放線菌多樣性和數量的動態(tài)變化時, 發(fā)現放線菌數量呈現出有規(guī)律的季節(jié)性變化, 春季和秋季兩個季節(jié)達到最大值; Gl?ckner等(2000)在研究 Gossenkollesee湖泊的放線菌分布時也得出相近的結論:Gossenkollesee湖泊中放線菌數量在4月份和8月份達到頂峰, 這與本研究得出的推論極為相近。然而,也有研究認為冬季是放線菌數量達到最大值的季節(jié)(Burkert et al, 2003), 這是由于地理位置的差異和氣候的不同造成的。寧波2011年3月份平均氣溫為15°C,5月份、8月份和10月份平均氣溫分別為26°C、34°C和23°C。5月份和8月份放線菌較多, 該氣溫是大多數放線菌生長的最佳氣溫。尹洪祥(1981)在研究培養(yǎng)溫度對某些微生物的生長與培養(yǎng)特性的影響時發(fā)現,大多數放線菌, 原放線菌, 分支桿菌等非嗜熱性菌株的最適生長溫度為 24—37°C(占 98%—100%), 溫度升高, 菌株的存活率將逐漸降低。這是由于溫度升高會引起微生物呼吸指數的上升, 加速有機碳的礦化,增加了它的有效性, 使微生物活性增強, 生長加快(Hu et al, 1999)。5月份S4和S9放線菌數量較多, 而其它8個站點放線菌數量較少; 8月份S4、S5、S6和S8放線菌數量較多, 而S1、S2、S3等6個站點菌數量較少, 表明影響放線菌生長的因素除了溫度以外還有其它因素(Zhang et al, 2004)。

圖2 10個排污口處與距排污口50m處四個月份檢出放線菌頻次情況Fig.2 The distribution of Actinomycetales at 0 and 50 m away from sewage outlets in the four sampling months

2.4 放線菌不同站點的分布特點

從圖3可知, 綜合排污口(S4, S6, S8和S9)放線菌被檢測頻次最高, 為4534次, 工業(yè)排污口(S1, S3,S5, S7和S10)檢測到放線菌的頻次次之, 為2699次;S2為市政排污口, 放線菌被檢測頻次最低, 僅為137次。排污口類型的不同, 放線菌數量呈現出較為顯著的差異。綜合排污口與市政排污口的放線菌數量差異最為顯著, 故推測放線菌被檢頻次與排污口類型有關。

放線菌大部分屬于異養(yǎng)型細菌(Methé et al,1998)。從變化趨勢來看, 3月份到10月份大部分排污口放線菌數量呈現出先增長后下降的變化, 尤其是綜合排污口表現的更為明顯。這表明放線菌的生長環(huán)境由適中逐漸轉向惡劣, 分析其原因很可能由于3月份工廠大量開工, 排放出大量無機氮, 活性磷酸鹽等污染物, 加之氣溫回升, 為放線菌的生長提供了良好條件。5月份到8月份氣溫大幅升高, 工廠運行較少,排放廢棄物較少, 放線菌營養(yǎng)物質來源受限制, 生長受到抑制。S8、S9屬于水產品養(yǎng)殖區(qū), 5月份是這兩個站點放線菌暴發(fā)期, 而 4月份到6月份屬于魚類疾病高發(fā)期, 需注意由放線菌所引起的疾病(Gauthier et al, 2009), 建議相關企業(yè)做好疾病防范措施。S7與S10的放線菌數量呈現出的變化與其它站點相反, 主要是由于水體磷和氨氮的含量超標, 導致水體富營養(yǎng)化, 藻類瘋狂生長, 水中溶氧量下降, 加之高濃度的氨氮對微生物的生長有一定的抑制作用(趙慶良等,1998), 從而導致放線菌的數量呈現先下降后增長的變化。S2是市政排污口, 排出的主要是象山垃圾場滲透液。這些排污口含有較多的有機物, 氨氮及鉻、鎳、鋁和錳等含量較高(魏云梅等, 2007)。從3月份到10月份, 放線菌數量呈現先下降后升高的變化。這主要是由于隨著溫度的升高, 氨氮化合物氧化分解加快、耗氧量增加(胡蝶等, 2011), 這使得放線菌的數量大量下降。8月份后, 隨著溫度的下降, 氨氮物質氧化分解速率降低, 耗氧量減少, 放線菌的繁殖量增加。

圖3 不同類型排污口放線菌的分布情況Fig.3 The distribution of Actinomycetales in different types of sewage outlets

2.5 5個工業(yè)排污口放線菌的分布特點

陸源排污口污染物入海是造成我國近岸海域環(huán)境污染和生態(tài)損害的主要原因(Swartz et al, 1985)。S1、S3、S5、S7、S10是寧波市5個工業(yè)排污口。工業(yè)廢棄物(主要含有無機氮, 有機磷, 甚至重金屬等污染物)通過陸源排污口排入大海, 對近岸海域生態(tài)環(huán)境造成嚴重影響。3月、5月、8月和10月四個月份, 對S1、S3、S5、S7和S10工業(yè)排污口放線菌種類檢測出16種、17種、21種、38種和24種放線菌。

圖4 工業(yè)排污口放線菌分布情況的文氏圖Fig.4 The Venn diagram of distribution of Actinomycetales in the industrial sewage outlets

表2 5個工業(yè)排污口檢測出的共同放線菌種類Tab.2 The common Actinomycetales species in five industrial sewage outlets

圖4顯示, S1與S3、S5、S7、S10有6、9、8和9種共同菌; S3與S5、S7和S10分別檢測出共同菌為5、10、8種; S5與 S7和S10檢出共同菌分別為13和12種; S7和S10的共同菌為15種。S7與S10檢出共同菌種類最多, 推測其適合放線菌生長的營養(yǎng)成分最為接近; 相對于S3和S7站點, S1與S5和S10測出共同菌較多, 推測成分更為接近; 同樣可以分析出S3與S7污水成分相近, S5與S7污水的成分相近。結合表2可知, 5個工業(yè)排污口的共同菌為: 藤黃微球菌(Micrococcus luteus), 厭鹽假諾卡氏菌(Pseudonocardia halophobica), Microbacterium aurum,Candidatus Aquiluna rubra。C. Aquiluna rubra廣泛分布于淡水, 部分能在海水中檢測到, 屬于異養(yǎng)需氧型細菌, 分布于營養(yǎng)豐富的水域(Hahn, 2009; Jung et al,2010), 是寧波陸源排污口優(yōu)勢菌; 在 10個排污口檢出總頻次為 1367/18.67%, 在 S1檢出頻次為164/2.24%, 在 S3、S5、S7和 S10檢出頻次分別為15/0.21%、38/0.52%、30/0.41%和 48/0.66%, 表明相對于 S3、S5、S7和 S10來說, S1的環(huán)境更適合 C.Aquiluna. rubra的生長。產氣柯林斯菌(Collinsella aerofaciens)是人體腸道中數量最高, 也是腸道微生物致病率最高的的厭氧革蘭氏陽性菌, 主要在糞源污染物中分離得到(Kageyama et al, 2000)。S1和S7兩個站點檢出26/0.36%產氣柯林斯菌(C. aerofaciens),推測S1和S7附近有糞源污染物。5個工業(yè)排污口中,S7獨自檢出了短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve), 長雙歧桿菌(B. longum), 兩岐雙岐桿菌(B. bifidum)。雙歧桿菌屬于嚴格厭氧微生物, 存在于人體腸道中, 其中短雙歧桿菌只存在于嬰兒腸道中, 這進一步證明了S7存在人類糞源污染物。皺孢鏈霉菌(Streptomyces scabrisporus)和硫藤黃鏈霉菌(S. thioluteus)隸屬于放線菌門, 放線菌綱, 放線菌目, 鏈霉菌科, 鏈霉菌屬,在S5處獨自檢出。該排污口評價近岸海域綜合環(huán)境質量為差, 生物質量類別為第二類海洋生物, 其主要污染物為鉛, 石油烴等, 生物質量綜合等級為嚴重污染。有研究表明, 鏈霉菌屬有促進對石油烴的降解作用(劉海軍等, 2014)。放線菌在含重金屬的環(huán)境中生存表現了一定的優(yōu)勢。研究發(fā)現培養(yǎng)初期的放線菌對鎘的耐受性很強, 高濃度的鎘可能刺激了放線菌的大量繁殖(陳文清, 2009), 而鏈霉菌是其中的優(yōu)勢菌群(Amoroso et al, 1998)。這是因為放線菌可以通過改變重金屬的價態(tài)來影響金屬的生態(tài)毒性, 它產生的具有絮凝活性的代謝物, 分泌到細胞外能使水中的膠體懸浮物互相凝聚沉淀, 從而達到去除重金屬離子的目的(Nies, 1999)。

3 結論

利用 454高通量測序平臺, 從寧波10個陸源排污口20個取樣站點4個月份, 鑒定出了放線菌的83個屬, 84個種。Candidatus Aquiluna rubra在5個工業(yè)排污口廣泛分布和大量繁殖, S1和S7有難培養(yǎng)的厭氧產氣柯林斯菌(Collinsella aerofaciens)的檢出, 尤其是 S7還檢出了雙歧桿菌。對此, 相關企業(yè)應及時排查人類糞源污染物源頭。S5處獨自檢出皺孢鏈霉菌(Streptomyces scabrisporus)和硫藤黃鏈霉菌(S.thioluteus), 反映了石油降解物和重金屬帶來的環(huán)境壓力, 應加強監(jiān)測和防治。

王中華, 徐茂琴, 謝 利等, 2014. 寧波沿海陸源排污口擬桿菌(Bacteroidetes)分布的特點. 海洋與湖沼, 45(5):1030—1036

王海雁, 劉 健, 趙淑江, 2010. 海洋放線菌多樣性及其代謝產物研究進展. 中國海洋藥物雜志, 29(1): 67—74

尹洪祥, 1981. 培養(yǎng)溫度對某些微生物的生長與培養(yǎng)特性的影響. 國外藥學(抗生素分冊), (1): 128

劉 兵, 李太武, 蘇秀榕等, 2009. 寧波北侖港冬季浮游細菌多樣性研究. 臺灣海峽, 28(2): 217—222

劉 睿, 朱天驕, 朱偉明等, 2006. 海洋放線菌 S1001中抗腫瘤活性成分的研究. 中國抗生素雜志, 31(1): 36—38

劉海軍, 原志敏, 韓 俊等, 2014. 石油污染土壤非培養(yǎng)放線菌多樣性分析. 環(huán)境科學與技術, 37(11): 121—127

陳文清, 侯伶龍, 劉 琛等, 2009. 根際微生物促進下魚腥草對鎘的富集作用. 四川大學學報(工程科學版), 41(2):120—124

陳麗萍, 侯付景, 張迪駿等, 2013. 寧波沿海陸源排污口假單胞菌屬(Pseudomonas)分布特點. 海洋與湖沼, 44(4):926—930

林親雄, 劉純慧, 奚 濤等, 2006. 海洋放線菌 M313菌株的鑒定及其抗腫瘤活性代謝產物的初步研究. 海洋科學,30(11): 53—57

胡 蝶, 陳文清, 張 奎等, 2011. 垃圾滲濾液處理工藝實例分析. 水處理技術, 37(3): 132—135

趙慶良, 李湘中, 1998. 垃圾滲濾液中的氨氮對微生物活性的抑制作用. 環(huán)境污染與防治, 20(6): 1—4

魏云梅, 趙由才, 2007. 垃圾滲濾液處理技術研究進展. 有色冶金設計與研究, 28(2—3): 176—181

Allgaier M, Grossart H P, 2006. Diversity and seasonal dynamics of Actinobacteria populations in four lakes in northeastern Germany. Applied and Environmental Microbiology, 72(5):3489—3497

Amoroso M J, Castro G R, Carlino F J et al. 1998. Screening of heavy metal-tolerant actinomycetes isolated from the Salí River. The Journal of General and Applied Microbiology,44(2): 129—132

Bérdy J, 2005. Bioactive microbial metabolites. The Journal of Antibiotics, 58(1): 1—26

Burkert U, Warnecke F, Babenzien D et al, 2003. Members of a readily enriched β-proteobacterial clade are common in surface waters of a humic lake. Applied and Environmental Microbiology, 69(11): 6550—6559

Gauthier D T, Rhodes M W, 2009. Mycobacteriosis in fishes: a review. The Veterinary Journal, 180(1): 33—47

Gl?ckner F O, Zaichikov E, Belkova N et al, 2000. Comparative 16S rRNA analysis of lake bacterioplankton reveals globally distributed phylogenetic clusters including an abundant group of actinobacteria. Applied and Environmental Microbiology, 66(11): 5053—5065

Hahn M W, 2009. Description of seven candidate species affiliated with the phylum Actinobacteria, representing planktonic freshwater bacteria. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 59(1): 112—117

Hu S J, Firestone M K, Chapin III F S, 1999. Soil microbial feedbacks to atmospheric CO2enrichment. Trends in Ecology & Evolution, 14(11): 433—437

Jung S W, Park J S, Kown O Y et al, 2010. Effects of crude oil on marine microbial communities in short term outdoor microcosms. The Journal of Microbiology, 48(5): 594—600

Kageyama A, Sakamoto M, Benno Y, 2000. Rapid identification and quantification of Collinsella aerofaciens using PCR.FEMS Microbiology Letters, 183(1): 43—47

Margulies M, Egholm M, Altman W E et al, 2005. Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors.Nature, 437(7057): 376—380

Methé B A, Hiorns W D, Zehr J P, 1998. Contrasts between marine and freshwater bacterial community composition: analyses of communities in Lake George and six other Adirondack lakes.Limnology and Oceanography, 43(2): 368—374

Nies D H, 1999. Microbial heavy-metal resistance. Applied Microbiology and Biotechnology, 51(6): 730—750

Swartz R C, Schults D W, Ditsworth G R et al, 1985. Sediment toxicity, contamination, and macrobenthic communities near a large sewage outfall. Special Technical Testing Publication,865: 152—175

Wang Z H, Yang J Q, Zhang D J et al, 2014a. Composition of microbial communities in industrial drain outlets microbial communities in drain outlets. Journal of Pure and Applied Microbiology, 8(1): 807—815

Wang Z H, Yang J Q, Zhang D J et al, 2014b. Composition and structure of microbial communities associated with different domestic sewage outfalls. Genetics and Molecular Research,13(3): 7542—7552

Zhang W J, Xu Q, Wang X K et al, 2004. Impacts of experimental atmospheric warming on soil microbial community structure in a tallgrass prairie. Acta Ecologica Sinica, 24(8): 1742—1747