張艷蘋 王中鐸 郭昱嵩 劉 麗 劉楚吾①

(1. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 湛江 524088; 2. 湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 長沙 410000)

黑色是動(dòng)物中分布最廣泛的顏色, 在光吸收、光保護(hù)和體色構(gòu)成上具有重要作用(Lin et al, 2007)。顏色深淺變化主要是由黑色素細(xì)胞內(nèi)合成的黑素體分布種類及數(shù)量差異引起的(Kuriyama et al, 2006;Leclercq et al, 2010)。酪氨酸酶基因家族基因編碼的酪氨酸酶及酪氨酸酶相關(guān)蛋白是催化酪氨酸酶生成黑色素的關(guān)鍵酶。在脊椎動(dòng)物中, 該基因家族成員包括酪氨酸酶基因(TYR基因)、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1基因(TYRP1)和酪氨酸酶相關(guān)蛋白 2基因(TYRP2基因)(del Marmol et al, 1996)。它們的序列具有高度一致性, 共同作用于黑色素細(xì)胞, 調(diào)節(jié)黑素生成的種類和數(shù)量(Nordlund et al, 2006)。作為酪氨酸酶基因家族基因的一員, TYRP1雖然在結(jié)構(gòu)上與TYR和TYRP2基因類似, 但因其功能具有物種特異性, 具體功能目前尚無定論(Sarangarajan et al, 2001; Braasch et al,2009)。普遍認(rèn)可的是 TYRP1可能起著起穩(wěn)定 TYR基因的功能的作用, 同時(shí)也參與維持黑素體超微結(jié)構(gòu)和影響黑色素細(xì)胞生長及死亡(Sarangarajan et al,2000; Kobayashi et al, 2007; 高莉等, 2010)。在小鼠中,TYRP1基因突變可能導(dǎo)致小鼠棕色毛發(fā)的出現(xiàn), 在人類中, TYRP1基因特定位點(diǎn)突變是人類 OCA3(oculocutaneous albinism type 3)發(fā)生的主要原因(Boissy et al, 1996; Zhang et al, 2011; Kamaraj et al,2013)。在硬骨魚中, TYRP1基因的主要功能也是參與黑色素生成, 如 在斑馬魚和青 鱂 中, TYRP1主要在眼睛和皮膚等黑素生成部位表達(dá)(Braasch et al, 2009)。

由于魚類特有的基因組復(fù)制現(xiàn)象, 酪氨酸酶基因家族基因在硬骨魚中發(fā)生了基因擴(kuò)張現(xiàn)象。但復(fù)制基因的保留方式存在種間差異, 例如斑馬魚(Danio rerio)中僅有一個(gè)TYRa, 2個(gè)TYRP1基因; 而青鳉(Oryzias latipes)中TYR和TYRP1的兩個(gè)復(fù)制基因都存在; 青斑河豚 (Tetraodon nigroviridis)中有兩個(gè)TYR和一個(gè)TYRP1a基因(Camacho-Hübner et al, 2002;Braasch et al, 2007)。

紅鰭笛鯛(Lutjanus erythropterus)是我國南海重要的經(jīng)濟(jì)魚類, 主要分布在印度洋和西太平洋海域,屬于底棲珊瑚礁魚類, 體色鮮艷, 通體鮮紅色, 又稱紅魚, 僅尾柄部具有鞍馬狀黑色斑塊(Guo et al, 2007;Zhang et al, 2015)。屬于比較理想的研究笛鯛屬魚類體色進(jìn)化的代表物種。

本研究以紅鰭笛鯛皮膚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為對(duì)象, 利用生物信息學(xué)方法, 鑒定紅鰭笛鯛酪氨酸酶相關(guān)蛋白1基因, 從分子水平解析紅鰭笛鯛 TYRP1基因的基本結(jié)構(gòu)和組織表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用魚購自廣東省湛江市霞山區(qū)東風(fēng)市場,體重(300±10)g, 體長(27±1)cm, 實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng) 3d后取樣, 暫養(yǎng)條件: 水溫(26±2)℃, 光暗周期 14h : 10h。采用MS-222將實(shí)驗(yàn)魚麻醉后快速取樣, 樣品由液氮速凍后, 置于–80℃保存?？寺〔牧蠟榧t鰭笛鯛黑色皮膚部位, qRT-PCR的實(shí)驗(yàn)材料為紅鰭笛鯛成體的黑色皮膚、紅色皮膚、腦、肉和眼睛5個(gè)組織的總RNA, 每個(gè)基因個(gè)體重復(fù)6次。

1.2 主要試劑

MS-222購自Sigma公司; M-MLV RTase cDNA Synthesisi Kit購于 Promega公司; Trizol購于Invitrogen公司; RACE試劑盒(clontech) 和 Maxima SYBR Green qPCR分別購自Roche和Thermo公司,其它試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 RACE獲得目的基因全長序列

根據(jù)紅鰭笛鯛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中注釋為TYRP1的unigene序列設(shè)計(jì)引物獲得目的基因中間片段, 再采用RACE技術(shù), 設(shè)計(jì)基因特異性引物進(jìn)行5′cDNA和3′cDNA 末端的克隆。5′RACE 和 3′RACE 的操作按照clontech的SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit說明書進(jìn)行, 將獲得的目的片段分離純化并連接到pMD18-T載體上, 然后再轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細(xì)胞中, 通過菌落 PCR挑選陽性克隆并送上海生工進(jìn)行測序, 將測序后的序列與已知的片段進(jìn)行拼接獲得目的基因的 cDNA全長。所用特異性引物見表 1

1.4 生物信息學(xué)分析

用 DNAMAN軟件將測序獲得的結(jié)果進(jìn)行拼接,得到TYRP1基因的全長cDNA序列。編碼框及非編碼區(qū)的預(yù)測利用 NCBI在線網(wǎng)站 ORF finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)來預(yù)測。分子量和等電點(diǎn)在 Expasy網(wǎng)站(http://web.expasy.org/compute_pi/)進(jìn)行分析, 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域利用 SMART軟件(http://smart.embl-heidelberg.de/)在線分析。同時(shí),利用ClustalW2軟件將 TYRP1與其它已知物種同源基因進(jìn)行比對(duì)分析。使用MEGA 5.0軟件, 以鄰位相連法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 熒光定量PCR法檢測目的基因在紅鰭笛鯛不同組織的差異表達(dá)

利用Beacon Designer軟件分別在其編碼區(qū)范圍內(nèi)設(shè)計(jì)熒光定量 PCR所需的特異性引物, 內(nèi)參為β-actin。引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成, 采用ULTRAPAGE純化方式。取紅鰭笛鯛黑色皮膚、紅色皮膚、眼、腦和肉5個(gè)組織, 提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA模板進(jìn)行熒光定量 PCR。每個(gè)基因設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)和6個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以紅鰭笛鯛肌肉組織作為對(duì)照, 排除每 3個(gè)重復(fù)中 Ct值有較大差異的數(shù)據(jù), 采用 2–ΔΔCt法計(jì)算目的基因在各組織的相對(duì)表達(dá)量, 數(shù)據(jù)分析選用SPSS 21.0進(jìn)行顯著性差異分析, 當(dāng)P＜0.05時(shí)為顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 TYRP1在紅鰭笛鯛皮膚中存在情況

查找紅鰭笛鯛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中注釋為TYRP1基因的 unigene序列, 同時(shí)下載尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)TYRP1a (ENSONIP00000009562)和TYRP1b(ENSONIP00000011122)序列對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行本地blast, 結(jié)果兩兩驗(yàn)證確定紅鰭笛鯛中存在 TYRP1的兩個(gè)拷貝基因。

2.2 TYRP1基因核苷酸序列分析

將測序獲得的 5′上游及 3′下游序列與中間片段利用 DNAman軟件進(jìn)行拼接, 分別獲得 TYRP1a和TYRP1b序列的cDNA全長。由圖1可知, TYRP1a序列全長3178bp, 其中開放閱讀框(ORF)區(qū)長1566bp,編碼521個(gè)氨基酸, 5′端235bp, 3′端1377bp, 預(yù)測其分子量 58.4kDa, 等電點(diǎn)為 5.38; 由圖 2可知,TYRP1b基因 cDNA全長 1871bp, 其中 ORF區(qū)長1656bp, 編碼 551 個(gè)氨基酸, 5′端 89bp, 3′端 126bp。

表1 TYRP1基因克隆和熒光定量引物Tab.1 The primers used in this experiment

圖1 紅鰭笛鯛TYRP1a基因序列分析Fig.1 Analysis on the sequence of TYRP1a gene

圖2 紅鰭笛鯛TYRP1b基因序列分析Fig.2 Analysis on sequence of TYRP1b gene

2.3 TYRP1基因氨基酸序列比對(duì)分析

利用 Expasy在線軟件預(yù)測 TYRP1a蛋白的分子量58.4kDa, 等電點(diǎn)為5.38; TYRP1b蛋白分子量為 61.7kDa, 等電點(diǎn)為 5.56。同時(shí)采用 Clustalx軟件對(duì)紅鰭笛鯛與其它脊椎動(dòng)物的 TYRP1氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)。如圖 3所示, 發(fā)現(xiàn)紅鰭笛鯛TYRP1氨基酸序列與其它脊椎動(dòng)物的同源序列具有較高的保守性, 其中酪氨酸酶基因家族典型的酪氨酸酶金屬離子結(jié)合位點(diǎn)和大量的半胱氨酸殘基位點(diǎn)在脊椎動(dòng)物中是高度保守的。使用SMART軟件對(duì)紅鰭笛鯛兩個(gè) TYRP1進(jìn)行蛋白質(zhì)序列分析,發(fā)現(xiàn)分別在172—407和196—431位存在酪氨酸酶基因家族典型的酪氨酸酶結(jié)構(gòu)域(圖 4)。采用MEGA5.0對(duì)紅鰭笛鯛 TYRP1基因與其它硬骨魚類、青蛙、家雞、人和小鼠等 10種脊椎動(dòng)物的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析(圖 5), 結(jié)果顯示, 紅鰭笛鯛與尼羅羅非魚和棘魚的親緣關(guān)系較近。同時(shí)還發(fā)現(xiàn), 對(duì)于含有兩個(gè) TYRP1基因復(fù)制子的硬骨魚類來講,TYRP1基因的兩個(gè)復(fù)制子分別與直系同源基因聚在一起, 而后兩個(gè)旁系同源體聚在一起, 最后與青蛙、雞、人與小鼠等只有一個(gè) TYRP1基因的脊椎動(dòng)物聚在一起, 說明 TYRP1基因的復(fù)制是發(fā)生在硬骨魚類特有的基因組復(fù)制事件中。

2.4 TYRP1基因組織表達(dá)分析

采用熒光定量PCR檢測了紅鰭笛鯛TYRP1a和TYRP1b基因在黑色皮膚、紅色皮膚、眼睛、肌肉和腦中的表達(dá), 見圖6。結(jié)果顯示, TYRP1a和TYRP1b基因都在眼睛部位顯示出最高表達(dá)量。不同的是,TYRP1a在除眼睛外的其它部位表達(dá)量都較低, 而TYRP1b在黑色皮膚部位也顯示較高表達(dá)。此外, 比較兩個(gè)基因在同一部位的表達(dá)量時(shí), 發(fā)現(xiàn)TYRP1b在眼睛、黑色皮膚和紅色皮膚等黑色素生成部位的表達(dá)量都高于TYRP1a基因; 而在腦和肌肉中, 兩個(gè)基因都表現(xiàn)出微弱表達(dá)。

圖3 TYRP1氨基酸序列與其它脊椎動(dòng)物氨基酸序列比對(duì)Fig.3 Multi-alignment of TYRP1 of other vertebrates

圖4 SMART軟件預(yù)測的TYRP1a(左)和TYRP1b(右)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域Fig.4 Analysis of TYRP1a (left) and TYRP1b (right) protein structure with SMART software

圖5 基于TYRP1氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 The Neighbor-Joining (NJ) phylogenetic tree constructed based on TYRP1 amino acid sequences

3 討論

圖6 TYRP1基因在紅鰭笛鯛不同組織中的表達(dá)分布Fig.6 Expression patterns of TYRP1 gene in different tissues of L. erythropters

大約4.5億年前, 硬骨魚祖先與四足動(dòng)物分化后又經(jīng)歷了其特有的基因組復(fù)制, 許多基因在人類、鳥類及四足動(dòng)物中僅有一個(gè)拷貝, 而在魚類中存在兩個(gè)不同的直系同源/旁系同源基因(Yamanoue et al,2006)。Braasch等(2007)通過對(duì)五種常見硬骨魚的體色基因統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn), 黑色素合成通路中約3/4的基因在硬骨魚中存在2個(gè)拷貝。本研究通過將紅鰭笛鯛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中注釋為 TYRP1的 unigene序列與尼羅羅非魚兩個(gè) TYRP1基因的本地 blast結(jié)果兩兩驗(yàn)證,確定紅鰭笛鯛中含有 TYRP1a和 TYRP1b兩個(gè)基因,并得到其unigene序列, 應(yīng)用RACE技術(shù)克隆獲得兩個(gè)基因的 cDNA序列全長。軟件分析發(fā)現(xiàn)紅鰭笛鯛TYRP1a和TYRP1b基因都含有具有典型的酪氨酸酶結(jié)構(gòu)域(Tyrosinase)。序列同源性比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),TYRP1a和TYRP1b基因在脊椎動(dòng)物中具有較高的保守性, 尤其對(duì)于與酪氨酸基因家族基因典型酶活性有關(guān)的位點(diǎn)(del Marmol et al, 1996; Camacho-Hübner et al, 2002), 如多個(gè)半胱氨酸殘基、6個(gè)組氨酸殘基、高度疏水的跨膜區(qū)、C端由亮氨酸和酪氨酸殘基組成的胞質(zhì)尾, 在脊椎動(dòng)物中是高度保守的。其中一個(gè)半胱氨酸富集區(qū)含有 EGF-motif (epidermal-growth factor)位點(diǎn), 該位點(diǎn)在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中起重要作用(Jackson, 1994)。6個(gè)組氨酸殘基構(gòu)成2個(gè)各包含3個(gè)組氨酸殘基的銅離子結(jié)合位點(diǎn), 該位點(diǎn)對(duì)于維持酪氨酸酶的酶活性起基本作用(Furumura et al,1998)。紅鰭笛鯛 TYRP1a和 TYRP1b氨基酸序列分別在 469—491和 493—515為高度疏水的跨膜結(jié)構(gòu)域。研究發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)與其后的C端胞質(zhì)尾共同協(xié)作確保將TYRP1蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到黑素體并與黑素體特有的膜結(jié)構(gòu)結(jié)合(Jimbow et al, 2000)。以上信息表明, 在分子水平, 紅鰭笛鯛兩個(gè) TYRP1基因之間及與其它物種的蛋白具有很高的同源性。

為了進(jìn)一步研究TYRP1a和TYRP1b基因在紅鰭笛鯛中的功能, 采用熒光定量 PCR技術(shù)對(duì) TYRP1a和 TYRP1b基因在紅鰭笛鯛不同組織的表達(dá)進(jìn)行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn), TYRP1a和TYRP1b基因均在眼睛部位顯示出最高表達(dá)。同時(shí), TYRP1b在黑色皮膚和紅色皮膚中也有一定表達(dá), 且黑色皮膚部位表達(dá)高于紅色皮膚。已有研究報(bào)道TYRP1基因在多種動(dòng)物中都參與了黑色素的合成, 高莉等(2008)發(fā)現(xiàn)TYRP1基因在黑色素含量高的棕色羊駝毛皮中的表達(dá)量高于白色羊駝中; 黑色家兔皮膚組織中 TYRP1基因的平均表達(dá)水平顯著高于白色家兔(朱亮等, 2013); 在魚類中, Braasch等(2009)通過原位雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn): 斑馬魚中, TYRP1b在黑色素生成部位如眼睛、皮膚和鰭條中均有表達(dá); 青鳉中, TYRP1a和 TYRP1b基因在眼睛中都有表達(dá)。眼睛和黑色皮膚是紅鰭笛鯛中黑色素含量最高的部位, 據(jù)此推測TYRP1a和TYRP1b在紅鰭笛鯛也具有參與黑色素的合成有關(guān)的功能。

熒光定量 PCR結(jié)果同時(shí)顯示, 在紅鰭笛鯛中,TYRP1b在眼睛和黑色皮膚等部位的表達(dá)量明顯高于TYRP1a, 表明紅鰭笛鯛中 TYRP1a與黑色素合成的功能較弱。推測或許與兩個(gè)TYRP1基因的差異進(jìn)化有關(guān)。諸多研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過基因組復(fù)制后的兩個(gè)旁系同源體的差異進(jìn)化是導(dǎo)致魚類物種進(jìn)化和多樣性的重要原因(Meyer et al, 1999; Klüver et al, 2005; Jovelin et al, 2007; Ohno, 2013)。通過對(duì)硬骨魚復(fù)制基因的進(jìn)化研究發(fā)現(xiàn), 復(fù)制后的基因一般有三種進(jìn)化模式: 去功能化, 亞功能化和新功能化(Lynch et al, 2004,Hahn, 2009)鱂。青中MIFT2基因相比于MITF1基因功能逐漸減弱, 趨向于去功能化或新功能化(Li et al,2013); 南極魚(Antarctic zoarcid fish)中唾液酸合成酶基因(SAS)的一個(gè)基因進(jìn)化出與抗凍有關(guān)的新功能(Deng et al, 2010)。關(guān)于紅鰭笛鯛中復(fù)制基因的進(jìn)化模式仍需進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)成功克隆了紅鰭笛鯛TYRP1a和TYRP1b兩個(gè)基因的cDNA全長, 通過在紅鰭笛鯛不同部位表達(dá)量的分析, 確定TYRP1b在紅鰭笛鯛中具有更廣泛的表達(dá), 且在眼睛和皮膚等黑色素生成部位有更高的表達(dá)量, 該結(jié)果可以為繼續(xù)深入研究紅鰭笛鯛體色相關(guān)基因在基因復(fù)制后的功能進(jìn)化提供理論基礎(chǔ)。

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