鄧益琴 趙晶晶 劉松林 趙 哲 陳 償

(1. 中國科學院南海海洋研究所 中國科學院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室 廣州 510301; 2. 中國科學院南海海洋研究所 廣東省應用海洋生物學重點實驗室 廣州 510301; 3. 中國科學院南海海洋研究所 西沙、南沙深海海洋環(huán)境觀測研究站 廣州 510301; 4. 中國科學院大學 北京 100049)

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是海洋環(huán)境中普遍存在的革蘭氏陰性菌。它是海水養(yǎng)殖中最常見和危害最嚴重的細菌性病原之一(Campanelli et al, 2008; 賴迎迢等, 2014), 其引起的“弧菌病”的發(fā)病率在近些年呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(Newton et al, 2012)。同時, 溶藻弧菌也是人類的機會致病菌, 可通過食源途徑引起人類患病(Feingold et al, 2004; Austin 2010)。其致病性與相關致病因子的表達調(diào)控密切相關, 因此深入研究溶藻弧菌的分子致病機理, 對溶藻弧菌病害暴發(fā)的防控非常重要。

分子伴侶 Hfq在細菌環(huán)境適應過程以及毒力等多種生命活動中具有重要調(diào)控作用(Sousa et al, 2010;Berghoff et al, 2011; Cui et al, 2013)。因此, hfq基因的缺失通常引起細菌許多表型變化(Cui et al, 2013;Arce-Rodríguez et al, 2015)。如副溶血弧菌中 hfq 缺失導致菌株超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性下調(diào), 從而抗氧化能力增強(Su et al, 2010); 致病菌銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)在缺失hfq基因后, 不但影響到生長速度和環(huán)境適應因子 σS的表達量, 而且與致病力相關的顫搐(twitching)、涌動(swarming)的能力也大為下降, 各種毒素如彈性蛋白酶、過氧化氫酶的合成甚至下降 80%以上(Sonnleitner et al, 2006)。但Hfq蛋白在不同細菌中的調(diào)控作用不同, 如Hfq作為協(xié)助sRNAs的分子伴侶,參與細菌群體感應(quorum sensing, QS)系統(tǒng)的調(diào)控,在霍亂弧菌中, QS系統(tǒng)控制著毒力、生物膜合成、蛋白酶分泌等(Nielsen et al, 2006; Joelsson et al, 2007);而在鰻弧菌中, QS系統(tǒng)負責調(diào)控生物膜合成、絲氨酸合成、色素的產(chǎn)生及EmpA金屬蛋白酶的合成(Weber et al, 2008)。但是, 目前通過研究Hfq對溶藻弧菌生物學特性的影響來分析其毒力的系統(tǒng)性研究還較少。

本研究以溶藻弧菌ZJ-T為研究對象, 探討hfq基因?qū)θ茉寤【\動、生物膜形成、鐵代謝、胞外蛋白酶分泌等與毒力相關生理生化過程, 進而研究Hfq對其毒力的調(diào)控作用, 從而揭示Hfq在溶藻弧菌疾病暴發(fā)中的作用, 同時也為控制溶藻弧菌病害的暴發(fā)提供新的思路和防治靶標。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 實驗所用菌株: 溶藻弧菌野生株ZJ-T,hfq突變株Δhfq-T,hfq回補株hfq+-T及大腸桿菌DH5α見表1。

1.1.2 主要試劑 NaCl、葡萄糖、MgSO4、結(jié)晶紫等生化試劑購自廣州威佳公司。脫脂奶粉、2-2’-聯(lián)吡啶購至生工生物工程上海股份有限公司。小牛血清購至Gibco公司。

1.1.3 主要培養(yǎng)基 TSB (Tryptic Soy Broth)培養(yǎng)基購自BD公司。LB (Luria-Bertani) / LBS (3%NaCl)培養(yǎng)基的組分蛋白胨、酵母粉和瓊脂粉購自廣東環(huán)凱公司。DEME培養(yǎng)基購至Gibco公司。

1.1.4 實驗用細胞和石斑魚 試驗用小鼠成肌細胞系C2C12細胞由本研究所“海洋生物技術與遺傳學科組”趙密博士提供。實驗用石斑魚(Epinephelus awoara)購至海口水產(chǎn)市場, 每尾15—20g, 在室內(nèi)實驗室 2m3水箱內(nèi)暫養(yǎng) 1周后用于實驗。

表1 實驗所用菌株Tab.1 Strains of V. alginolyticus used in this study

1.2 方法

1.2.1 游動性和涌動性測定 將單個克隆的溶藻弧菌ZJ-T、Δhfq-T和hfq+-T分別接種至LBS液體培養(yǎng)基, 于 30°C 200r/min振搖培養(yǎng)過夜; 調(diào)整培養(yǎng)液濃度至相同吸光度(OD600nm=1.0), 取 5 μL平行三次點樣到0.3%瓊脂半固體LBS平板測試其游動性, 同時取 5μL平行三次點樣到 1.5%瓊脂固體 LBS平板測試其涌動性, 分別 30°C靜置培養(yǎng)16h和24h, 測量菌斑直徑。

1.2.2 生物膜形成實驗 將單個克隆的溶藻弧菌ZJ-T、Δhfq-T和hfq+-T分別接種至LBS液體培養(yǎng)基, 于30°C 200r/min振搖培養(yǎng)過夜。按1mL/孔用量于24孔培養(yǎng)板中加入BF培養(yǎng)基(Biofilm growth medium)。調(diào)整培養(yǎng)液濃度至相同吸光度(OD600nm=1.0),同一菌株平行三次分別將10 μL調(diào)試菌液加到1 mL BF培養(yǎng)基, 30°C靜置培養(yǎng)。每2h間隔取樣, 利用結(jié)晶紫染色法定量測定生物膜生成量 OD590nm。結(jié)晶紫染色法操作參見Chen 等(2009)。

1.2.3 限鐵環(huán)境下生長能力測試 將單個克隆的溶藻弧菌ZJ-T、Δhfq-T和hfq+-T分別接種至LBS液體培養(yǎng)基, 于30°C 200r/min振搖培養(yǎng)過夜。調(diào)整培養(yǎng)液濃度至相同吸光度(OD600=5.0), 同時10倍倍比稀釋各菌株菌液至最高稀釋倍數(shù)為 106, 然后將倍比稀釋菌液依次取 5μL平行三次點樣到 TSB平板以及TSB添加120μmol/L 2-2’-聯(lián)吡啶平板上, 30°C靜置培養(yǎng)24h, 觀察細菌生長情況。

1.2.4 細菌胞外蛋白酶活性檢測 將單個克隆的溶藻弧菌ZJ-T、Δhfq-T和hfq+-T分別接種至LBS液體培養(yǎng)基, 于 30°C 200r/min振搖培養(yǎng)過夜; 調(diào)整培養(yǎng)液濃度至相同吸光度(OD600nm=5.0), 取5μL平行三次點樣到LBS添加1%脫脂奶粉平板上。30°C靜置培養(yǎng)24h, 測量蛋白分解圈直徑以及克隆直徑。

1.2.5 細胞感染實驗 C2C12細胞在37°C下培養(yǎng)于DEME添加10%小牛血清培養(yǎng)液中。將單個克隆的溶藻弧菌ZJ-T、Δhfq-T和hfq+-T分別接種至LBS液體培養(yǎng)基, 于30°C 200r/min振搖至對數(shù)期。同時,接種沒有細胞毒性的大腸桿菌DH5α單克隆至LB液體培養(yǎng)基, 于 37°C 200r/min振搖至對數(shù)期作為陰性對照。室溫下, 4000g 3min離心收集細菌, 細菌沉淀用無血清DEME培養(yǎng)液洗滌兩次后以感染復數(shù)MOI=100的量加入到單層C2C12細胞中。分別在感染0.5、1.0、2.0以及3.0h后, 于顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。

1.2.6 石斑魚致死性實驗 石斑魚每組5尾, 分別于5L的容器中25—28°C條件下飼養(yǎng), 定期喂食。細菌于LBS液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜, 用滅菌的生理鹽水洗脫, 并稀釋成不同濃度的菌體懸液。分別取100 μL不同濃度的溶藻弧菌ZJ-T、Δhfq-T和hfq+-T菌液腹腔注射石斑魚, 對照注射等體積的生理鹽水。注射的石斑魚相同條件下飼養(yǎng)一周, 記錄死亡數(shù), 計算半數(shù)致死量(LD50)。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理與分析 所有試驗重復三次以上,使用統(tǒng)計分析軟件IBM SPSS Statistics 19進行單因素方差LDS分析, P＜0.05被認為顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 Hfq對溶藻弧菌運動性的調(diào)控

在0.3%瓊脂半固體LBS平板及1.5%瓊脂固體LBS平板上, hfq缺失均造成溶藻弧菌運動能力極顯著下降(P＜0.001); 在hfq+-T中, 運動能力的缺失得到回補(圖1A, 1B)。以上結(jié)果表明, hfq基因正調(diào)控溶藻弧菌的運動性。

圖1 溶藻弧菌ZJ-T、Δhfq-T和 hfq+-T在0.3%和1.5%瓊脂LBS平板上的運動性(A)及統(tǒng)計分析(B)Fig.1 Motility of ZJ-T, Δhfq-T and hfq+-T on 0.3% and 1.5% LBS agar plates (A) and statistical analysis (B)

2.2 hfq缺失對溶藻弧菌生物膜形成的影響

在細菌生物膜形成的動態(tài)曲線中, 可見 hfq缺失后并不影響生物膜成熟的時間, 仍可在BF培養(yǎng)基中, 30°C靜置培養(yǎng)6 h后到達頂峰, 且hfq的缺失并沒有對成熟期生物膜的密度造成影響, 但其前期的合成速度明顯下降,而后期的解離速度上升(圖2)。以上結(jié)果說明, hfq基因同時調(diào)控溶藻弧菌生物膜的形成和解離。

圖2 溶藻弧菌ZJ-T、Δhfq-T和hfq+-T細胞生物膜形成動力學曲線Fig.2 Kinetic biofilm formation of ZJ-T, Δhfq-T and hfq+-T

2.3 hfq缺失對溶藻弧菌鐵離子代謝及胞外蛋白酶分泌的影響

攝鐵系統(tǒng)和胞外蛋白酶是溶藻弧菌兩個重要致病因子。從圖3中可以看出, hfq缺失后, 細菌在鐵離子螯合劑2-2’-聯(lián)吡啶存在情況下生長有所減弱, 說明hfq的缺失, 減弱溶藻弧菌的攝鐵能力; 此外從圖4中看出, hfq缺失后, 溶藻弧菌胞外蛋白酶的分泌顯著增加(P＜0.01)。

2.4 C1C12細胞感染實驗

經(jīng)野生菌株 ZJ-T(圖 5, e—h)和回補菌株 hfq+-T(圖 5, m—p)感染的細胞, 在感染 1.0h后即出現(xiàn)細胞變圓脫落; 并且隨著感染時間延長, 變圓脫落的細胞逐漸增加。而 hfq缺失后, 隨著感染時間延長, 細胞變圓脫落現(xiàn)象幾乎不發(fā)生(圖 5, i—l), 與陰性對照組DH5α (圖 5, a—d)表現(xiàn)一致。

以上結(jié)果說明, Hfq正調(diào)控溶藻弧菌的細胞毒性。

2.5 石斑魚致死性實驗

為測定hfq突變后對溶藻弧菌毒力的影響, 用注射石斑魚的方法對其進行動物毒力實驗。結(jié)果顯示(表 2), hfq缺失后造成溶藻弧菌毒力喪失, 半數(shù)致死量LD50達到2.8×109CFU, 相比野生株和回補株提高了3個數(shù)量級。

3 討論

圖3 溶藻弧菌ZJ-T、Δhfq-T和hfq+-T在TSB以及TSB添加120μmol/L 2-2′-聯(lián)吡啶平板上的生長情況Fig.3 Growth ability of ZJ-T, Δhfq-T and hfq+-T on TSB agar plate and TSB agar plate supplemented with 120μmol/L 2,2′-Bipyridyl

圖4 溶藻弧菌ZJ-T、Δhfq-T和 hfq+-T在LBS+1%脫脂奶粉平板上胞外蛋白酶的分泌(A)以及統(tǒng)計分析(B)Fig.4 The extracellular protease activities of ZJ-T, Δhfq-T and hfq+-T on LBS agar plates containing 1% skimmed milk (A) and statistical analysis (B)

圖5 Hfq正調(diào)控溶藻弧菌對C2C12的細胞毒性Fig.5 Hfq positively regulated the cytotoxicity to C2C12 in V. alginolyticus

表2 溶藻弧菌ZJ-T、Δhfq-T和hfq+-T對石斑魚的致死性Tab.2 Virulence to Epinephelu+s coioides of ZJ-T, Δhfq-T and hfq-T

hfq缺失使得溶藻弧菌游動能力和涌動能力都顯著下降(P＜0.001) (圖1A, 1B), 這與致腎盂腎炎大腸埃希菌(Uropathogenic Escherichia coli)、鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium)和銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中研究結(jié)果類似(Sonnleitneret al, 2003;Sittkaet al, 2007; Kulesuset al, 2008)。hfq缺失株很可能改變了溶藻弧菌鞭毛的生長(Liuet al, 2011)。生物膜的形成在hfq缺失的情況下減弱(圖2), 這與霍亂弧菌(Vibrio cholerae)以及嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)的結(jié)果相似(Chaoet al,2010; Roscettoet al, 2012)。但與卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)和惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)中的研究結(jié)果相悖(Attiaet al, 2008; Chaoet al, 2010)。這是因為細菌的生物膜形成模式多樣, 參與因子也各有不同(Davey et al, 2000), 如大腸桿菌需要鞭毛的游動、I型菌毛及外膜蛋白 Ag43參與前期的附著, 而胞外多糖參與成熟; 在綠膿桿菌中初期附著即需要鞭毛、脂多糖(LPS)及外膜蛋白, 在生物膜成熟階段, 則需要胞間通訊信號分子高絲氨酸類脂(acyl-HSLs, AHLs)及海藻酸鈉(Alginate)的參與。因此, 這里Hfq很可能通過改變?nèi)茉寤【\動能力, 從而參與調(diào)控了前期的細胞附著過程。而成熟過程還可能受到分泌的胞外多糖、外膜蛋白以及各種信號分子的影響。

細胞毒性實驗和石斑魚感染實驗都表明hfq缺失后,溶藻弧菌毒力顯著下降甚至消失(圖5, 表2)。溶藻弧菌的主要毒力因子包括攝鐵系統(tǒng)、粘附素、胞外產(chǎn)物、生物膜等(滕勇勇等, 2014; Wyckoff et al, 2015)。本研究發(fā)現(xiàn), hfq缺失株在限鐵環(huán)境上生長減弱(圖3), 因此, Hfq可能通過輔助相關 sRNAs從而調(diào)控鐵代謝相關基因的表達(Mellin et al, 2010; Deng et al, 2012), 達到調(diào)控溶藻弧菌毒力的作用。此外, 細菌感染宿主的第一步是粘附, 這主要通過粘附素來完成。前人研究表明溶藻弧菌對Hep-2細胞, 上皮細胞, 黑鯛的腸粘膜、鰓、表皮等都有較強的粘附作用(Baffone et al, 2001;Balebona et al, 2001)。其中鞭毛是溶藻弧菌菌毛粘附素之一, 本研究中hfq缺失株的運動性下降也可能導致其毒力下降。Berg等(1995)和 Liang等(2007)研究發(fā)現(xiàn)霍亂弧菌運動功能缺失后不僅影響其在腸道內(nèi)定殖能力, 而且霍亂毒素、溶血素等毒力因子表達缺失(Berg et al, 1995; Liang et al, 2007)。因此, 溶藻弧菌很可能與霍亂弧菌存在一套相同的運動性調(diào)控致病性的系統(tǒng), 即 Hfq通過調(diào)控溶藻弧菌的運動能力,從而調(diào)控其對宿主的粘附能力, 影響其在宿主體內(nèi)的定殖, 并且調(diào)控其相關毒力因子的表達, 進而影響溶藻弧菌對宿主的致病性(Josenhans et al, 2002;Liang et al, 2007)。致病菌粘附定殖宿主后很容易形成生物膜, 與外界隔離并適應宿主環(huán)境, 起到自我保護作用。細菌形成生物膜主要通過減少宿主機體細胞因子產(chǎn)生、酶解宿主細胞因子等抗免疫機制以及對抗生物素等的抗藥性機制致病。從生物膜形成動態(tài)曲線(圖2)看出: 6h后生物膜形成量達到最多; 24h后hfq缺失株生物膜基本解離完全, 且此過程中hfq缺失株生物膜形成速度以及生物膜量均低于野生株和回補株, 因此, 在溶藻弧菌中生物膜的形成也與其毒力密切相關。此外, 本研究發(fā)現(xiàn), hfq缺失株胞外蛋白酶分泌顯著增強(P＜0.01) (圖4A, 4B)。因此, 溶藻弧菌胞外蛋白酶對所測試的 C2C12細胞以及石斑魚紅細胞可能不具有溶解作用, 而其溶血素、堿性絲氨酸蛋白酶(Alkaline serine exoprotease, AspA)等胞外產(chǎn)物調(diào)控其毒力作用(Toranzo et al, 1983; Chen et al, 2000)。

4 結(jié)語

Hfq調(diào)控溶藻弧菌的運動、生物膜形成、鐵代謝、胞外蛋白酶分泌等生理生化過程, 從而改變其對宿主的侵染粘附以及攝鐵能力等, 并對宿主產(chǎn)生毒性。Hfq作為分子伴侶, 協(xié)助相關 sRNAs轉(zhuǎn)錄后調(diào)控相關基因表達, 而這些基因中很有可能存在毒力基因, 因此下一步通過研究Hfq依賴型sRNAs對溶藻弧菌致病性的調(diào)控, 尋找新的毒力相關基因, 這為控制溶藻弧菌病害暴發(fā)提供理論指導具有重要意義。

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