徐苗苗 李 健 李桂玲 蘇國(guó)成 陳吉?jiǎng)?劉靜雯①

(1. 集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 廈門 361021; 2. 福建省高校食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廈門 361021;3. 浙江萬(wàn)里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院 寧波 315100)

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)隸屬弧菌科的弧菌屬。是一種嗜鹽性海洋人魚共患致病菌,于1950年由日本的藤原恒三郎教授從引起食物中毒的小沙丁魚中初次分離得到(藤野恒三郎, 1951)。該菌廣泛分布于世界各地的近岸海水、海底沉積物、海產(chǎn)品及腌制食品中(Su et al, 2007)。副溶血性弧菌食物中毒與進(jìn)食含有該菌的食物有關(guān), 生食或食入未煮熟的受到污染的海產(chǎn)品或腌制食品是其主要傳播途徑(Chiou et al, 2000; McLaughlin et al, 2005;Hara-Kudo et al, 2012; Nelapati et al, 2012; Newton et al, 2012)。近年來(lái)由副溶血性弧菌引起的食源性食物中毒的比例高達(dá)68.0%, 居我國(guó)沿海地區(qū)細(xì)菌性食物中毒之首(毛雪丹等, 2013)。全球食源性腹瀉疾病中有 50%—70%是由副溶血性弧菌引起(Wang et al,2013; Xu et al, 2014)。因此, 選擇合適的檢測(cè)靶點(diǎn), 建立快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法是預(yù)防副溶血性弧菌食物中毒最有效的途徑之一。

目前用于檢測(cè)副溶血性弧菌的技術(shù)包括傳統(tǒng)PCR法、熒光定量PCR法、多重PCR法、酶聯(lián)免疫吸附法、免疫膠體金、核酸探針技術(shù)、基因芯片技術(shù)、變性高效液相色譜技術(shù)及DNA指紋圖譜等(Parida et al, 2005; Ward et al, 2006; Bisha et al, 2012; Ceccarelli et al, 2013)。這些方法因所需設(shè)備昂貴、耗時(shí), 技術(shù)水平要求較高等弊端, 實(shí)用性受到限制(徐苗苗等,2014)。近年發(fā)展起來(lái)的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于病原微生物的快速檢測(cè)(Prompamorn et al,2011; Xu et al, 2012), 該方法在恒溫條件下就能發(fā)生反應(yīng), 對(duì)設(shè)備的要求比較低, 操作簡(jiǎn)單, 反應(yīng)只需60min, 較傳統(tǒng)的 PCR技術(shù)具有高效、快速等優(yōu)點(diǎn),因此在某種程度上很好地解決了目前基因檢測(cè)的弊端。交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Cross priming amplification, CPA)是基于環(huán)介導(dǎo)等溫技術(shù)基礎(chǔ)上的一種新型的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù), 其原理與環(huán)介導(dǎo)等溫技術(shù)不盡相同, 該方法具有較高的特異性和靈敏度(Fanget al, 2009; Xuet al, 2012; Yanget al, 2014)。將CPA技術(shù)與核酸試紙條相結(jié)合, 通過(guò)免疫雜交反應(yīng)使對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)更為快速、便捷, 尤其適用在現(xiàn)場(chǎng)和基層檢測(cè)使用(Zhaoet al, 2010)。目前針對(duì)副溶血性弧菌的CPA核酸試紙條快速檢測(cè)方法尚未見(jiàn)報(bào)道。tlh基因是副溶血性弧菌三大毒力基因之一, 同時(shí)也是種特異性基因, 無(wú)論是環(huán)境分離株還是臨床致病株均含有該基因(Yamazakiet al, 2008; Gutierrez Westet al,2013; Heet al, 2014)。本研究以副溶血性弧菌tlh為靶標(biāo)基因, 建立副溶血性弧菌CPA-核酸試紙條快速檢測(cè)技術(shù), 以用于現(xiàn)場(chǎng)和基層該病原微生物的快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種與試劑 Bst DNA 聚合酶、10×Thermopol購(gòu)自 New England Bio Labs公司;MgSO4、dNTPs、10×PCR Buffer、10×loading Buffer、rTaq DNA、100bp DNA Ladder Marker均購(gòu)自TaKaRa公司; 甜菜堿購(gòu)自Sigma公司; 核酸檢測(cè)試紙條購(gòu)自杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司。FTA Filter及FTA專用緩沖液均購(gòu)自 Whatman公司。副溶血性弧菌、霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、沙門氏菌, 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 引物與探針的設(shè)計(jì) 通過(guò)序列比對(duì)確定副溶血性弧菌tlh基因(GenBank: JX262976.1)的保守區(qū)域, 選取該區(qū)域的六個(gè)不同位置利用Primer 5.0分別設(shè)計(jì)外圍引物、交叉引物和檢測(cè)探針(兩條探針?lè)謩e用Fitc和Biotin進(jìn)行標(biāo)記)用于CPA擴(kuò)增反應(yīng)。引物及探針序列如表1。

表1 CPA引物及探針序列Tab.1 CPA primers and the sequences of probes

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA模板的制備 采用 CTAB/NaCl法和熱裂解法提取基因組。CTAB/NaCl: 取過(guò)夜培養(yǎng)的副溶血性弧菌菌液1 mL, 采用CTAB/NaCl法進(jìn)行基因組的提取(Sambrooket al, 2001)。熱裂解法: 取過(guò)夜培養(yǎng)的菌懸液1 mL于1.5 mL離心管中, 12000 g離心3 min, 盡量吸去上清液, 向離心管中加入無(wú)菌水洗滌沉淀兩次之后加入100 μL無(wú)菌水重懸菌體沉淀。將菌懸液置于水浴鍋中100°C煮沸10 min, 13000 g離心2.5 min, 取上清于一新的離心管中, –20°C保存待用。

1.2.2 副溶血性弧菌重組克隆質(zhì)粒的構(gòu)建 以副溶血性弧菌基因組為模板, 用外圍引物 VPOF/VPOR進(jìn)行 PCR擴(kuò)增, 電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR反應(yīng)體系為 VPOF 0.8μmol/L、VPOR 0.8μmol/L、10×PCR Buffer 2.5μL、dNTPs 2.0μL、rTaq 0.3μL, 加水補(bǔ)足至 25μL。反應(yīng)程序: 94°C 5min; 94°C 30s、59°C 30s、72°C 30s;72°C 5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證, 電泳結(jié)果顯示, PCR產(chǎn)物條帶與目的片段大小一致。對(duì)目的條帶進(jìn)行切膠回收。純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD19-T載體在連接酶的作用下進(jìn)行連接反應(yīng), 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞 TOP10, 挑取陽(yáng)性菌落進(jìn)行增菌培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。將重組克隆質(zhì)粒送上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果表明該 PCR擴(kuò)增所得的片段即為特異性副溶血性弧菌核酸片段, 是反應(yīng)的特異性目標(biāo)序列。

1.2.3 CPA反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化 將兩對(duì)擴(kuò)增引物及探針按照通用的CPA擴(kuò)增條件組成20μL的反應(yīng)體系(表2)。置于63°C恒溫金屬浴中反應(yīng)60min, 對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。驗(yàn)證用于 CPA擴(kuò)增的引物及探針的可行性。結(jié)果顯示擴(kuò)增反應(yīng)正常發(fā)生, 擴(kuò)增效果理想。證明該引物及探針可以使用, 在此基礎(chǔ)上對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)一步優(yōu)化。

首先對(duì)引物濃度進(jìn)行優(yōu)化, 通過(guò)比較不同濃度引物的擴(kuò)增效果, 選出最佳引物濃度。在確定引物濃度后, 依次對(duì)擴(kuò)增體系中的MgSO4、dNTPs、甜菜堿、bst DNA聚合酶、反應(yīng)溫度及反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。首先固定其它因素條件不變, 對(duì)要優(yōu)化的因素進(jìn)行濃度梯度的設(shè)置。Mg2+的濃度設(shè)置為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0mmol/L 9個(gè)濃度梯度; dNTPs的濃度設(shè)置為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mmol/L 8個(gè)濃度梯度; 甜菜堿濃度設(shè)置為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mol/L 8個(gè)濃度梯度; BstDNA polymerase 設(shè)置為 0、1.6、3.2、4.8、6.4、8.0、9.6 U 7個(gè)濃度梯度。反應(yīng)溫度設(shè)置為57、59、61、63、65、67°C 6個(gè)溫度梯度。在確定了以上5個(gè)因素后, 最后對(duì)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化, 反應(yīng)時(shí)間分別為 0、15、30、45、60、75、90 min, 擴(kuò)增結(jié)束后, 將擴(kuò)增產(chǎn)物冰浴并離心。用 2%瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物,通過(guò)比較擴(kuò)增效果從而確定最佳的反應(yīng)條件。

表2 CPA通用反應(yīng)體系Tab.2 Common reaction system of CPA

1.2.4 CPA-核酸試紙條法結(jié)果判定 CPA擴(kuò)增結(jié)束后, 取8—10μL擴(kuò)增產(chǎn)物, 滴加到樣品墊上。將試紙條放入含有100μL緩沖液的微孔板中, 15—30 min后判讀結(jié)果。當(dāng)試紙條上質(zhì)控線和檢測(cè)線均出現(xiàn)紅色條帶, 表明樣本中含有被檢測(cè)的目標(biāo)核酸產(chǎn)物, 結(jié)果判為陽(yáng)性。如果試紙條上只有質(zhì)控線出現(xiàn)紅色條帶而檢測(cè)線沒(méi)有條帶出現(xiàn)表明樣本中未檢測(cè)出目的核酸,結(jié)果呈陰性。若試紙條質(zhì)控線和檢測(cè)線均未有條帶出現(xiàn), 說(shuō)明試紙條可能已損壞、失效或使用操作不當(dāng)。

1.2.5 CPA法檢測(cè)副溶血性弧菌特異性驗(yàn)證 用CTAB/NaCl法分別提取副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、霍亂弧菌、沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的基因組。在相同條件下采用 CPA法對(duì)不同的基因組模板進(jìn)行擴(kuò)增, 2%瓊脂糖電泳法和核酸試紙條法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.6 CPA法與普通PCR法檢測(cè)副溶血性弧菌靈敏度的比較 取過(guò)夜培養(yǎng)的副溶血性弧菌菌液1 mL經(jīng)梯度稀釋后涂布于LB固體培養(yǎng)平板上進(jìn)行菌落計(jì)數(shù), 每個(gè)梯度作三個(gè)平行。次日觀察平板上菌落的生長(zhǎng)情況并計(jì)數(shù), 根據(jù)統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù), 計(jì)算出同一個(gè)稀釋度3個(gè)平板上的平均菌落數(shù), 通過(guò)稀釋的倍數(shù)計(jì)算出每毫升樣品中菌落形成單位數(shù)。將已知濃度的原菌液進(jìn)行 10n倍梯度稀釋, 進(jìn)而采用普通熱裂解法制備基因組模板, 同時(shí)進(jìn)行普通 PCR和 CPA擴(kuò)增, 電泳和試紙條檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物, 比較兩種方法檢測(cè)純培養(yǎng)物的靈敏度。CPA擴(kuò)增在最佳反應(yīng)體系下進(jìn)行, 擴(kuò)增引物采用外圍擴(kuò)增引物上游引物 VPOF : TGCGAA AGTGCTTGAGAT, 下游引物 VPOR: GATGAGCGG TTGATGTCC。PCR擴(kuò)增采用引物為上游引物VPOF:TGCGAAAGTGCTTGAGAT, 下游引物 VPOR:GATGAGCGGTTGATGTCC。反應(yīng)條件: 94°C 5min;94°C 1min, 49°C 30 s, 72°C 45 s, 30 個(gè)循環(huán); 72°C 5min。

1.2.7 CPA法檢測(cè)人工污染牡蠣樣品中副溶血性弧菌靈敏度的確定 實(shí)驗(yàn)用新鮮牡蠣樣品購(gòu)自廈門集美菜市場(chǎng), 在人工污染副溶血性弧菌前, 該牡蠣樣品經(jīng)國(guó)標(biāo)法檢測(cè)證實(shí)不含有副溶血性弧菌。然后將增菌培養(yǎng)后的副溶血性弧菌菌液人工污染到牡蠣樣品中: 取25g樣品加入225mL APW中, 勻漿機(jī)攪拌 90s。然后添加不同濃度梯度的副溶血性弧菌菌液到勻漿液中, 采用FTA基因組采集卡直接提取牡蠣樣品中的副溶血性弧菌基因組進(jìn)行 CPA擴(kuò)增。

DNA提取: 取10mL勻漿液以500×g離心10min,轉(zhuǎn)移上清液于另一滅菌后的離心管中 14000×g離心10min, 沉淀用 500μL生理鹽水懸浮, 加入0.25倍體積的乙酸乙酯, 振蕩器混勻2min, 然后17000×g離心10min。棄去上清液, 沉淀用20μL生理鹽水懸浮, 加入直徑為2.00mm FTA濾膜片, 然后56°C干燥, 干燥后的FTA濾膜片, 加入10% SDS 200μL煮沸10min,用FTA專用緩沖液洗滌2次, 然后再用TE緩沖液洗滌 2次, 56°C干燥后可直接作為 CPA擴(kuò)增模板(Lampelet al, 2004)。

2 結(jié)果與分析

2.1 副溶血性弧菌tlh基因片段陽(yáng)性克隆質(zhì)粒的構(gòu)建及驗(yàn)證

用引物 VPOF/VPOR對(duì)副溶血性弧菌基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增, 對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行回收純化, 通過(guò)構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析。結(jié)果表明, 該擴(kuò)增片段的大小約為407 bp, 與目的序列一致(圖1),是副溶血性弧菌tlh的特異性序列, 可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 重組質(zhì)粒PMD19-T-tlh瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of pMD19-T-tlh recombinant plasmid

2.2 CPA擴(kuò)增反應(yīng)體系的優(yōu)化結(jié)果

CPA擴(kuò)增受諸多因素的影響, 如Mg2+、dNTPs、甜菜堿、Bst DNA polymerase、反應(yīng)溫度及反應(yīng)時(shí)間等。為了實(shí)現(xiàn)該方法對(duì)副溶血性弧菌的高效檢出, 本研究通過(guò)各個(gè)因素的優(yōu)化, 得到最佳反應(yīng)體系。

Mg2+是Bst DNA polymerase重要的活性因子, 其濃度對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量和擴(kuò)增特異性有很大的影響。若Mg2+濃度過(guò)低會(huì)直接影響B(tài)st DNA polymerase的活性, 從而使CPA擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量減少, 以致于出現(xiàn)假陰性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較不同 Mg2+添加濃度對(duì)擴(kuò)增效果的影響, 確定最佳Mg2+使用濃度, 結(jié)果如圖2所示。當(dāng)Mg2+濃度為1.0mmol/L時(shí), 未出現(xiàn)梯形電泳條帶; 當(dāng)Mg2+濃度為1.5mmol/L時(shí), 開始出現(xiàn)梯形電泳條帶; 當(dāng) Mg2+濃度為 4.0mmol/L時(shí), 條帶最亮; 當(dāng)Mg2+濃度為4.5mmol/L時(shí), 條帶開始變暗。所以得出最佳Mg2+使用濃度為4.0mmol/L。

圖2 Mg2+濃度的優(yōu)化結(jié)果Fig.2 Results of the optimal concentration of Mg2+

在確定最佳 Mg2+的反應(yīng)體系中添加不同濃度的dNTPs, 比較不同dNTPs濃度下產(chǎn)物的擴(kuò)增效果。結(jié)果如圖3所示, dNTPs的使用濃度在0.1—0.8mmol/L范圍內(nèi)均能發(fā)生有效擴(kuò)增, 當(dāng) dNTPs的添加量為0.4mmol/L時(shí), 梯形電泳條帶最亮, 擴(kuò)增產(chǎn)物最多,為最佳使用濃度。

圖3 dNTPs濃度的優(yōu)化結(jié)果圖Fig.3 Results of the optimal concentration of dNTPs

甜菜堿能使雙鏈 DNA處于不穩(wěn)定狀態(tài), 從而有利于維持反應(yīng)體系的平衡, 提高 CPA反應(yīng)的擴(kuò)增效率。比較不同甜菜堿使用濃度對(duì)擴(kuò)增效果的影響, 結(jié)果如圖4所示, 在甜菜堿的使用濃度為0.2—1.6mol/L時(shí)均出現(xiàn)較為清晰的梯形電泳條帶, 且隨著甜菜堿濃度的增大, 條帶亮度增大。當(dāng)甜菜堿的使用濃度為0.8mol/L時(shí)條帶最亮, 當(dāng)超過(guò)這個(gè)使用濃度時(shí)條帶逐漸變暗。即甜菜堿的最佳使用濃度為0.8mol/L。

圖4 甜菜堿濃度的優(yōu)化結(jié)果圖Fig.4 Results of the optimal concentration of betaine

Bst DNA polymerase作為催化CPA擴(kuò)增最重要的因素, 其使用濃度的高低對(duì) CPA反應(yīng)有較顯著的影響。比較不同Bst DNA polymerase使用濃度對(duì)擴(kuò)增效果的影響。結(jié)果如圖 5所示, 在 Bst DNA polymerase的使用濃度為3.2 U時(shí)開始出現(xiàn)梯形電泳條帶, 且隨著Bst DNA polymerase濃度的增大, 條帶亮度增大。當(dāng)Bst DNA polymerase的使用濃度為8.0 U和9.6 U時(shí)最亮, 且兩者亮度相當(dāng), 但是鑒于成本的考慮, 選取 Bst DNA polymerase的最佳使用濃度為8.0 U。

圖5 Bst DNA polymerase濃度的優(yōu)化結(jié)果圖Fig.5 Results of the optimal concentration of Bst DNA polymerase

反應(yīng)溫度也是影響 CPA擴(kuò)增反應(yīng)能否成功的關(guān)鍵因素, 分別在 57、59、61、63、65、67°C 溫度下進(jìn)行CPA擴(kuò)增, 擴(kuò)增結(jié)果如圖6所示: 當(dāng)溫度為57°C時(shí), CPA反應(yīng)不能發(fā)生, 當(dāng)溫度為59°C時(shí), 出現(xiàn)擴(kuò)增條帶但擴(kuò)增條帶不明顯。當(dāng)溫度為61°C擴(kuò)增反應(yīng)出現(xiàn)較為明顯的梯形電泳條帶, 當(dāng)溫度達(dá)到 63°C條帶最亮, 而當(dāng)溫度高于63°C時(shí), 擴(kuò)增條帶變暗, 說(shuō)明適合CPA擴(kuò)增的最佳反應(yīng)溫度為63°C。

圖6 反應(yīng)溫度的優(yōu)化結(jié)果圖Fig.6 Results of the optimal reaction temperature

分別在 15、30、45、60、75、90 min不同時(shí)間段下進(jìn)行CPA擴(kuò)增, 擴(kuò)增結(jié)果如圖7所示: 當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為15 min、30 min時(shí)CPA反應(yīng)均不能發(fā)生。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為45 min, 出現(xiàn)擴(kuò)增條帶但擴(kuò)增條帶比較暗。當(dāng)擴(kuò)增時(shí)間為 60 min時(shí)梯形電泳條帶最亮, 當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)60 min后條帶逐漸變暗, 說(shuō)明CPA擴(kuò)增的最佳反應(yīng)時(shí)間為60 min。

圖7 反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果圖Fig.7 Results of the optimal reaction time

2.3 副溶血性弧菌CPA法特異性驗(yàn)證

以霍亂弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、河流弧菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等作為參照菌株, 分別提取參照菌和目標(biāo)菌基因組。以無(wú)菌水代替基因組模板作為陰性對(duì)照, 用相同的反應(yīng)體系(除模板不同)進(jìn)行CPA擴(kuò)增, 擴(kuò)增結(jié)果用瓊脂糖電泳法和試紙條法同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖8所示, 在上述條件下只有以副溶血性弧菌基因組DNA為模板的CPA反應(yīng)發(fā)生了有效的擴(kuò)增, 其它對(duì)照組和陰性組均未出現(xiàn)有效擴(kuò)增。說(shuō)明 CPA擴(kuò)增體系對(duì)于副溶血性弧菌進(jìn)行擴(kuò)增的特異性較強(qiáng)。

2.4 CPA法與常規(guī)PCR法檢測(cè)副溶血性弧菌靈敏度的比較結(jié)果

為了比較CPA法和PCR法檢測(cè)副溶血性弧菌純培養(yǎng)物的靈敏度, 將濃縮(經(jīng)平板菌落計(jì)數(shù))的副溶血性弧菌菌懸液稀釋至不同濃度, 最終加入每反應(yīng)管的濃度分為 5.8×106、5.8×105、5.8×104、5.8×103、5.8×102、5.8×101和 5.8 cfu/mL, 平行做 CPA 與 PCR檢測(cè)靈敏度實(shí)驗(yàn)。CPA擴(kuò)增產(chǎn)物同時(shí)采用電泳檢測(cè)法和核酸試紙條檢測(cè)法兩種方法同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9所示, 凝膠電泳法檢測(cè)結(jié)果顯示, 當(dāng)反應(yīng)管中模板濃度大于等于 5.8 cfu/mL時(shí)均出現(xiàn)梯形電泳條帶(圖 9a)。CPA產(chǎn)物核酸試紙條法檢測(cè)結(jié)果顯示,當(dāng)反應(yīng)體系中模板濃度大于等于 5.8×101cfu/mL時(shí),試紙條質(zhì)控線和檢測(cè)線均呈紅色, 說(shuō)明在此濃度范圍內(nèi) CPA-核酸試紙條法能有效的將待檢物進(jìn)行有效的檢出, 當(dāng)模板濃度低于5.8×101cfu/mL時(shí), 試紙條只有質(zhì)控線出現(xiàn)紅色條帶, 即檢測(cè)結(jié)果呈陰性(圖9b)。常規(guī) PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示, 當(dāng)反應(yīng)體系中模板濃度大于等于5.8×102cfu/mL時(shí), 均可見(jiàn)特異性目的電泳條帶, 而當(dāng)檢測(cè)濃度小于 5.8×102cfu/mL時(shí), 未能出現(xiàn)特異性電泳條帶(圖9c)。說(shuō)明PCR 法檢測(cè)副溶血性弧菌最低檢測(cè)限為 5.8×102cfu/mL, 與CPA法相比, CPA法的檢測(cè)靈敏度為普通PCR法的10倍。

圖8 CPA擴(kuò)增反應(yīng)特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.8 The results of CPA specificity tests

圖9 CPA和PCR方法測(cè)副溶血性弧菌純培養(yǎng)物的靈敏度結(jié)果Fig.9 Detection limit of CPA and PCR for V. parahaemolyticus in pure cultures

2.5 CPA法檢測(cè)牡蠣樣品中副溶血性弧菌靈敏度結(jié)果

如1.2.7所述方法直接利用FTA濾膜提取牡蠣樣品中副溶血性弧菌的基因組, 采用 CPA法對(duì)模板進(jìn)行擴(kuò)增, 最后結(jié)合核酸試紙條檢測(cè)人工污染牡蠣樣品中的副溶血性弧菌, 該方法的檢測(cè)限達(dá)到1.3×102cfu/25g (5.2 cfu/g)(圖 10)。

3 討論

圖10 CPA-核酸試紙條法檢測(cè)污染牡蠣樣品中副溶血性弧菌靈敏度Fig.10 Detection limit of CPA-nucleic acid strip for V.parahaemolyticus in contaminated oysters samples

本研究針對(duì)副溶血性弧菌種特異性基因tlh保守區(qū)域設(shè)計(jì)一系列引物進(jìn)行擴(kuò)增, 副溶血性弧菌分為致病菌株和非致病菌株, 致病株除了有 tlh基因外一般還攜帶有tdh和/或trh基因, 而非致病株一般不攜帶tdh和trh基因但擁有tlh基因, 除此之外, 其它菌包括其它弧菌均不擁有此基因, 因此選取 tlh基因作為副溶血性弧菌檢測(cè)的靶基因特異性更強(qiáng)(Horisaka et al, 2004; Yang et al, 2014)。

在反應(yīng)體系的建立過(guò)程中, 通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系中多個(gè)因素和反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化并對(duì)優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn), 較高檢測(cè)靈敏度的實(shí)現(xiàn)不單單受一方面因素的影響, 是多個(gè)因素共同作用的結(jié)果, 只有在最佳反應(yīng)體系下進(jìn)行 CPA擴(kuò)增才能實(shí)現(xiàn)較高的檢出率,即較高的靈敏度(Huang et al, 2014; Ou et al, 2014)。影響CPA擴(kuò)增效果的因子有Mg2+、dNTPs、甜菜堿、Bst DNA polymerase濃度、反應(yīng)溫度及反應(yīng)時(shí)間。其中Mg2+是Bst DNA polymerase的重要活性因子, 其濃度對(duì) CPA擴(kuò)增結(jié)果影響較大, 因此, 首先對(duì) Mg2＋進(jìn)行優(yōu)化。與普通PCR相比, CPA擴(kuò)增需要更高濃度的dNTPs, dNTPs的濃度與CPA擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量呈正相關(guān)。選擇合適濃度的 dNTPs濃度能實(shí)現(xiàn)最大量的產(chǎn)物擴(kuò)增效果, 間接提高檢測(cè)靈敏度。Bst DNA polymerase作為催化CPA擴(kuò)增最重要的因素, 其使用濃度的高低對(duì) CPA反應(yīng)有較顯著的影響。Bst DNA polymerase直接影響CPA產(chǎn)物的產(chǎn)量, 當(dāng)反應(yīng)體系中Bst DNA polymerase濃度過(guò)低時(shí), 反應(yīng)無(wú)法進(jìn)行。增加Bst DNA polymerase的濃度, 反應(yīng)產(chǎn)物量也隨之增加。本研究從提高實(shí)驗(yàn)效率并節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本的角度出發(fā), 選擇該酶的使用量即在保證高效擴(kuò)增的前提下最小添加量?；谧罴逊磻?yīng)體系, 并結(jié)合一對(duì)特異性探針, 本研究成功建立了副溶血性弧菌的 CPA-核酸試紙條法。該方法靈敏度高, 對(duì)于細(xì)菌純培養(yǎng)物和檢測(cè)限為 58 cfu/mL, 對(duì)污染牡蠣中副溶血性弧菌的檢測(cè)靈敏度為5.2 cfu/g, 在檢測(cè)靈敏度上是普通PCR的10倍。特異性實(shí)驗(yàn)證實(shí), 該方法僅對(duì)副溶血性弧菌實(shí)現(xiàn)特異性檢測(cè)。此外, 該方法操作簡(jiǎn)便, 無(wú)需特殊儀器設(shè)備, 實(shí)現(xiàn)了結(jié)果的可視化且存儲(chǔ)方便, 整個(gè)檢測(cè)過(guò)程只需75 min。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)操作人員的技術(shù)要求不高, 稍加培訓(xùn)即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作, 且人為因素造成的誤差和污染較小, 因此易于普及, 是一種特異、靈敏、簡(jiǎn)便、快速的副溶血性弧菌的檢測(cè)方法。

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